著者は原稿の改訂のための彼の技術サポートのために、とレイチェルKopecにトーマスMisonに感謝しています。

1.細菌培養<ol><li> LB寒天培地のプレートの表面上に、LB（ルリア-ベルターニ培地）中で30℃でインキュベート株の一晩培養物100μlを広げることによって菌（ バチルス・セレウス菌株 ATCC 14579）の芝生を準備します。 30℃で一晩プレートをインキュベートします。 </li></ol> 2. ECL：等価チェーンの長さ<ol><li>次のようにECLを計算します。 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/54960/54960eq1.jpg" />と： 私、興味のある溶質; nは、溶質の前に溶出し、直鎖飽和脂肪酸メチルエステルの炭素数I。 N + 1、溶質の後に溶出する直鎖飽和脂肪酸メチルエステルの炭素数I。 RTI、RTN、RT（N + 1）上述のFAMEピークの保持時間。 注：（標準の混合物を注入することにより直鎖飽和脂肪酸メチルエステルの保持時間を得るBAME）。 </li></ol> 3. FAMEの調製および分析<ol><li>脂質の脂肪酸を得るために、寒天プレートからコロニーを掻き取りにより採取細菌細胞とスクリューキャップとPTFEシールを有する10mlのガラス管に細菌を40mg（10 9の生存細胞に相当する新鮮重量）移します。 </li><li>以下に詳述エステル結合方法14,15を経由してエステル交換反応を行います。 <ol><li>新鮮な細菌細胞にメタノール中0.2M KOHの5ミリリットルを加え、37℃で1時間インキュベートします。この反応は、脂質中のエステル結合を破壊し、脂肪酸メチルエステルを生成する、アルカリ性メタノリシスから成ります。 </li><li> pHを7.0に低下させるために1 M酢酸を1ml加えます。 pH試験片を用いてpHを確認してください。 </li><li> FAMEを抽出するためにヘキサンの3ミリリットルを追加します。 </li><li>約200μLを得るために、きれいなチューブに上清（有機相）を移し、窒素の連続気流下、室温で蒸発させることによって集中します抽出物。インサート付きGCバイアルにサンプルを転送します。 </li><li>ガスクロマトグラフィー - 質量分析（GC-MS）システムに抽出物を注入します。 </li></ol></li></ol> 4. GC / MS条件<ol><li>キャピラリカラムZB-WAX（;直径0.25mmで、膜厚0.25μmの長さ30メートル）を備えたGC-MS機器にFAMEサンプルを注入します。 </li><li> （スプリットレスモードでの）注入口250°Cまで温度を設定します。 37センチメートル/秒の線速度で、キャリアガスとしてヘリウムを使用してください。 20℃/分の速度で190℃まで上昇し、2℃/分の速度で230℃の最終温度までさらに増加、1分間50℃のオーブン温度を保持します。 </li><li> MSについては、70 eVでの電子イオン化（EI）の質量スペクトルを記録し、50〜400原子質量単位（AMU）（2スキャン/秒）の間の総イオン電流の取得を設定します。 </li><li>必要な場合には、同じ条件EXCEP下DMOXとピコリニル誘導体を注入次のように温度プログラムオーブンT： DMOX：50℃（1分）、20℃/分で210℃から2℃/分まで、240°C（5分）まで。 ピコリニル：6°C（1分）、220℃まで20℃/分で250℃（20分）まで2℃/分。 </li></ol> FAME 16から5ピコリニルエステル準備<ol><li>窒素の流れ（少なくとも10mgの乾燥物質）と第3のFAME抽出物を蒸発させ、乾燥ジクロロメタン1ml中に溶解します。 </li><li>テトラヒドロフラン中のカリウムターt-ブトキシドの1.0M溶液を準備します。 </li><li>ステップ5.2で作られた溶液0.1 mlにFAMEエキス、0.2ミリリットル3ピリジンメタノールを追加します。 </li><li>密閉バイアル中で30分間、40°Cで溶液を加熱します。 </li><li>室温に冷却した後、精製された脱イオン水（2mL、 材料表を参照）、ヘキサン（4 ml）を加えます。相を分離させ、ボルテックスで混合し、有機相を収集します。 </li><li>博士Yその有機相が完全に透明になるまで無水硫酸ナトリウムを添加することによって。きれいなチューブにそれを転送します。その後、200μlに蒸発させます。インサート付きGCバイアルにサンプルを転送します。 </li></ol> FAME 17から6 DMOX準備<ol><li>窒素（少なくとも10mgの乾燥材料）の流れと第3のFAME抽出物を蒸発させます。 </li><li> FAME乾燥抽出物を、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノールの250ミリグラムを加えます。 、窒素で容器をフラッシュストッパーを追加し、190℃で一晩加熱ブロックに配置します。 </li><li>室温まで冷却した後、精製された脱イオン水を試験管に3ミリリットルのジクロロメタンを追加し、5ミリリットル（ 材料表を参照してください）。 </li><li>相分離のためにシェイクした後、水相を除去します。 </li><li> 5ミリリットルの水で有機相を洗浄します。相分離のためにシェイクした後、水相を除去します。 </li><li>有機相が完全に明確であるとまでは無水硫酸ナトリウムを添加することによって、乾燥きれいなチューブにそれを転送します。 200μlの容量に達するまで、窒素気流下で蒸発させます。インサート付きGCバイアルにサンプルを転送します。 </li></ol>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

表1に示したのFAクロマトグラムプロファイルは、寒天プレートの表面上に成長させたB.セレウス ATCC 14579に対応します。細菌が同じ温度8で通気し、液体培地中で増殖させた場合にも同様のプロファイルが得られました。液体培地中で増殖させた細菌の場合には、細菌バイオマスの増殖培地の遠心分離によって回収し、成長条件8,19によって以前に記載されたプロトコルに従って洗浄することができます。 B.セレウスによって生成種々のFAの同定は、低温7,9における成長のために必要ないくつかの遺伝子の変異した株で検出されるのFAの割合の微細な変化を可能にしました。 通常、ECLを（等温温度制御を有する炉を使用して）一定の温度20で決定された調整後の保持時間のログ値を使用して計算されます。ここでは、理由pまでの非等温オーブンの使用関心のFAMEの最適化された分離をermit、計算方法は、以前に線形保持指標3,21について説明したものを使用します。 この研究の目的は、文献に記載されたものと計算されたECLの値を比較するために、これらの保存データとスペクトル情報に基づいて、同一のクロマトグラムプロファイル内、FAの構造を予測することはなかったです。同等の直鎖FAに比べて確かに、飽和のFAのために、与えられた分岐（イソまたはアンテイソ）は常に、ECLで同様のシフトを引き起こします。また、本研究で計算されたECLは、同等の極性のカラム上ストランスキー22によって測定された値と一致しました。以前に報告された値を持つこの同意は、ECL値は、このように、または他の株の他の条件で成長させたセレウス菌のFAのクロマトグラムプロファイル（ 例えば 、変異体） セレウス菌の由来のピークの迅速な同定のために非常に有用であることを示しています。 <p<html>クラス= &quot;jove_content&quot;&gt;ピコリニル誘導体は、より長い保持時間を示したが、試験した他の誘導体に比べて低い信号/ノイズ比。以前の報告は、その溶出は4より困難であることを示唆しています。低フィルム厚を有するカラム、 およびBacillus種が、18未満の炭素とのFAが含まれているという事実の使用は、高品質のGC-MSクロマトグラムを生成するために、同じ極性のクロマトグラフィーカラムを使用することを可能にするようです3デリバティブの。 二重結合の位置をより容易DMOX誘導体が割り当てられている間にピコリニル誘導体は、DMOX誘導体によって生成されたイオンよりも分岐位置を示す複数の特徴的なイオンを提供します。本研究は、これまで不十分文献に記載されているB.セレウスからのメチル分枝鎖の不飽和のFAを識別するために、両方の誘導体からの情報を組み合わせての有用性を示しています。 jove_contentは &quot;&gt;提案されたアプローチは、2日以内に完了することができます。比較として、NMR分光法のために、各FAは仕事と生物学的材料の大量の数週間を表し、精製されるべきである。しかし、このアプローチは、（ジオメトリを区別しません二重結合の）シス、トランス。一旦各FAが同定され、それらは日常的菌株および変異体を比較するために、または増殖条件の影響を研究するために、 例えば、それらのFAME誘導体によって定量することができる。我々の手では、ほとんどとして8mgのよう新鮮な細菌細胞の細菌を成長させることが困難に適用可能な方法を作るのFAの定量化のために十分であった。同定されたのFAのそれぞれについて定量限界GC / MSに注入した溶液の1 ngの/μlです。

脂肪酸メチルエステル（FAME）、ガスクロマトグラフィー（GC）は、脂質の特性評価に不可欠な方法です。それは急速に分離し、短い抽出工程後の試料の様々な脂肪酸（FAS）を定量化します。メチルエステルの誘導体は、クロマトグラフィーカラムに向かって高度に揮発性の安定かつ不活性であり、それによってテーリングピークを回避します。クロマトグラフィーのプロファイルはいずれかの公開や標準に比較されるため、サンプルは、周知のFAで構成されている場合、それらの識別はかなり簡単です。加えて、様々なのFAの定量化のための較正標準の反復注射は、炎イオン化検出器（FID）1へのほぼ一定の応答を考えると、必要とされません。 FIDに加えて、質量分析（MS）検出のFAMEを確認するために情報の補完的なセットを提供します。 FAMEは、電子イオン化（EI）を使用して充電されたときしかし、得られるスペクトルは、常に目のために許可されていませんFA微細構造の電子識別。診断イオンが1を検出することが困難であり、ターゲットイオン存在量の特性変化は、質量スペクトルライブラリー2を使用することを防止する、機械に依存するので、例えば、位置分岐（ すなわち、分岐したメチル基）を予測することは困難です。もう一つの課題は、EIは、二重結合の移動が発生するため、二重結合の位置を特定することにあります。このように、二重結合の位置を変化させたFA異性体は、その質量スペクトルによって区別することはできません。幸いなことに、他のツールは、FAの同定のために開発されています。例えば、存在およびFASにおける二重結合のまたは分岐の位置は、等価な鎖長（ECL）3を計算することによって推測することができます。 他の誘導体化方法は、二重結合または分枝鎖のメチル基の位置に依存する異なる質量スペクトルをもたらします。 4,4-ジメチルオキサゾリン誘導体（DMOX）4 EASを可能に一価不飽和脂肪酸の二重結合の位置のyの識別。 3-pyridylcarbinylエステル（ピコリニルエステル）誘導体は、Fas 5分枝鎖メチルの場所の明確な同定を可能にします。核磁気共鳴（NMR）スペクトルは、構造的特徴1争う余地のない方法の必要に応じて、精製の複雑な方法を使用することなく、クロマトグラフィーの保持（ECL）および質量スペクトル（DMOXとピコリニル）情報は、ほとんどのFAの同定を可能にする合成。 いくつかのヒトおよび動物の病原体を含むバチルス属の細菌は、非常に多様なニッチにコロニーを形成することが可能であるため、広く環境6に分布しています。 バチルス属の中でも、FA組成物は、環境の変化（ 例えば 、増殖培地、温度の広い範囲に適応するためにFAパターンの変調を有する種の生態的地位に影響されますpHは、 等 ）7-9。そのため標準化された条件で成長中のバチルス属の種間FAパターンの相対的な均質性、FA組成物の決意は、 バチルス種を定義するために使用される本質的な基準の一つです。 バチルス属のユニークな属性は、ISOおよび環境条件への適応の重要な決定要因であることアンテイソ異性体間の比で12-17個の炭素10-12を含む分岐鎖のFAの豊富さです。 バチルス種はまた、不飽和脂肪酸の比率を変えることにより、環境変動に適応します。このようなセレウス菌などのいくつかの種では、2脂肪酸デサチュラーゼは、適応9で異なる役割を持つアルキル鎖13の異なる位置に二重結合を作成します。 バチルス属の例は、正確に二重結合の位置を識別し、FAは、分岐の重要性を示しています。収集しますively、 バチルス FAパターンの同定は、いくつかの有用な用途を有します。ここで、我々は、古典的なGC-MS分析の固有の限界を克服するバチルス FAパターン識別のための新規なGC-MSの方法を提案します。 この革新的なアプローチは、生の生物学的物質に直接使用し、既存の技術の組み合わせで構成することができます。保持時間（ECL）の情報と異なるのFA誘導体（FAME、DMOXとピコリ - エステル）の質量スペクトル。 当社は、以下のFA命名法を使用しています。 I、およびnは、それぞれISO、アンテイソメチル分枝、直鎖脂肪酸を示します。不飽和のFAは、Cによって指定された：Cであり、Dは、脂肪酸およびD中の炭素原子の数は、二重結合の数です。 Δxは 、二重結合は、カルボン酸末端から数えて、x番目の炭素-炭素結合上に位置する二重結合の位置を示しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>GC/MS</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>QP2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>capillary column ZB WAX</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>7HG-G007-11</td>
			<td>30m x 0.25mm x 0.25&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol Lichrosolv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.06018.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THF</td>
			<td>Hipersolv Chromanorm</td>
			<td>28559.320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Hipersolv Chromanorm</td>
			<td>23373.320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Hipersolv Chromanorm</td>
			<td>24575.320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-pyridinemethanol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>P6-680-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium tertiobutoxide</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>156671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-amino-2-methyl-1-propanol</td>
			<td></td>
			<td>A-9879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Academic</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZMQS50001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47080-U Supelco</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of fatty acids in bacillus cereus

バチルス種は、メチル分岐（イソまたはアンテイソ）の二重結合の多様な位置で分枝鎖不飽和脂肪酸（FAS）を含みます。 FA組成の変化は、環境への細菌の適応において重要な役割を果たしています。これらの変更は、イソ対アンテイソの比率の変化を伴う特定の位置に作成された二重結合を有する、FAの分枝、飽和のFAへの不飽和のFAの割合インチFAプロファイルの正確な同定は、 バチルス種の適応メカニズムを理解する必要があります。 バチルスからのFAの多くは市販されていません。脂肪酸メチルエステル（FAME）、4,4-ジメチルオキサゾリン：本明細書で提案された戦略は、FA誘導体の3種類の質量スペクトルと保持時間（等価な鎖長（ECL）の計算によって）情報を組み合わせてのFAを識別するデリバティブ（DMOX）、および3 pyridylcarbinylエステル（ピコリニル）。この方法は、未知のFAを精製する必要なしのFAを識別することができます。 標準の商業用混合物とセレウス菌から調製したFAMEのクロマトグラフィープロファイルを比較すると、他のFAのアイデンティティにするFA、ECLの計算、および仮説を飽和直鎖の同定を可能にします。分岐飽和のFA、イソまたはアンテイソのFAMEを、同じ数の炭素を有する直鎖飽和のFAに比べECLに一定の負のシフトを、表示します。不飽和のFAのFAMEをその分子イオンの質量によって検出され、対応する飽和のFAに比べECLにおける正のシフトをもたらすことができます。 FAの分岐位置及び不飽和のFAの二重結合の位置は、それぞれ、ピコリニルとDMOX誘導体の電子イオン化マススペクトルによって同定することができます。このアプローチは、すべての未知飽和の分岐を識別するEDのFA、不飽和直鎖状のFAおよびセレウス菌の抽出物から不飽和分枝状のFA。

細菌細胞からFA特定の戦略は、図1に示されています。各ステップは、補完的なスペクトル情報またはクロマトグラフィー保持に関する情報を提供します。ステップ1は、標準液を用いた予備FA識別で構成されています。ステップ2は、暫定的に製品を識別するために、FAME EIスペクトルとそのECLの解釈を可能にします。ステップ3は、分岐鎖-のFAで正確な分岐位置を特定します。最後に、ステップ4は、不飽和のFA中の二重結合の正確な位置を特定します。 FAMEとECL BAME混合物は、私たちは、直鎖飽和脂肪酸（N17でN12）のシリーズを識別することができ、いくつかのメチル脂肪酸（I15、A15、I16、I17）を分枝状。しかし、 セレウス菌に特有の非常に少数のFAはdeveloを正当化する、私たちのサンプルで検出されました識別方法のpmentについては後述しました。 かかわらず、鎖の長さの、相同シリーズの飽和のFA（イソまたはアンテイソ）を分枝鎖（ すなわち 、同じ一般式を有する化合物の一連の）ストレート飽和FAはその中の炭素の数が同じに比べECLの定数シフトを表示炭素鎖を意味します。分数の鎖長（FCL）と呼ばれるこのシフトは、相同シリーズでのFAの同定を可能にします。 （接頭辞「A」と表記）アンテイソのFAは-0.33のFCLを持っていながら、例えば、（接頭辞の &quot;i&quot;と表記）は、ISO-のFAは、-0.48のFCL値を持っています。それぞれ、それぞれ、13.52と12.52のECLとI14とI13を識別するために、次に容易であり、12.67と14.66のECLとA13とA15。 FAのそれぞれについて、 表1のディスプレイのECLは、我々のサンプルで検出されました。保持時間を予測します一緒MSスペクトルとのFAMEを用いて得られたイソ及びアンテイソシリーズのedは、私たちは私たちのサンプルから分岐鎖-FAの全てを同定することを可能にしました。この段階でこのような同定は暫定的であったが、後ピコリのFA誘導体から得られたEIスペクトルにより確認しました。 その分子イオンの質量によって示されるように、ISOまたはアンテイソシフトに対応していないのECLでのFAMEは、不飽和の直鎖又は分枝鎖のFAです。対応する飽和FAと比較して不飽和のFAは、ECLで正のシフトを示しています。分枝状のFA用ピコリ誘導体からのスペクトルと合わせDMOX誘導体、からのスペクトルは、二重結合の位置の同定を可能にします。 図中3の誘導体の混合物（ すなわち、FAME、DMOXとピコリニル）について示されるように、このような誘導体化法は、溶出順序が保持されるだけFA識別に適しています1のFA：16、いくつかのために2。このアプローチは、FAの構造を同定するために組み合わせることができる3誘導体化法を使用して一つのピークの相補的なスペクトル情報の収集を可能にします。保持時間とオーブンの温度は異なっていたが、溶出順序における差異は、3デリバティブの間で観察されませんでした。 ISOとアンテイソメチル分枝鎖の飽和脂肪酸のピコリニルエステル EIによって得られたスペクトルは、メチル分岐鎖のFAが存在することを確認します。実際、分子イオンは、飽和のFAに対応したm / zを持っています。我々は、置換された炭素原子に対応するイオンが不足している分岐点の領域を除いてメチレン基の喪失に対応する14質量単位（AMU）のギャップを有するイオンシリーズを観察しました。私たちは、それ以前に作成された断片に対応する二つのイオン間の28 AMUのギャップを観察し、分枝状の炭素ました。 図3は、分岐位置を示す診断イオン（304と332）とI16のスペクトルを示します。 直鎖不飽和脂肪酸のDMOX 1脂肪酸： 図2は 16に関連付けられている5異なるピークを示します。最初の2つのピークはECL値&lt;16を有しています。私たちは、それらの構造は確かに分岐していると結論付けています。これらの化合物の同定はDMOXとピコリニルエステル誘導体によって生成質量スペクトルの解釈を必要とします。 ECL&gt; 16試合を有する三つのピークは、直鎖脂肪酸をモノ不飽和しました。 DMOX誘導体の質量スペクトルは、これらの化合物の二重結合の位置を特定する診断イオンを示します。 図4において、我々は、N16の炭素8との二重結合の存在を示す196と208の間に12 amuのイオンのギャップを見ることができます：1Δ <suP&gt; 8脂肪酸、張18によって定義される脂肪鎖中の二重結合の位置のための経験則に従いました。二重結合の位置は、炭素7の前にあるときは、診断イオンが異なります。例えば、張18とフェイ17 /カーボン5に不飽和二重結合を有するFAのために、二重結合、のm / z 152での切断から誘導された娘イオンは、メートルで強烈奇数娘を伴っていることが観察され1Δ5： 図5では、Z 153、強烈なのm / z 153のフラグメントのとのm / z 307の分子イオンの存在は、N16としてこの化合物を同定します。 メチル分枝鎖のDMOXとピコリニル質量スペクトルは、脂肪酸をmonounsatured 1Δ9 FA： 図6は、I16の構造を決定するために使用DMOXのスペクトルとピコリニルエステル誘導体を、提示します。の位置分岐は、両方のデリバティブの28 AMUのギャップによって示されています。 図6に示すように、ピコリニルエステルのための12 DMOXためのAMU及び26のギャップは、二重結合の位置を特定します。 脂肪酸と診断イオンの同定 表1は、30℃で増殖させセレウス菌 ATCC 14579で、対応する診断イオンで、識別された種々の脂肪酸を示しています。これらの診断イオンは補完的な構造情報を提供DMOXとピコリニルエステル誘導体のための炭素鎖上のメチル分岐および二重結合の位置を特定します。診断イオンは時々DMOX誘導体で観察することが容易であり、それ以外のときに簡単ピコリニル誘導体と観察するように、2つのアプローチは、真に相補的です。 <img alt="図1"<html> SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 54960 / 54960fig1.jpg&quot; /&gt; 図1： セレウス菌中の脂肪酸の同定のための戦略。 保持時間（ECL）に、FAMEの質量スペクトル上、DMOXの、およびピコリニルエステルの情報を生成する連続したステップが示されています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54960/54960fig2.jpg" /> 図2： セレウス菌で検出された1脂肪酸：異なる16のためのクロマトグラフィープロファイルの比較。 （A）FAME誘導体（のm / z 268で抽出された分子イオン）; （B）DMOX誘導体（分子イオンをm / zの307で抽出されました）。 （C）ピコリ誘導体（のm / z 345で抽出された分子イオン）。ジル/ ftp_upload / 54960 / 54960fig2large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54960/54960fig3.jpg" /> 図3：電子イオン化によって生成されたI16ピコリ派生質量スペクトル。 m / z 151およびm / zの164でのイオンは、脂肪酸の存在ピコリニル誘導体を示します。 m / z 347での分子イオンは、パルミチン酸の異性体であると同定されます。 m / z 304およびm / zにおけるイオンと28 AMUのギャップの存在は、332は、I16を示しています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54960/54960fig4.jpg" /> 図4：N16：電子によって生成された1Δ8 DMOX派生質量スペクトルイオン化。 1 DMOXとのm / z 196でのイオン間の12 amuでのギャップの存在とのm / z 208の位置を識別した：m / z 126のイオンは、m / zの307は16の分子イオンである、DMOX誘導体を示し、炭素8.上の二重結合から<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54960/54960fig5.jpg" /> 図5：N16：電子イオン化によって生成された1Δ5 DMOX派生質量スペクトル。 1 DMOX：mにおけるイオン/ Z 126は、z 307は16の分子イオンである/ DMOX誘導体およびメートルの指標です。激しいのm / z 153のイオンは、炭素5上に位置する二重結合の特性である<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig5large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図6：DMOX（上）とピコリ（下）I16の比較：1Δ9スペクトル 。 両方の場合において28 AMUのギャップは、メチル分岐の位置を示します。二重結合の位置は、それぞれ、12 AMUとDMOXとピコリニルデリバティブの26 AMUのギャップによって導出することができます。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>推定される化合物</td><td>分子イオン（M / Z）FAME。 DMOX;ピコリニル</td><td> RT </td><td> ECL </td><td>本人確認</td><td>診断イオンDMOX </td><td>診断イオンピコリニル</td></tr><tr><td> I12 </td><td> 214; 253; 291 </td><td>7.93 </td><td>言及しません</td><td> I12 </td><td></td><td> [276（15）、262（0）。 248（15）] MB </td></tr><tr><td> N12 </td><td> 214; 253; 291 </td><td> 8.21 </td><td> 12.00 </td><td> N12 </td><td></td><td> [276（10）、262（20）。 248（20）] MB </td></tr><tr><td> I13 </td><td> 228; 267; 305 </td><td> 8.53 </td><td> 12.5 </td><td> I13 </td><td></td><td> [290（15）、276（0）。 262（48）]メガバイト</td></tr><tr><td> A13 </td><td> 228; 267; 305 </td><td> 8.64 </td><td> 12.67 </td><td> A13 </td><td></td><td> [276（48）、262（0）; 248（65）]メガバイト</td></tr><tr><td> I14 </td><td> 242; 281; 319 </td><td> 9.24 </td><td> 13.52 </td><td> I14 </td><td></td><td> [304（20）。 276（45）290（0）]メガバイト</td></tr><tr><td> N14 </td><td> 242; 281; 319 </td><td> 9.60 </td><td> 14.00 </td><td> N14 </td><td></td><td> [304（7）、290（17）。 276（17）] MB </td></tr><tr><td> I15 </td><td> 256; 295; 333 </td><td> 10.06 </td><td> 14.51 </td><td> I15 </td><td></td><td> [318（20）、314（0）。 290（50）] MB </td></tr><tr><td> A15 </td><td> 256; 295; 333 </td><td> 10.19 </td><td> 14.66 </td><td> A15 </td><td></td><td> [304（30）、290（TR）。 276（62）]メガバイト</td></tr><tr><td> N15 </td><td> 256; 295; 333 </td><td> 10.49 </td><td> 15.00 </td><td> N15 </td><td></td><td> [318（5）; 304（13）。 290（18）] MB </td></tr><tr><td> I16 </td><td> 270; 309; 347 </td><td> 11.04 </td><td> 15.5 </td><td> I16 </td><td></td><td> [332（18）、318（TR）。 304（42）] MB </td></tr><tr><td> 1：メチルは16分枝</td><td> 268; 307; 345 </td><td> 11.19 </td><td> 15.64 </td><td> I16：1Δ5 </td><td> [152（2）、153（10）] DB [292（3）、278（TR）。 264（2）] MB </td><td></td></tr><tr><td> 1：メチルは16分枝</td><td> 268; 307; 345 </td><td>11.40 </td><td> 15.83 </td><td> I16：1Δ9 </td><td> [210（3）、222（3）] DB [292（12）、278（TR）。 264（40）] MB </td><td></td></tr><tr><td> N16 </td><td> 270; 309; 347 </td><td> 11.59 </td><td> 16.00 </td><td> N16 </td><td></td><td> [332（5）; 318（15）。 304（15）] MB </td></tr><tr><td> 16：1 </td><td> 268; 307; 345 </td><td> 11.78 </td><td> 16.14 </td><td> N16：1Δ5 </td><td> [152（2）、153（10）] DB </td><td></td></tr><tr><td> 16：1 </td><td> 268; 307; 345 </td><td> 11.94 </td><td> 16.24 </td><td> N16：1Δ8 </td><td> [196（5）; 208（3）] DB </td><td></td></tr><tr><td> 16：1 </td><td> 268; 307; 345 </td><td> 12.00 </td><td> 16.31 </td><td> N16：1Δ9 </td><td> [210（3）、222（3）]デシベル</td><td></td></tr><tr><td> 16：2 </td><td> 266; 305; 343 </td><td> 12.18 </td><td> 16.44 </td><td> N16：2Δ5、Δ9 </td><td> [152（2）、153（12）] DB [208（1）、220（2）] DB </td><td></td></tr><tr><td> I17 </td><td> 284; 323; 361 </td><td> 12.25 </td><td> 16.5 </td><td> I17 </td><td></td><td> [346（20）、332（TR）。 318（35）] MB </td></tr><tr><td> 1：メチルは17分枝</td><td> 282; 321; 359 </td><td> 12.43 </td><td> 16.64 </td><td> I17：1Δ5 </td><td> [152（2）、153（10）] DB </td><td> [344（10）; 316（5）]メガバイト</td></tr><tr><td> A17 </td><td> 284; 323; 361 </td><td> 12.47 </td><td> 16.66 </td><td> A17 </td><td></td><td> [332（30）、318（0）。 304（52）] MB</td></tr><tr><td> 1：メチルは17分枝</td><td> 282; 321; 359 </td><td> 12.57 </td><td> 16.74 </td><td> I17：1Δ8 </td><td> [196（2）、208（2）] DB </td><td> [344（10）; 316（5）]メガバイト</td></tr><tr><td> 1：メチルは17分枝</td><td> 282; 321; 359 </td><td> 12.64 </td><td> 16.79 </td><td> I17：1Δ9 </td><td> [210（3）、222（3）] DB </td><td></td></tr><tr><td> 1：メチルは17分枝</td><td> 282; 321; 359 </td><td> 12.70 </td><td> 16.84 </td><td> I17：1Δ10 </td><td> [224（1）、236（1）] DB </td><td></td></tr><tr><td> 1：メチルは17分枝</td><td> 282; 321; 359 </td><td> 12.84 </td><td> 16.94 </td><td> A17：1Δ9 </td><td> [210（3）、222（4）] DB </td><td> [330（10）、316（0）。 302（90）] MB </td></tr></tbody></table> 表1： バチルス・セレウス ATCC 14579からの脂肪酸の同定 。 脂肪酸メチルエステル（FAME）の保持時間、等価な鎖長（ECL）値、および分子イオンが一緒に分子イオンとDMOXの診断イオンおよびピコリニル誘導体と、示されています。 炭素分岐の前と後の断片に対応する28 AMUの損失を示す[]メガバイト診断イオン対。 []デシベル診断イオン対は、二重結合の切断に対応する12 AMUの損失を示します。

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Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl).

脂肪酸の同定で<em&gt;セレウス菌</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

9.5K ビュー.  INRA, Université d'Avignon. We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl). 

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A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

核酸のポリアニリンベースのセンサ

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

生化学

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis is an obligate pathogen that causes fatal inhalational anthrax. Bacillus cereus is considered a useful model for studying B. anthracis due to its close evolutionary relationship. The gene cluster ba1554 - ba1558 of B. anthracis is highly conserved with the bc1531- bc1535 cluster in B. cereus, as well as with the bt1364-bt1368 cluster in Bacillus thuringiensis, indicating the critical role of the associated genes in the Bacillus genus. This manuscript describes methods to prepare and characterize a protein product of the first gene (ba1554) from the gene cluster in B. anthracis using a recombinant protein of its ortholog in B. cereus, bc1531.

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Bacillus anthracis is the obligate pathogen of fatal inhalational anthrax, so studies of its genes and proteins are strictly regulated. An alternative approach is to study orthologous genes. We describe biophysicochemical studies of a B. anthracis ortholog in B. cereus, bc1531, requiring minimal experimental equipment and lacking serious safety concerns.

組換えタンパク質の発現、結晶化、および生物物理学的研究<em&gt;バチルス</em&gt;保有ヌクレオチドピロホスホリラーゼ、BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

電圧クランプ<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;蛍光性の非天然アミノ酸を用いた卵母細胞

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer tissue with minor or no modification, allowing the dietary routing between different trophic levels. However, the FA trophic marker approach is still hampered by the limited knowledge in lipid metabolism of the soil fauna. This study used entirely labelled palmitic acid (13C16:0, 99 atom%) as a tracer in fatty acid metabolism pathways of two widespread soil Collembola, Protaphorura fimata and Heteromurus nitidus. In order to investigate the fate and metabolic modifications of this precursor, a method of isotopologue profiling is presented, performed by mass spectrometry using single ion monitoring. Moreover, the upstream laboratory feeding experiment is described, as well as the extraction and methylation of dominant lipid fractions (neutral lipids, phospholipids) and the related formula and calculations. Isotopologue profiling does not only yield the overall 13C enrichment in fatty acids derived from the 13C labeled precursor but also produces the pattern of isotopologues exceeding the mass of the parent ion (i.e., the FA molecular ion M+) of each labeled FA by one or more mass units (M+1, M+2, M+3, etc.). This knowledge allows conclusions on the ratio of dietary routing of an entirely consumed FA in comparison to de novo biosynthesis. The isotopologue profiling is suggested as a useful tool for evaluation of fatty acid metabolism in soil animals to disentangle trophic interactions.

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

The fatty acid trophic marker approach, i.e., the assimilation of fatty acids as entire molecule and transfer into consumer tissue with no or minor modification, is hampered by knowledge gaps in fatty acid metabolism of small soil invertebrates. Isotopologue profiling is provided as a valuable tool to disentangle trophic interactions.

脂肪酸13C Isotopologue プロファイリング栄養炭素転送および無脊椎動物消費者の脂質代謝への洞察力を提供します。

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences in a structurally similar protein, in order to determine the functional importance of these regions. Such chimeras are generated by means of a nested PCR protocol using overlapping DNA fragments and adequately designed primers, followed by their expression within a mammalian system to ensure native secondary structure and post-translational modifications. 
The functional role of a distinct region is then indicated by a loss of activity of the chimera in an appropriate readout assay. In consequence, regions harboring a set of critical amino acids are identified, which can be further screened by complementary techniques (e.g. site-directed mutagenesis) to increase molecular resolution. Although limited to cases in which a structurally related protein with differing functions can be found, chimeric proteins have been successfully employed to identify critical binding regions in proteins such as cytokines and cytokine receptors. This method is particularly suitable in cases in which the protein's functional regions are not well defined, and constitutes a valuable first step in directed evolution approaches to narrow down the regions of interest and reduce the screening effort involved.

Structurally related proteins frequently exert distinct biological functions. The exchange of equivalent regions of these proteins in order to create chimeric proteins constitutes an innovative approach to identify critical protein regions that are responsible for their functional divergence.

キメラ蛋白質の構築による機能性タンパク質領域の同定

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled antibodies. It is a multistep process in which the optimization of each step is crucial to obtain the optimum specific signal. Through IHC, the distribution and localization of specific biomarkers can be detected, revealing information on evolutionary conservation. Moreover, IHC allows for the understanding of expression and distribution changes of biomarkers in pathological conditions, such as obesity. IHC, mainly the immunofluorescence technique, can be used in adult zebrafish to detect the organization and distribution of phylogenetically conserved molecules, but a standard IHC protocol is not estasblished. Orexin and endocannabinoid are two highly conserved systems involved in the control of food intake and obesity pathology. Reported here are protocols used to obtain information about orexin peptide (OXA), orexin receptor (OX-2R), and cannabinoid receptor (CB1R) localization and distribution in the gut and brain of normal and diet-induced obese (DIO) adult zebrafish models. Also described are methods for immunoperoxidase and double immunofluorescence, as well as preparation of reagents, fixation, paraffin-embedding, and cryoprotection of zebrafish tissue and preparation for an endogenous activity-blocking step and background counterstaining. The complete set of parameters is obtained from previous IHC experiments, through which we have shown how immunofluorescence can help with the understanding of OXs, OX-2R, and CB1R distribution, localization, and conservation of expression in adult zebrafish tissues. The resulting images with highly specific signal intensity led to the confirmation that zebrafish are suitable animal models for immunohistochemical studies of distribution, localization, and evolutionary conservation of specific biomarkers in physiological and pathological conditions. The protocols presented here are recommended for IHC experiments in adult zebrafish.

Presented here are protocols for immunohistochemical characterization and localization of orexin peptide, orexin receptors, and endocannabinoid receptors in the gut and brains of normal and diet-induced obesity (DIO) adult zebrafish models using immunoperixidase and double immunofluorescence methods.

免疫ペルオキシダーゼおよび免疫蛍光法を用いて成体ゼブラフィッシュにおけるオレキシンおよびエンドカンナビノイド受容体の同定

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

核酸プローブを用いたヌクレアーゼ活性の運動スクリーニング

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in liver cancer, the modification by SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) has been given the most attention. Isolation of endogenous SUMOylated proteins in vivo is challenging due to the presence of active SUMO-specific proteases. Initial studies of SUMOylation in vivo were based on the molecular detection of specific SUMOylated proteins (e.g., by western blot). However, in many cases, antibodies, generally made with non-modified recombinant protein, did not immunoprecipitate SUMOylated forms of the protein of interest.&#160;Nickel chromatography has been the other approach to study SUMOylation by capturing histidine-tagged versions of SUMO molecules. This approach is mainly used in cells stably expressing or transiently transfected with His-SUMO molecules. To overcome these limitations, SUMO-binding entities (SUBEs) were developed to isolate endogenous SUMOylated proteins. Herein, we describe all the steps required for the enrichment, isolation, and identification of SUMOylated substrates from human hepatoma cells and hepatic tissues from a liver cancer mouse model by using SUBEs. Firstly, we describe methods involved in the preparation and lysis of the human hepatoma cells and liver tumor tissue samples. Then, a thorough explanation of the preparation of SUBEs and controls is detailed along with the protocol for the protein pull-down assays. Finally, some examples are provided regarding the options available for the identification and characterization of the SUMOylated proteome, namely the use of western-blot analysis for the detection of a specific SUMOylated substrate from liver tumors or the use of proteomics by mass spectrometry for high-throughput characterization of the SUMOylated proteome and interactome in hepatoma cells.

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Here, we present a protocol to enrich, isolate, identify, and characterize proteins modified by SUMO in vivo both from human hepatoma cells and liver tumors obtained from mouse models of hepatocellular carcinoma by using SUMO-binding entities (SUBEs).

肝癌における相撲プロテオームの濃縮、単離、同定、特性評価のためのツールとしての相撲結合エンティティ(SES)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

脂肪酸の同定で

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