LHB는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 동적 셀 박사 프로그램에 의해 투자되었다; KAR은 MRC 프로젝트 교부금에 의해 투자되었다 MR / L002566 / 1 (EJR과 CLH에게 수여) 및 CLH는 우리는 또한 이미징 조언 울프슨의 Bioimaging 시설을 감사드립니다 ARUK 부여 19479.에 의해 투자되었다.

프로토콜 내의 모든 단계는 대학 브리스톨의 동물 보호 및 복지 가이드 라인과 영국 홈 오피스의 사람들의하십시오. 근골격계 해부학 1. 시각화 참고 : 근육을 정량화하고 근육 첨부 파일의 정확한 위치를 식별하기 위해, 골격 요소의 모양을 시각화하기 위해, 발현 사이 (섹션 1.1) (근육을 계시) 골격 미오신에 해당하는 나이에 물고기와 유형 II 콜라겐 (시각화 연골). 대안 적으로, 콜라겐 A1 기자 col2a1로 형질 전환 형광 기자 라인을 사용하여 근골격계 해부학을 시각화 : mCherry (13, 14)을 연골과 느린 마이 오신 중쇄 기자 smyhc를 시각화 : GFP (15)는 근육 첨부 (1.2 절)의 위치를 시각화 할 수 있습니다. 연골과 근육을 표시 대체 라인은 동일하게 작동 할 수 있습니다. <ol><li> 형광 Immunostaining <ol><li> 1 시간 동안 인산염 - 완충 염수 (PBS)에 과량의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에서 유충을 수정. 0.1 % 트윈 20 (PBT)를 PBS로 세척하고 각각 5 분 동안 PBT 50 % 메탄올 (MeOH 중), 100 % 메탄올 탈수. 주의 : PFA는 독성 및 물질 안전 시트에 따라 처리해야합니다. 주 : 필요한 유충까지 100 % 메탄올에 저장 될 수있다. </li><li> 5 분 동안 PBT 50 % MeOH 중 유충 재수. 5 분 동안 PBT에 씻으십시오. </li><li> 5-6 분 동안 얼음에 PBT에서 0.25 % 트립신의 유충을 Permeabilize 하시려면. 5 분마다 4 배 PBT에 씻으십시오. </li><li> PBT에서 5 %의 혈청에서 2 ~ 3 시간 동안 차단합니다. </li><li> 실온에서 1 시간 또는 밤새 4 ° C에 대한 PBT에서 5 % 혈청 토끼 항 제 2 형 콜라겐과 마우스 항 - 미오신 항체의 권장 희석 애벌레를 품어. 주 : 권장 희석 범위는 항체의 데이터 시트에 일반적이다. 서로 다른 종에 대해 제기하고 또한 diffe되어 있습니다 항체를 선택조직에 임대. </li><li> PBT에서 15 분 동안 유충의 6 배를 씻으십시오. </li><li> PBT에서 5 %의 혈청에서 1-2 시간 동안 차단합니다. </li><li> 어둠 속에서 이차 항체에 품어. 특정 항체에 대한 5 %의 혈청 및 PBT에서 적절한 희석에 형광 표지 된 항 마우스 (550) 및 항 - 토끼 (488) 차 항체를 사용합니다. </li><li> 가능한 한 빨리 10 배의 공 초점 현미경에 PBT 및 이미지 10 분씩 세척 6X. </li></ol></li><li> 영상 근골격계 형상 <ol><li> Danieau의 솔루션 (16)에 미지근한 0.3 % 저 융점 (LMP) 아가로 오스의 커버 슬립에 복부 애벌레를 탑재합니다. 참고 : 형질 전환 물고기는 장착하기 전에 및 이미징 동안 0.02 %의 MS222 (Tricaine의 메탄, pH가 7)에 진정해야합니다. </li><li> 10 배 대물 렌즈와 약 2.5 배 디지털 줌을 사용하여 관심 영역의 공 초점 이미지 스택을 가져 가라. 488 nm의 561 N을 사용하여 녹색과 적색 채널의 이미지를 준비합니다m은 각각 레이저. 1.3 μm의 3 라인 평균의 Z 평면 사이의 간격을 512 X 512 픽셀 해상도에서 이미지. 얻어진 스택은 약 100 Z 슬라이스로 포함 할 것이다. </li><li> 티파니 시리즈로 데이터를 보냅니다. 5dpf 제브라 피쉬 유충의 근육과 연골 요소의 최대 예측은 그림 1에 나타내었다. </li></ol></li></ol> 2. 3D 표면을 생성 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 3, 4, 5 DPF에서 각 시점에 대한 대표적인 데이터 집합을 선택 (복수 샘플의 시각화 후 선택). </li><li> 3 차원 티파니 스택을 열고 분석 소프트웨어의 모든 채널을 선택합니다. 오른쪽 연골 채널을 클릭하고 이미지 필터와 평활 선택 가우스 (그림 2B)를. </li><li> 프로젝트보기에서 바로 &#39;새 레이블을 편집&#39;을 여과 이미지를 클릭하고 &#39;이미지 분할&#39;을 선택합니다. 각각의 재료, 즉, 연골와 j에 대한 새 레이블 만들기OINT. 마법 지팡이 도구를 사용하여 이미지의 연골 영역 (그림 2C, 흰색 신호, 보라색 개요)을 선택합니다. 윤곽 노이즈를 제거하기 위해 브러시 도구를 사용합니다. 참고 : 마법의 지팡이 도구를 사용하는 경우, &#39;모든 조각&#39;을 클릭합니다. </li><li> 브러시 도구를 사용하여 공동 지역을 선택하고 공동 구성 요소에 할당 (그림 2C, 블루 개요) </li><li> 상단 메뉴와 부드러운 라벨에 분할을 선택하여 한 번에 부드럽게 여러 조각. 오른쪽 3 차원 표면이 성분 (그림 2D)의 렌더링 생산하기 위해 표면을 생성하는 이미지를 클릭하여 선택합니다. </li><li> 표면을 클릭하고 메쉬 소프트웨어로 가져 오기위한 hmascii 파일로 데이터를 저장합니다. </li></ol> 3. FE 모델에 사용되는 근육의 힘을 계산 <ol style="margin-left: 40px;"><li> smyhc의 공 초점 이미지에서 근육 섬유의 수를 계산 : GFP 형질 전환 제브라 피쉬 (그림 1A, 화살촉, 1C)과 DIAM을 측정섬유 라 미터는 그 단면적을 계산 (πr 2). </li><li> 문헌에서 근육의 단위 면적당 적절한 힘을 확인합니다. 유생 제브라 골격근 (40 윈 / μm의 2)에 대한 단위 면적당 발생하는 최대 근력 17을 사용 하였다. </li><li> 단위 면적당의 힘에 의해 섬유의 수와 면적을 곱하여 각 해부학 근육 그룹의 힘을 계산한다. 표 1을 참조하십시오. </li></ol> 4. 메쉬 생성 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 유한 요소 메쉬를 생성 할 수있는 소프트웨어 패키지에 부 (2) (위)에서 생성 된 3 차원 모형을 가져. </li><li> 2 차원 메뉴의 수축 포장 도구를 사용하여 연골과 관절면의 A2D 메쉬를 생성합니다. 적절한 요소 크기를 선택합니다. 주 : 1.5 ~ 2.5 사이의 요소 크기를 사용합니다. 필요하다면, 상이한 크기의 2 차원면의 범위 차원 메쉬 최적화 (제 4 실시 메쉬를 생성한다.4). </li><li> &#39;&gt; 2D 도구&gt; 요소 확인&#39;을 아래에 메쉬 품질 검사를 수행 메쉬에서 중복 요소를 삽입하고 침투를 확인하기 위해 패널을. 모델 트리에서 유틸리티 탭을 사용하여 면각 각도를 수정합니다. </li><li> 3 차원&gt; Tetramesh 부속 패널을 사용하여 요소 크기를 서로 다른의 2 차원 표면 메쉬에서 3D 메쉬를 생성합니다. 주 : 다른 메쉬 크기의 결과를 비교 한 후 상기 시뮬레이션 수렴 및 기능의 정의를 손상하지 않는 최저 메쉬 크기의 FE 모델을 선택한다. 그림 3의 예는 아래턱의 연골에 대한 150 만 사면체 요소를 포함하고 2.0의 2D 요소 크기를 가지고 있었다. </li><li> 턱 모델은 형상&gt; 거리 부속 패널을 사용하여 공 초점 스택에 따라 확장 할 수 그래서 메쉬를 변환. 참고 : 연골을 확인하고 공동 구성 요소가 병합 된 모델을 수출하거나 관계를 사용하여 모델로 연결된다. </li></ol> 5. 유한 요소 모엘 건설 <ol><li> 상용 유한 요소 소프트웨어를 사용하여, FE 모델을 생성한다. 차원 근육 가이드로 부 (1)에서 생성 된 연골 표지 촛점 스택을 사용하여 근육의 어태치먼트 포인트에 대응하는 노드를 할당한다. 각 근육의 기원과 삽입을 나타내는 두 개의 노드 (그림 3) 사이의 벡터를 생성합니다. </li><li> 유형 &#39;역사&#39;의 부하 집 만들기 각 근육에 대한 &#39;C로드&#39;를 적용합니다. (단계 3.3에서 계산) 뉴턴의 크기를 지정하고 관련 벡터를 할당 할 수 있습니다. 3은 내전 mandibulae (AM), 각도기 hyoideus (PH) 및 intermandibularis (IM)에 대한 접속 지점을 보여줍니다. 주 :이 턱 근육 최대 수축력 각 부하의 50 %의 각 부위에 도포 될 수 있도록 삽입 원점 사이에 분배된다. </li><li> 문헌의 결정에 따라 적절한 탄성 등방성 재료의 특성을 할당합니다. 연골 영률이 모델의 영역 간은 각각 1.1 MPa의 0.25 MPa로했고, 푸 아송의 비율은 모두 18, 19 0.25이었다. </li><li> 모델에 초기 제약 조건을 적용하는 유형 &#39;경계&#39;의 부하 수집기를 만듭니다. 탭 분석&gt; 제약으로 이동하여 생성 서브 패널에, 당신은 제한하고자하는 모델의 노드를 선택합니다. 자유도 (DOF) 모션의 자연 범위의 가장 근사치에 모델의 한계 운동을 선택합니다. 참고 :도 3의 모델이 모션 모든 축에 구속되었다 모델의와의 중간 점에서 공간을 고정하기 ceratohyal에서 (DOF 1, 2, 3은 각각 X, Y 및 Z를 나타낸다) palatoquadrate는 제브라 피쉬 해골의 나머지 부분 (그림 3, 표 1)에 연결되는 지점에서 Y 및 Z 축. 이 모델은 적어도 하나의 노드에 세 DOF에 제한해야합니다. </li><li> 당신이 SIMUL하고자하는 운동의 각 유형에 대한 &#39;로드 단계를&#39;만들기분석 메뉴에서 (즉, 개방, 폐쇄)를 먹었고,이 운동을 시뮬레이션 (5.4 절 제)과 제약 (5.2 절에서 만든) 모든 관련 하중을 선택합니다. 이 나타나면 드롭 다운 메뉴에서 &#39;정적&#39;를 선택합니다. </li><li> 이 경우 &quot;.INP &#39;형식의 적절한 파일 형식으로 메시, 부하, 제약 및 재료 특성을 포함하여 수출 모델. </li><li> FE 분석 소프트웨어에로드 모델입니다. 만들기 및 작업 모듈을 사용하여 모델에 대한 작업을 실행합니다. </li><li> 결과 탭 및 시각화 메뉴에 등 응력, 변형, 변위에 대한 출력을 분석 (그림 4, 5). </li></ol> 턱 변형 / 변위 거리 6. 확인 <ol><li> 형질 전환 제브라 피쉬 : 3-6의 Tg (mcherry Col2a1aBAC)을 선택합니다. </li><li> 그들은 터치 그러나 그들의 마음은 여전히 ​​박동하는 응답이 중지 될 때까지 가볍게 0.02 %의 MS222와 애벌레를 마취시키다. </li><li> 산측면 미지근한 1 % LMP 아가로 오스의 커버 슬립에 (마취 상태에서) (Danieau의 솔루션에서 만든) 애벌레. </li><li> 머리 주위에서 아가로 오스를 제거하고 집게와 턱. </li><li> 정상 입의 움직임이 재개 될 때까지 파스퇴르 피펫을 사용하여 마취를 제거하는 유충의 머리 (아무 MS222)와 신선한 Danieau의 솔루션을 플래시합니다. </li><li> 입의 움직임의 밝은 필드 고속 비디오를 촬영하는 동영상 캡처 소프트웨어를 사용합니다. 높은 프레임 속도 미소 기간 주위의 동영상을 취하거나, 충분한 조 개구의 다수의 사이클을 기록. </li><li> 최대 변위에 열려 턱을 보여 프레임을 선택합니다. 멕켈의 연골의 앞쪽 끝과 μm의에서 위턱 (사골 판의 끝) 사이의 거리를 측정한다. </li><li> 여러 물고기 애벌레의 평균 변위를 계산합니다. </li><li> 모델에서 변위 데이터의 압축을 풉니 다. (모델 변위 동작을 확인하기 위해 6.8에서 계산 된 평균 변위를 사용하여 <strong&gt; 그림 4). 이 모델은 순차적으로 재료의 특성과 근육의 부하를 변경하여 예상 실행 민감도 분석에서 벗어나면. </li></ol>

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+underlying+the+movement+requirement+for+synovial+joint+cavitation.">A mechanism underlying the movement requirement for synovial joint cavitation.</a> Matrix biol. 22, 311-322 (2003).</li><li>Nia, H. T., Han, L., Li, Y., Ortiz, C., Grodzinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poroelasticity+of+cartilage+at+the+nanoscale.">Poroelasticity of cartilage at the nanoscale.</a> Biophys J. 101, 2304-2313 (2011).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어. 도 3-5의 일부 데이터가 J.Biomech, 48 (12), 브 런트 등.에서 재 인쇄 된, 유한 요소 모델링으로 인해 턱 개발, 3112-22에서 근육 긴장의 손실 관절 모양과 세포 행동의 변화를 예측하고있다. 2015 년, 엘스 비어 (15)의 허가와 함께.

유한 요소 모델은 그 뼈 형성을받은 10 균주하에 골격 요소의 영역을 연관시키는뿐 아니라 연골 내 골화 관절 형태 형성 중에 변형 8,12,21 아래 영역을 매핑하는 데 사용되어왔다. 다른 연구도 공동 개발 (11, 12) 중 변경 사항을 복제하는 이론적 인 성장 모델을 적용 할 수 있었다. 여기에서 우리는 비교적 간단한 시스템, 제브라 피쉬 턱 (20)에 대한 FE 모델을 구축하기위한 프로토콜을 보여줍니다. 여러 조직을 공부하는 등 CT 스캔 (22), 유전자 변형 라인의 공 촛점 이미징 또는 면역 염색 제브라 피쉬와 FE 모델, 원시 이미지를 수집하는 다른 방법을 달리 할 수 있습니다. 이 때문에, 연골 관련 근육 어태치먼트 포인트에 대한 직접적인 정보를 제공 할 수있다. 척추 동물 모델 중 제브라 피쉬는 유전 및 약리 조작에 특히 의무가 있습니다. 제브라 대한 FE 모델 생성두개 안면 연골 이제 공동 형태 형성에 생체 역학과 유전학 사이의 상호 작용의 추가 연구의 가능성을 열어. Fe 계 모델을 만드는 과정에 중요한 단계들이있다; 제 시스템의 정확한 삼차원 표현을 생성한다. 이 명확하게 경계를 정의하기 위해 충분히 높은 해상도의 영상을 필요로한다. 심지어 고해상도 이미지로 좋은면 하나가 일부 지역을 원활하게 할 수 있도록합니다. 다른 중요한 단계는 부하 올바른 제약의 정확한 위치를 정의한다. 불충분 구속 모델은 해결하기 위해 실패하고 부하의 잘못된 배치는 비정상적인 움직임의 원인이됩니다. 원시 데이터로부터 생성 된 표면 (그림 2B)를 메쉬하기 어려울 것 같은 원시 데이터의 일부 처리 (그림 2)이 필요하다. 우리는 가우시안 필터를 이용하여 데이터 (도 2c 필터링 </strong&gt;) 우리는 3 차원 표면으로 변환 될 수 깨끗한 윤곽선의 세트를 생성하기 위해서 곡선의 일부 수동 평활화를 수행 하였다. 너무 많은 스무딩는 많은 기능을 잃었다는 &quot;녹&quot;표면을 생성 할 수 있습니다. 올바른 요소 크기를 선택하면 요소 크기가 계산 집약적 너무 큰 메쉬를 만들어 너무 작은 선택하는 것과 반복적 인 과정이다. 그러나, 너무 큰 소자 크기를 선택하는 것은 구조체의 정확한 형상을 요점을 되풀이 실패 메쉬를 생성 할 것이다. 올바른 메쉬 턱의 정확한 형상을 포착하여 정확한 솔루션 수렴 최소 요소 크기를 가졌다 턱 변위를 이용하여 검증 하였다. 다른 연령과 종 실질적으로 다른 특성을 가질 것 같이 또한 더 정확한 변위를 모방하기 위해 재료의 특성 또는 부하 계산을 수정해야 할 수 있습니다. 항상 가상의 모델과에 제한이 있다는 것을 기억하는 것이 중요하다ssumptions는 FE 모델을 실행했다. 오직 하나의 샘플 수가 적은 모델링 때 개인 사이의 작은 변화 될 가능성이 있기 때문에 대표 샘플이 선택되도록하는 것이 중요하다. 단지 턱 요소 및 근육의 일부가 포함 된 바와 같이, 모델은 제브라 안면 근골격계 시스템의 간략화 된 버전이다. 따라서, 제약 모델링 턱 요소가 두개골의 나머지 부분과 연결하는 것 인 고려하여 배치 할 수 있었고, 모델은 인위적으로 &#39;공간&#39;에서 그것을 해결하기 위해 중앙에 제약을 받았습니다. 이 인공 제약은 자체 분석하지 않은 ceratohyal으로 모델에서 도출 해석에 영향을주지 않았다. 두개 안면 구조의 이상 포함은, 예를 들면 sternohyals와 연결된 연골 (23) 등 특히 다른 턱 개방 근육이 모델에 추가 할 수 있지만 제한은 유한 요소 소프트웨어에서 실행하는 데 더 큰 모델의 기능이 포함됩니다. S = &quot;jove_content는&quot;&gt; 또 다른 제한이 스프링 (8)의 삽입에 의해 달성 될 수 있지만, 우리는 인대 삽입을 모델화하지 않은 점이다. 이 경우 제 또 다른 가정은 모델이 선형으로 동작한다고 하였다. 모델에 균주의 크기는 게시 된 모델에 필적했고 균주가 3,500 이하 및 제약과 근육의 부착 점에서 떨어져 -5,000 μɛ 이상되는으로, 체외 세포 10, 24에 적용. 따라서, 모델의 해당 영역에서의 변형은 선형 모델에 대한 허용 가능한 범위 내에있는 것으로 간주 하였다. 연골 선형 재료로 완전히 동작하지 않고, 이전 모델 (25) 내의 유체의 거동 분석을 사용하도록 설정된 poroelastic 재료로 모델링되었다. 로컬 노드의 클러스터 사이에 근육 어태치먼트 포인트 확산하여 피크 힘을 분산하고보다 정확하게 특정 근육 대 근육 삽입을 나타내는 것이다. ENT는 &quot;&gt; FE의 사용은 구조에 작용하는 긴장과 스트레스의 평가를 할 수 있습니다.이 자주 정형 외과, 고생물학 및 최근 발생 생물학 등 많은 생명 과학 분야에서 사용되는 기법으로. 여기에 우리가 제브라 피쉬에 대한 FE에 구축하는 방법에 대해 설명합니다 아래턱. 향후이 모델은 미각을 포함, 전체 턱을보고하도록 확장 될 수있다. 유사 기술은 지금까지 대부분의 운동에 의해 연구되어왔다 물고기 척추 생체 역학을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다.

유한 요소 모델링 계산 계산 구조 (1)에 작용하는 스트레인의 크기와 위치를 매핑 할 수 공학 기술이다. 모델은 &quot;유한 요소&quot;의 메쉬로 표시되는 3 차원 구조로 구성하고, 분석의 최종 결과는 메쉬, 기계의 크기와 위치의 소자의 구조와 개수를 포함한 다수의 인자에 의해 지배되고 하중과 재료 특성. 재료 특성은 부하의 특정 유형에 따라 재료의 행동의 특정 측면을 설명; 샘플 연신시 포아송 비는 길이 재료의 폭에 비례 한 감소를 설명하면서, 영률 (E)은 재료의 탄성을 설명한다. FE 모델링 &#39;구조에 대한 계정에 고유 한 입력 데이터를 고려하여 모델의 변위, 응력, 변형 및 압력 작용 등 다양한 변수를 계산하기 위해 사용될 수있다;의 모양, 위치 및 하중의 크기와 특정 재료의 특성. FE 모델링 널리 공학 2 점차 (3) 정형 외과 및 생물학적 응용 프로그램 (4)에 사용됩니다. 개발 역학적 힘 세포 반응 5-8를 활성화하는 많은 세포에서 자극의 역할을하는 것으로 알려져있다하고 기관계 개발 내의 상대 위치 및 기계적 자극의 크기를 모두 예측하기 위해 유용하지만, 현재 FE 모델링은 거의 사용되고 제브라 피쉬의 개발. 두 연골 및 뼈 mechanosensitive 물질로 밝혀졌다. 예를 들어, 시험 관내 압축 장력 9 골 형성에 필요한 것으로 밝혀졌다 반면 연골 경로를 활성화하는 것으로 밝혀졌다. FE 분석 (FEA)을 기용 뼈 동안 골격 요소에 작용을 포함하여, 생물학적 시료에 작용하는 균주를 모델로 활용하고있다rmation 10. 이 이론 생체 역학적 힘 (11, 12)에 노출 된 경우와 병아리 무릎 관절 형태 형성 8시 본 균주의 패턴을 표시 한 후 다른 개발 응용 프로그램은 관절의 모양을 예측하는 사용을 포함한다. 이 프로토콜은 조직 현상의 메커니즘을 이해하는 도면으로 공 촛점 이미지로부터 3 차원 표면 메시와 유한 요소 모델을 생성하는 경험을 공유 할 목적으로한다. 우리는 또한 생체 내에서 실제 공동 변위 정보를 캡처 불구하고 FE 모델의 유효성을 검사하는 방법을 보여줍니다. 우리는 모형으로 제브라 조를 사용하지만 동일한 기술 근골격계의 구조에 3D 정보가 촛점 또는 광자 영상화함으로써 얻어 질 수있는 어떤 작은 생물학적 시스템에서 사용될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="937">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coll2</td>
			<td style="width:237px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab34712</td>
			<td style="width:365px;">Type II collagen antibody - stains all cartilage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">A4.1025 / MF20</td>
			<td style="width:237px;">Developmental studies hybridoma bank</td>
			<td style="width:119px;">A4.1025</td>
			<td>Skeletal mysoin antibody - marks all skeletal muscle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Low melt agarose</td>
			<td style="width:237px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A9414-5G</td>
			<td>For mounting zebrafish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate )</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>To make anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td>T/3760/48</td>
			<td>sample permeablilisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dylight 488Mouse IgG</td>
			<td style="width:237px;">Thermofisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">35502</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dylight 550 Rabbit IgG</td>
			<td style="width:237px;">Thermofisher&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">84541</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP8/SP5 or SPE confocal</td>
			<td style="width:237px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;LAS Leica capture software&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aviso (version 7.0.0)</td>
			<td style="width:237px;">FEI Visualization Science Group</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3D image analysis software (Section 2)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10)</td>
			<td style="width:237px;">Altair Engineering</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FE model generating software (Section 4-5)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Abaqus (version 6.14)</td>
			<td style="width:237px;">SIMULIA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FE analysis software (Section 5.7-5.8)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

building finite element models to investigate zebrafish jaw biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

근육 (도 1a)과 연골 (도 1b) 또는 트랜스 제닉 리포터 촬상 면역 염색 (도 1C)는 관련된 근육과 함께 턱의 3 차원 구조를 시각화 할 수있다. 고해상도로 촬상하여 턱의 3 차원 형상 (도 2)의 위치 및 부하의 위치 (도 3) 모두를 캡처하는 모델을 구축 할 수 있었다. 고속 비디오 캡처를 통해 본 생체 변위 (도 4)에서 이용 우리 모델의 운동 범위는 실제 범위 내에있는 것을 확인 하였다. 런 번 FE 모델은 응력 (도 5a), 최소 및 최대 주 변형률 (- K도 5b)와 같은 데이터의 범위를 표시 할 수있다. 이러한 결과는 세 희미하다<html> 관련보기 (그림 5 층, 5 세대, 5J, 5K)와 디지털 (그림 5E 구분 &#39;, 5E&#39;를 &#39;5I&#39;, 5I을 얻기 위해 회전하므로 모델은 세부의 미세 패턴 (그림 5E, 5I)를 참조하기 위해 확대 될 수 ensional &#39;&#39;) 표시하는 방법을 모델 전반에 걸쳐 스트레스, 변형 또는 압력 변화의 패턴입니다. 이 모델에서 정량적 데이터를 추출하는 것도 가능하다 (도시하지 않음). 모델을 검증하고 형태를 가장 정확한 재료 특성, 부하를 사용하여 메쉬하여 FE 모델 개발의 기간 동안 세포에 의해 발생되는 기계적인 환경의 최선의 추정치를 탐색하는 데 사용할 수 있습니다. 모델의 결과를 직접 셀룰러 동작 및 유전자 발현 (20)의 변화에 비교 될 수있다. <html> 1 다시 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 :. 5 DPF의 제브라 피쉬 아래턱의 근골격계 요소의 대표 이미지 5dpf 유충의 아래턱의 대표 공 초점 스택은 모든 모든 골격 미오신 얼룩 A4.1025에 대한 면역 염색 상단으로 전방 (A) (B)로 표시 유전자 변형 기자의 col2a1을 표현하는 살아있는 유충에서 모든 연골 (C) 스택을 표시 타입 II 콜라겐에 대한 면역 염색 : GFP 느린 근육 (녹색) : mCherry은 연골 (적색)과 smyhc을 표시. IA : intermandibularis 전방, 수소 이온 지수 (pH) : 각도기 hyoideus, AM : 내전 mandibulae, HI : hyoideus 열등, HI : hyoideus 우수한, CH : sternohyoideus, MC : 멕켈의 연골, PQ : Palatoquadrate, CH :. ceratohyal <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">보려면 여기를 클릭하십시오 더 큰 버전 이 그림의.</a> &quot;fo를하기 : 유지-together.within 페이지를 =&quot;1 &quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> 그림 2 : 공 초점 데이터로부터 3D 표면의 세대 공동 영역의 높은 배율을 가진 제브라 피쉬 아래턱을위한 3D 표면에 공 초점 데이터의 전환을 보여주는 이미지.. (A) 원료 촛점 데이터; (B) 가우시안 필터 적용 후의 데이터 세트; (C) 필터링 개요; (D) 3D 표면. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> 그림 3 : 제약 조건과 힘의 벡터를 보여주는 대표적인 메시 (A) 입 폐쇄와에 대한 5 DPF의 애벌레에 대한 대표 메쉬.(B)의 입 구. 하얀 점은 모델에 대한 구속을 표시하고있는 치수 (예컨대, X 및 Y 또는 X, Y 및 Z). 백색 라인은 흰색 화살표로 표시된 근력의 벡터를 근육의 위치를 ​​나타낸다. 레드 연골을 보여주고 노란색 영역 간. 이 그림은 이전에 브 런트 등. 15 년에 출판 보충 자료에서 수정되었습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> 그림 4 :. 감도 테스트 다른 연골과 영역 간 영의 계수에 대한 5dpf 제브라 피쉬에 턱 변위를 시뮬레이션 FE-모델입니다. 턱에 표시됩니다 (μm의 폐쇄 개방) 변위를 턱; 컬러 키를 사용하여 기록했다. 각 모델 (A - L)은 연골의 다른 조합 (C = 1.1, 3.1, 6.1 MPa의) 또는 영역 간 (0.25 I = 0.5, 0.75, 또는 1 MPa의) 속성이 있습니다. 가로 검은 색 화살표 (수직 검은 색 화살표로 표시)를 멕켈의 연골의 끝에서 턱 변위의 가치를 강조한다. 남성과 N 애벌레를 보여주는 최소한의 DPF (5)의 동영상에서 스틸은, 즉, 턱 (M) 폐쇄 및 최대, 즉, 턱 겹쳐 두와 (N) 완전 개방은 (O) - O에 흰색 라인 (43 μm의의) 변위를 나타냅니다. 변위가 활어에서 본 0.25 (A) 최고의 경기의 영역 간 1.1이 경우 상대 연골 특성 (O). AL이 그림의 패널은 이전에 브 런트 등. 15 년에 출판되었다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">더 큰 적이있는을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 이온. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> 그림 5 : FE 모델에서 대표적인 데이터 유충 DPF 5에 적용된 모든 근육의 FE 모델 시뮬레이션 (A - C).. (A) 폰 미제스 (EMaxmin) (B) 최소 주 변형률 (E 민. P, μɛ) (C) 최대 주 변형률 (E 최대. P., μɛ). 턱 개방시 최대 및 최소 주 균주의 FE 모델 시뮬레이션. (D - K) : 최대 주 변형률 (. E 최대 P., μɛ) (D) 복부 턱보기 및 (E) 복부 공동보기 (E)에서이 멕켈의 연골을 통해 근위 - 말단 부분의 위치를 보여줍니다 관절과 영역 간 (E &#39;) 및 (E&#39; &#39;)에서 각각. (F) : 가로보기를 턱. (G) : 측면 공동 볼 수 있습니다. (H - K) : 최소 주 변형률 (. E 최소 P, μɛ) (H) 복부 턱보기 (I) 복부 공동보기. (I)는 멕켈의 연골 관절을 통해 근위 - 말단 부분의 위치를 보여줍니다 (I &#39;) 및 (I&#39;)는 각각 (J)의 영역 간 : 측면 턱보기를. (K) : 측면 공동 볼 수 있습니다. 이 수치는 이전에 브 런트 등. 15 년에 출판되었다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 근육 섬유의 개수 </td><td> 근육 섬유의 면적 (㎛의 2) </td><td> 근육 그룹의 면적 (㎛의2) </td><td> 힘 (N) </td></tr><tr><td> 5 DPF intermandibularis 전방 </td><td> (5) </td><td> 23.8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF 끄는 hyoideus </td><td> 6 </td><td> 23.8 </td><td> 142.8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF 내전근 mandibulae </td><td> 9 </td><td> 23.8 </td><td> 214.2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> 1 번 테이블: 근육 정량화. 40 윈 / μm의 2 (참조 17에서 찍은 단위 면적당 값)을 사용하여 DPF 5에서 Intermandibularis 전방, 내전근 Mandibulae와 각도기 Hyoideus 평균 근육의 힘을 계산. (Lorga 등., 2011) (N = 3).

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Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

Zebrafish의 턱 역학을 조사하기 위해 유한 요소 모델을 구축

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

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Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

공 촛점 분석을 사용하여<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em&gt;의 Wnt 및 쉬 Morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

연구

발생학

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of &#946;-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

A primary culture of bovine corneal endothelial cells was used to investigate the mechanism of corneal endothelial-mesenchymal transition. Furthermore, a rat corneal endothelium cryoinjury model was used to demonstrate corneal endothelial-mesenchymal transition in vivo.

생체 외 및 생체 내 모델에서 각막 내피 세포 - 중간 엽 전이를 공부하기

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

해제 배아 마음에 관상 동맥 혈관의 분석

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological problems after stroke and is shown to impair neurogenic processes. Interestingly, the adult zebrafish has recently emerged as a relevant and useful model to mimic hyperglycemia/diabetes and to investigate constitutive and regenerative neurogenesis. This work provides methods to develop zebrafish models of hyperglycemia to explore the impact of hyperglycemia on brain cell proliferation under homeostatic and brain repair conditions. Acute hyperglycemia is established using the intraperitoneal injection of D-glucose (2.5 g/kg bodyweight) into adult zebrafish. Chronic hyperglycemia is induced by immersing adult zebrafish in D-glucose (111 mM) containing water for 14 days. Blood-glucose-level measurements are described for these different approaches. Methods to investigate the impact of hyperglycemia on constitutive and regenerative neurogenesis, by describing the mechanical injury of the telencephalon, dissecting the brain, paraffin embedding and sectioning with a microtome, and performing immunohistochemistry procedures, are demonstrated. Finally, the method of using zebrafish as a relevant model for studying the biodistribution of radiolabeled molecules (here,[18F]-FDG) using PET/CT is also described.

This work describes methods to establish acute and chronic hyperglycemia models in zebrafish. The aim is to investigate the impact of hyperglycemia on physiological processes, such as constitutive and injury-induced neurogenesis. The work also highlights the use of zebrafish to follow radiolabeled molecules (here, [18F]-FDG) using PET/CT.

제브라 피쉬의 고혈당의 급성 및 만성 모델 : 고혈당의 영향을 평가하는 방법 - 신경 세포 및 방사선 표지 된 분자의 생체 분포

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

조사 Trypanosoma cruzi 운동 비보 를 동물 모델로 서 애벌레 Zebrafish의 설립

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

성인 Zebrafish 부상 모델 뼈 조직 재생에 Prednisolone의 효과 연구

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

성인 마우스 숫자 절단 및 재생 : 포유류 블라스터 마 형성 및 intramembranous Ossification을 조사하는 간단한 모델

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

세포 유형 별 척도에서 애기장대 뿌리 개발을 조사하기 위해 리보솜 친화성 정제 (TRAP) 번역

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...