LHB מומן על ידי תכנית PhD Cell Wellcome Trust הדינמית; קאר מומנה על ידי מענק פרויקט MRC MR / L002566 / 1 (הוענק Ejr ו CLH) ו CLH מומנה על ידי מענק ערוק 19479. כמו כן, אנו רוצים להודות מתקן bioimaging וולפסון ייעוץ הדמיה.

כל השלבים שונים הפרוטוקול אחרי מאונ&#39; הטיפול בבעלי החיים של הבריסטול והנחיות רווחה לבין אלה של משרד הפנים בבריטניה. ויזואליזציה 1. לאנטומיה השלד והשרירים הערה: כדי להמחיש את הצורה של אלמנטים השלד, לכמת שרירים כדי למצוא את המיקום המדויק של הקבצים המצורפים שריר, immunostain (סעיף 1.1) דגים בגיל המתאים עבור שרירן השלד (אשר חושף שרירים) וקולגן מסוג II (לדמיין סָחוּס). לחלופין, לדמיין את האנטומיה השריר-שלד באמצעות קווי כתב ניאון מהונדסים כגון col2a1 כתב a1 קולגן: mCherry 13,14 לדמיין סחוס ואת smyhc כתב השרשרת כבדה האיטי השרירן: GFP 15 כדי להמחיש את העמדה מצורפת שריר (סעיף 1.2). קווים אלטרנטיביים המסמנים סחוס ושרירים יכולים לעבוד באותה מידה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלורסנט Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן זחל paraformaldehyde 4% העודפים (PFA) ב פוספט שנאגר מלוח (PBS) במשך שעה 1. לשטוף ב- PBS עם 0.1% Tween 20 (PBT) ו מייבשים מתנול 50% (MeOH) ב PBT ו 100% MeOH במשך 5 דקות בהתאמה. זהירות: PFA הוא רעיל, יש לטפל בהתאם גיליון בטיחות חומרים. הערה: זחל ניתן לאחסן 100% MeOH עד לרגע השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם זחל ב -50% MeOH ב PBT במשך 5 דקות. לשטוף PBT במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize זחל טריפסין 0.25% ב PBT על קרח למשך 5-6 דקות. לשטוף 4x PBT במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום במשך 2-3 שעות בסרום 5% ב PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הזחל עם הדילול המומלץ של קולגן אנטי סוג הארנב 2 ונוגדנים נגד שרירן העכבר בסרום 5% ב PBT במשך שעה 1 ב טמפ החדר או לילה ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: טווח הדילול המומלץ הוא בדרך כלל על גיליון נתוני נוגדן. בחר נוגדנים אשר מועלות כנגד זנים שונים זה לזה וכי הם גם diffeלשכור לרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 6x זחל במשך 15 דקות ב PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום במשך 1-2 שעות בסרום 5% ב PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגירים נוגדנים משני בחושך. השתמש שכותרתו fluorescently ועכבר אנטי (550) ו-ארנב נגד (488) נוגדנים משני ב דילול מתאים בסרום 5% ו PBT עבור הנוגדן הספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 6X במשך 10 דקות כל אחד ב PBT ותמונה על מיקרוסקופ confocal 10X בהקדם האפשרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה השלד והשרירים גיאומטריה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הזחלים ventrally על coverslip ב נקודת התכה 0.3-0.5% נמוך פושר (LMP) agarose בתמיסה של Danieau 16. הערה: דג מהונדס יהיה צורך מסומם ב 0.02% MS222 (methanesulfonate Tricaine, pH 7) לפני הרכבה ובמהלך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח ערימת תמונת confocal של האזור של עניין באמצעות העדשה 10X אובייקטיבית הזום הדיגיטלי כ פי 2.5. הכנת תמונות של ערוץ ירוק ואדום באמצעות 488 ננומטר ו 561 nמ לייזרי בהתאמה. תמונה ברזולוציה פיקסל 512 x 512 עם מרווח בין מטוסי z של 1.3 מיקרומטר ו -3 ממוצעי קו. המחסנית וכתוצאה מכך תהווה של כ -100 פרוסות z. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים כסדרה TIFF. תחזיות מקסימלי של אלמנטים שריר וסחוס של פגית דג הזברה 5dpf מוצגים באיור 1. </li></ol></li></ol> 2. יצירת משטח 3D <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר במערך נציג עבור כל נקודת זמן ב -3, 4 ו -5 DPF (בחר לאחר להדמיה של דגימות מרובות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח ערימת TIFF 3 ממדים ובחר את כל ערוצי תוכנת ניתוח. קליק ימני על ערוץ הסחוס ובחרתי תמונת מסנן חלק: גאוס (איור 2 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאור פרויקט קליק ימני על תמונה מסוננת ובחר &#39;פילוח תמונה&#39; ולאחר מכן &#39;לערוך תווית חדשה&#39;. צור תווית חדשה עבור כל חומר, כלומר, סחוס joint. בחר את אזור הסחוס של התמונה (איור 2C, אות לבן, מתאר סגול) באמצעות הכלי מטה הקסמים. השתמש בכלי המברשת כדי להסיר את רעש מן המתאר. הערה: אם אתה משתמש בכלי מטה קסם, לחץ על &#39;כל הפרוסות&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את האזור המשותף עם כלי המברשת ולהקצות לרכיב משותף (איור 2 ג, מתאר כחול) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר פרוסות חלקות בבת אחת על ידי בחירת פילוח בתפריט העליון ותוויות חלקות. קליק ימני על התמונה ובחר ליצור משטח לייצר משטח 3D לדקלם של הרכיב (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש על המשטח ולשמור נתונים כקובץ hmascii לצורך יבוא תוכנת meshing. </li></ol> 3. חישוב הכוחות השרירים כדי לשמש דגם FE <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר סיבי שריר מתמונות confocal של smyhc: דג הזברה מהונדס GFP (איור 1 א &#39;, ראש חץ, 1C) ולמדוד את קוטרeter של סיבים כדי לחשב שטח החתך שלהם (πr 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה כוח מתאים ליחידת שטח שריר מהספרות. כוח השריר המקסימאלי שנוצר ליחידת שטח עבור שרירי שלד דג זברת זחל (40 ננ / מיקרומטר 2) שמש 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הכוחות לכל קבוצת שרירים אנטומיים ידי הכפלת מספר סיבי ושטחם ידי הכוח ליחידת שטח. ראה טבלה 1. </li></ol> 4. יצירת Mesh <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבא את מודל 3D שנוצר בסעיף 2 (לעיל) לתוך חבילת תוכנה מסוגלת לייצר רשת אלמנטים סופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור רשת A2D של הסחוס ומשטחים משותפים על ידי שימוש באפשרות הפסיכולוג לעטוף תחת תפריט 2D. בחר גודל אלמנט מתאים. הערה: השתמש בגודל אלמנט בין 1.5-2.5. במידת הצורך, ליצור מגוון של השטח 2D בגודל שונה משתלב לבצע אופטימיזציה רשת 3D (סעיף 4.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בדיקות איכות רשת למצוא תחת &quot;כלי 2D&gt;&gt; בדוק אלמנטים&quot; לוח לבדוק אלמנטים כפולים, הוספות וחדירות של הרשת. תקן זוויות dihedral באמצעות לשונית שירות עץ מודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור רשת 3D מן משתלב משטח 2D עם הבדלי גודל האלמנט באמצעות subpanel 3D&gt; Tetramesh. הערה: השווה את התוצאות של גדלי רשת שונים ובחר את מודל FE עם גודל הרשת הנמוך ביותר מתכנס לאחר סימולציות נוספות כלשהו ואינו משפיע על הגדרת תכונה. הדוגמא באיור 3 מכילה 1.5 מיליון אלמנטים tetrahedral עבור סחוסי הלסת התחתונים והייתה לו גודל אלמנט 2D של 2.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את הרשת כך מודל לסת הוא להתרחב בד בבד לכל מחסנית confocal באמצעות subpanel הגיאומטריה&gt; המרחק. הערה: ודא הסחוס ורכיבים משותפים מחוברים במודל על ידי יצוא מודל ממוזג או באמצעות קשרים. </li></ol> 5. Mod אלמנטים סופייםאל בניה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אלמנטים סופיים תוכנה מסחרית (FE), ליצור מודל FE. באמצעות ערימות confocal 3D השרירים שכותרתו סחוס שנוצרו בסעיף 1 כמדריך, להקצות צמתים מתאימות נקודות מצורפות שריר. צור וקטור בין שני צמתים המייצגים את המקור ואת החדרת כל שריר (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור אספן עומס מסוג &#39;היסטוריה&#39; כדי להחיל &quot;עומס ג &#39;עבור כל שריר. ציין את גודל ב ניוטונים (המחושב בשלב 3.3) ולהקצות וקטור הקשורים. איור 3 מציג את נקודות ההתקשרות עבור mandibulae adductor (PM), מד-זווית hyoideus (PH) ו intermandibularis (IM). הערה: לקבלת שרירי לסת אלה, כוח התכווצות מקסימלית מופץ בין מוצא ההחדרה כך שרק 50% של כל אחד מעומסי מוחל בכל אתר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקצאת תכונות החומר איזוטרופיים אלסטי המתאים כפי שנקבע על ידי הספרות. מודול יאנג עבור סחוסואת interzone במודל זה היו 1.1 מגפ&quot;ס ו 0.25 מגפ&quot;ס בהתאמה ויחס פואסון היה 0.25 עבור שני 18,19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור אספן עומס של &#39;הגבול&#39; הסוג להחיל מגבלות ראשוניות לדגם. עבור אל כרטיסיית ניתוח&gt; האילוצים של subpanel ליצור, לאסוף את הבלוטות לדגם ברצונך להגביל. בחר את דרגות החופש (DOF) כי מגבילים את התנועה של המודל הקירוב הטוב ביותר של טווח התנועה הטבעי. הערה: המודל באיור 3 היה מוגבל בכל צירי תנועה (DOF: 1, 2, 3 מייצגים x, y ו- z, בהתאמה) בבית ceratohyal לעגן אותו בחלל בנקודה אמצע במודל וב ציר y ו- z בנקודה שבה palatoquadrate מתחבר לשאר הגולגולת דג הזברה (איור 3, טבלה 1). המודל חייב להיות מוגבל בכל השלושה DOF בתוך צומת לפחות אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור &quot;צעד טען &#39;, עבור כל סוג של תנועה ברצונך מכשירי כושראכול (כלומר, פתיחה, סגירה), תחת תפריט הניתוח ובחר את כל ההמון הרלוונטי (עשה בסעיף 5.2) ואילוצים (עשה בסעיף 5.4) כדי לדמות את התנועה הזאת. בחירה &#39;סטטי&#39; מן התפריט הנפתח כאשר הוא מופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מודל יצוא כוללים רשת, המון, אילוצי תכונות חומר בפורמט קובץ מתאים, בפורמט &quot;.inp&quot; במקרה זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מודל טען לתוך תוכנת ניתוח FE. יצירה וביצוע עבודה עבור המודל באמצעות מודול איוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח פלט מתח, מתח, עקירה, וכו המצויות בתפריט להדמיה הכרטיסייה ותוצאות (איור 4 ו -5). </li></ol> 6. אימות של לסת דפורמציה / עקירת מרחקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 3-6 Tg (Col2a1aBAC: mCherry) דג הזברה מהונדס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלות לטשטש את הזחלים עם MS222 0.02% עד שהם מפסיקים להגיב למגע אך ליבם עדיין פועם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרהזחלים רוחביים (תוך מורדם) על coverslips ב agarose LMP פושר 1% (המורכבים בתמיסה של Danieau). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את agarose מרחבי הראש והלסתות עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף הטרי הפתרון של Danieau (ללא MS222) מעל ראשו של הזחל להסיר הרדמה בעזרת פיפטה פסטר עד תנועות פה נורמליות לחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת לכידת סרט לקחת קטעי וידאו בהיר שדה מהיר של תנועות פה. קח סרטים של סביב משך דקות בקצב התמונות הגבוה ביותר, או מספיק כדי להקליט מחזורים רבים של פתיחת לסת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מסגרות המציגות את הלסת פתוחה העקירה המקסימלית שלה. למדוד את המרחק בין הקצה הקדמי של הסחוס של המקל ואת הלסת העליונה (קץ צלחת כִּברָתִי) ב מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את עקירת ממוצע זחלי דג מרובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ נתוני עקירה מהמודל. השתמש העקירה הממוצעת מחושבת ב 6.8 לאמת התנהגות תזוזת מודל ( <strong&gt; איור 4). אם המודל חורג מן צפוי, ניתוח רגיש מנוהל על ידי שינוי ברצף תכונות חומר והמון שרירים. </li></ol>

<ol>
	<li>Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finite+Element+Analysis+and+Understanding+the+Biomechanics+and+Evolution+of+Living+and+Fossil+Organisms.">Finite Element Analysis and Understanding the Biomechanics and Evolution of Living and Fossil Organisms.</a> Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 35, 541-576 (2007).</li><li>Rao, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Finite Element Method in Engineering: Fifth Edition. , (2010).</li><li>Taylor, M., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+decades+of+finite+element+analysis+of+orthopaedic+devices:+Where+are+we+now+and+what+are+the+opportunities.">Four decades of finite element analysis of orthopaedic devices: Where are we now and what are the opportunities.</a> J Biomech. 48, 767-778 (2015).</li><li>Button, D. J., Rayfield, E. J., Barrett, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+biomechanics+underpins+high+sauropod+diversity+in+resource-poor+environments.">Cranial biomechanics underpins high sauropod diversity in resource-poor environments.</a> Proc Royal Soc London B: Biol Sci. 281. 281, (2014).</li><li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 27-61 (2013).</li><li>Shwartz, Y., Farkas, Z., Stern, T., Aszodi, A., Zelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+contraction+controls+skeletal+morphogenesis+through+regulation+of+chondrocyte+convergent+extension.">Muscle contraction controls skeletal morphogenesis through regulation of chondrocyte convergent extension.</a> Dev biol. 370, 154-163 (2012).</li><li>Rolfe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mechanosensitive+genes+during+skeletal+development:+alteration+of+genes+associated+with+cytoskeletal+rearrangement+and+cell+signalling+pathways.">Identification of mechanosensitive genes during skeletal development: alteration of genes associated with cytoskeletal rearrangement and cell signalling pathways.</a> BMC genomics. 15, 48 (2014).</li><li>Roddy, K. A., Kelly, G. M., van Es, M. H., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+patterns+of+mechanical+stimulation+co-localise+with+growth+and+cell+proliferation+during+morphogenesis+in+the+avian+embryonic+knee+joint.">Dynamic patterns of mechanical stimulation co-localise with growth and cell proliferation during morphogenesis in the avian embryonic knee joint.</a> J Biomech. 44, 143-149 (2011).</li><li>Haudenschild, D. R., Chen, J., Steklov, N., Lotz, M. K., D'Lima, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+chondrocyte+actin+cytoskeleton+in+living+three-dimensional+culture:+response+to+anabolic+and+catabolic+stimuli.">Characterization of the chondrocyte actin cytoskeleton in living three-dimensional culture: response to anabolic and catabolic stimuli.</a> Mol cell biomech. 6, 135-144 (2009).</li><li>Nowlan, N. C., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+pattern+of+mechanical+stimulation+promotes+ossification+in+avian+embryonic+long+bones.">A dynamic pattern of mechanical stimulation promotes ossification in avian embryonic long bones.</a> J Biomech. 41, 249-258 (2008).</li><li>Giorgi, M., Carriero, A., Shefelbine, S. J., Nowlan, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiological+simulations+of+prenatal+joint+morphogenesis.">Mechanobiological simulations of prenatal joint morphogenesis.</a> J Biomech. 47, 989-995 (2014).</li><li>Heegaard, J. H., Beaupre, G. S., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+modulated+cartilage+growth+may+regulate+joint+surface+morphogenesis.">Mechanically modulated cartilage growth may regulate joint surface morphogenesis.</a> J Ortho Res. 17, 509-517 (1999).</li><li>Hammond, C. L., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+populations+of+endochondral+osteoblasts+with+differential+sensitivity+to+Hedgehog+signalling.">Two populations of endochondral osteoblasts with differential sensitivity to Hedgehog signalling.</a> Development. 136, 3991-4000 (2009).</li><li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarth Res Soc. 21, 269-278 (2013).</li><li>Elworthy, S., Hargrave, M., Knight, R., Mebus, K., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+slow+myosin+heavy+chain+genes+reveals+a+diversity+of+zebrafish+slow+twitch+muscle+fibres+with+differing+requirements+for+Hedgehog+and+Prdm1+activity.">Expression of multiple slow myosin heavy chain genes reveals a diversity of zebrafish slow twitch muscle fibres with differing requirements for Hedgehog and Prdm1 activity.</a> Development. 135, 2115-2126 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danieau's+solution+(30&#215;).">Danieau's solution (30&#215;).</a> Cold Spring Harb Prot. , (2011).</li><li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish.">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> J Gen physiol. 137, 255-270 (2011).</li><li>Tanck, E., Blankevoort, L., Haaijman, A., Burger, E. H., Huiskes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+muscular+activity+on+local+mineralization+patterns+in+metatarsals+of+the+embryonic+mouse.">Influence of muscular activity on local mineralization patterns in metatarsals of the embryonic mouse.</a> J Ortho Res. 18, 613-619 (2000).</li><li>Tanck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+consequences+of+mineralization+in+embryonic+bone.">The mechanical consequences of mineralization in embryonic bone.</a> Bone. 35, 186-190 (2004).</li><li>Brunt, L. H., Norton, J. L., Bright, J. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finite+element+modelling+predicts+changes+in+joint+shape+and+cell+behaviour+due+to+loss+of+muscle+strain+in+jaw+development.">Finite element modelling predicts changes in joint shape and cell behaviour due to loss of muscle strain in jaw development.</a> J Biomech. 48, 3112-3122 (2015).</li><li>Roddy, K. A., Prendergast, P. J., Murphy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+influences+on+morphogenesis+of+the+knee+joint+revealed+through+morphological,+molecular+and+computational+analysis+of+immobilised+embryos.">Mechanical influences on morphogenesis of the knee joint revealed through morphological, molecular and computational analysis of immobilised embryos.</a> PloS one. 6, e17526 (2011).</li><li>Cuff, A. R., Bright, J. A., Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+experiments+on+finite+element+models+of+an+ostrich+(Struthio+camelus)+cranium.">Validation experiments on finite element models of an ostrich (Struthio camelus) cranium.</a> Peer J. 3, 1294 (2015).</li><li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Musculoskeletal+patterning+in+the+pharyngeal+segments+of+the+zebrafish+embryo.">Musculoskeletal patterning in the pharyngeal segments of the zebrafish embryo.</a> Development. 124, 2945-2960 (1997).</li><li>Dowthwaite, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+underlying+the+movement+requirement+for+synovial+joint+cavitation.">A mechanism underlying the movement requirement for synovial joint cavitation.</a> Matrix biol. 22, 311-322 (2003).</li><li>Nia, H. T., Han, L., Li, Y., Ortiz, C., Grodzinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poroelasticity+of+cartilage+at+the+nanoscale.">Poroelasticity of cartilage at the nanoscale.</a> Biophys J. 101, 2304-2313 (2011).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף. חלק מנתוני תאני 3-5 כבר נדפסו מן J.Biomech, 48 (12), בניטל et al., דוגמנות אלמנט סופית צופה שינויים בצורה משותפת ותא התנהגות כתוצאה מאובדן מתיחת שריר בפיתוח לסת, 3112-22. 2015, באישור Elsevier 15.

מודלים אלמנטים סופיים שימשו להתייחס בתחומי אלמנטים השלד כי הם תחת לחץ עם אלה היווצרות העצם והתנסות 10, כמו גם למפות את האזורים תחת לחץ במהלך התאבנות endochondral ומורפוגנזה משותף 8,12,21. מחקרים אחרים גם הצליחו ליישם מודלי צמיחה תיאורטי לשכפל שינויים במהלך פיתוח משותף 11,12. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול לבניית מודלי FE עבור מערכת פשוטה יחסית, לסת דג הזברה 20. בניגוד לשיטות חלופיות איסוף תמונות גולמיות עבור דגמי FE, כגון CT סריקה 22, הדמית confocal של קווים מהונדסים או דג זברת immunostained מאפשר רקמות מרובות כדי להיחקר. זה יכול, אם כן, לספק מידע ישיר על נקודות מצורפות שריר ביחס סחוס. בין דגמי חוליות דג הזברה ניתנת במיוחד מניפולציה גנטית תרופתית. הדור של דגמי FE עבור דג הזברהסחוס craniofacial עכשיו פותח את האפשרות של מחקר נוסף של יחסי הגומלין בין ביומכניקה וגנטיקה morphogenesis משותף. ישנם מספר שלבים קריטיים לתהליך של יצירת מודל FE; הראשון הוא יצירת ייצוג תלת ממדי מדויק של המערכת. זה דורש הדמיה ברזולוציה גבוהה מספיק כדי להגדיר גבולות ברורים. שימו לב כי גם עם הדמיה ברזולוציה גבוהה לבצע משטח טוב אחד יכול להיות להחליק כמה אזורים. שלב קריטי נוסף הוא הגדרת המיקום הנכון של העומס ואילוצים נכונים. מודל מוגבל מספיק ייכשל לפתור והשמה שגוי של העומסים יגרום תנועה חריגה. חלק מהעיבוד של הנתונים הגולמיים (איור 2) יש צורך כמשטח המופק מהנתונים הגולמיים יהיה קשה רשת (תרשים 2B). אנחנו מסוננים הנתונים באמצעות מסנן גאוס (איור 2 ג </sטרונג&gt;) וביצענו כמה החלקה ידנית של עקומות לייצר סדרה של קווי המתאר נקי כי ניתן להמיר את משטח 3D. חלקה יותר מדי יכולה לייצר משטח &quot;נמס&quot; שאבד רבים מסממניה. בחירת גודל האלמנט הנכון היא תהליך חוזר ונשנה כמו בחירה קטנה מדי גודל אלמנט היוצר גדולה מדי רשת אשר מחשוב אינטנסיבי. עם זאת, בחירת גודל אלמנט גדול מדי תפיק רשת אשר נכשלה לשחזר את הצורה הנכונה של המבנה. הרשת הנכונה, ניתנה גודל האיבר הקטן שכבש את הצורה הנכונה של הלסת והתאסף פתרון נכון, לאמת אותם באמצעות עקירת בלסת. זה יכול להיות גם צורך לשנות את תכונות חומר או חישובי עומס טוב יותר לחקות את העקירה הנכונה כגילים ומינים שונים יהיו מאפיינים שונים באופן משמעותי. חשוב לזכור כי תמיד יש מגבלות מודל היפותטי<html> ssumptions הריץ מודלי FE. כאשר רק דוגמנות אחד או מספר קטן של דוגמאות הוא קריטי כדי להבטיח מדגם מייצג נבחר שם צפוי להיות שינויים קלים בין אנשים. כפי רק כמה מן האלמנטים הלסת והשרירים נכללו, המודל הוא גרסה פשוטה יותר של מערכת השלד והשרירים craniofacial דג הזברה. לכן, אילוצים חייבים להיות ממוקמים לתת דין וחשבון על שלושת יסודות לסת הדגם שיחברו עם שאר הגולגולת ואת המודל היה מוגבל באופן מלאכותי במרכז לתקן את זה ב &#39;מרחב&#39;. אילוץ מלאכותי זה לא השפיע על פרשנות שאובי המודלים כמו ceratohyal עצמו לא נותח. ההכללה יותר של מבנה craniofacial, במיוחד אחרים שרירי פתיחת לסת כגון sternohyals והסחוס המצורף שלה 23, יכל להוסיף למודל, אבל מגבלות כוללות את היכולת של דגמים גדולים יותר לרוץ בתוכנת האלמנטים הסופיים. <html> s = &quot;jove_content&quot;&gt; מגבלה נוספת היא שלא אנו דגם כניסת רצועה, אם כי זו יכולה להיות מושגת על ידי ההחדרה של מעיינות 8. הנחה נוספת אחת עשתה במקרה זה הייתה שהמודל יתנהג באופן ליניארי. סדרי הגודל של זנים על המודלים היו דומים לאלו במודלים שפורסמו וכן להחיל תאים במבחנת 10,24, עם זנים להיות מתחת 3500 ומעלה -5000 μɛ מלבד נקודות מצורפות אילוץ ושרירים. לכן, הזנים על האזורים הרלוונטיים של המודל נחשבו בתוך טווח מקובל עבור מודל ליניארי. סחוס אינו מתנהג לגמרי כחומר לינארית כבר דגם בעבר כחומר poroelastic, שאפשר ניתוח של ההתנהגות הנוזלת במודל 25. הפצת נקודות המצורפת שריר בקרב צרור של בלוטות מקומיות תחלק כוחות השיא ועוד לייצג במדויק את כניסת השריר עבור שרירים מסוימים. אף אוזן גרון &quot;&gt; שימוש FE מאפשר הערכה של הזנים המדגישים מתנהגים על מבנה. כטכניקה הוא משמש לעתים קרובות בתחומי מדעי חיים רבים כולל אורתופדיה, פליאונטולוגיה וביולוגיה התפתחותית ולאחרונה. כאן אנו מתארים כיצד לבנות פס עבור דג הזברה לסת תחתונה. בעתיד המודלים האלה ניתן יהיה להרחיב להסתכל הלסת כולה, כולל את החיך. בטכניקות דומות יכולות לשמש מודל ביומכניקה שדרה בדגים, אשר עד כה בעיקר נחקרו באמצעות קינמטיקה.

דוגמנות אלמנט סופי (FE) היא טכניקה הנדסה שניתן לחשב המחשוב ולמפות את גודל ומיקום של זנים שפועלים על מבנה 1. המודל מורכב מבנה 3D, מיוצג על ידי רשת של &quot;אלמנטים סופיים&quot;, ואת התוצאה הסופית של הניתוח נשלטת על ידי מספר גורמים, כולל את המבנה ואת מספר אלמנטי הרשת, העוצמת והמיקום של המכנים המון ואת תכונות חומר. תכונות חומר לתאר היבטים מסוימים של ההתנהגות של חומר תחת סוג של עומס נתון; מודול יאנג (E) מתאר את האלסטיות של החומר תוך מקדם פואסון מתאר את הירידה המידתית ברוחב של חומר אורכו כאשר מדגם נמתח. דוגמנות FE יכול לשמש כדי לחשב מגוון רחב של משתנים ובהם עקירה, מתח, לחץ ומשחק הלחץ על מודל על ידי לקיחת בחשבון את נתוני הקלט שמייחד את מבנה &#39;; S צורה, מיקום וגדל המון ואת תכונות חומר המבוקשות. דוגמנות FE נעשה שימוש נרחב בהנדסה 2 ויותר עבור יישומים אורתופדיות 3 ו כפליאונטולוג 4. בפיתוח כוחות ביומכניים ידועים לפעול כגירוי בתאים רבים כדי להפעיל תגובות תא 5-8 וזה שימושי לחזות הוא את המיקום היחסי ואת הבהירויות של גירויים מכאניים בתוך בפיתוח מערכות איברים, לעומת זאת, כיום דוגמנות FE כבר המשמש קצת לפיתוח דג הזברה. הסחוס והעצם שניהם הוכחו להיות חומרי mechanosensitive. לדוגמא, במבחנת דחיסה נמצאה להפעיל מסלולי chondrogenic, תוך מתח הוכח להיות הכרחי עבור עצם היווצרות 9. FE הניתוח (FEA) נוצל מודל זנים הפועלים דגימות ביולוגיות, כולל הפועלים אלמנטי שלד במהלך עצם FOrmation 10. פיתוח יישומים אחרים כוללים את שימוש בו כדי לחזות את הצורה של ג&#39;וינט לאחר שהוא נחשף כוחות ביומכניים תיאורטי 11,12 וכדי להראות הדפוס של זנים נוכחים במהלך המורפוגנזה מפרק ברך חומוס 8. פרוטוקול זה נועד לשתף את החוויה של יצירת משטחים 3 ממדים, משתלב ומודלי אלמנטים סופיים מתמונות confocal עם נוף להבנת המכניקה של רקמות מתפתחות. אנחנו גם להראות דרכים של תיקוף המודלים FE אף לכידת מידע עקירה משותף אמיתי in vivo. בעוד אנו משתמשים לסת דג הזברה כדגם אותן הטכניקות יכולות לשמש על כל מערכת ביולוגית קטנה עבורו מידע 3D על המבנה של מערכת השלד והשרירים ניתן להשיג על ידי הדמית confocal או multiphoton.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="937">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coll2</td>
			<td style="width:237px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab34712</td>
			<td style="width:365px;">Type II collagen antibody - stains all cartilage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">A4.1025 / MF20</td>
			<td style="width:237px;">Developmental studies hybridoma bank</td>
			<td style="width:119px;">A4.1025</td>
			<td>Skeletal mysoin antibody - marks all skeletal muscle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Low melt agarose</td>
			<td style="width:237px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A9414-5G</td>
			<td>For mounting zebrafish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate )</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>To make anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td>T/3760/48</td>
			<td>sample permeablilisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dylight 488Mouse IgG</td>
			<td style="width:237px;">Thermofisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">35502</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dylight 550 Rabbit IgG</td>
			<td style="width:237px;">Thermofisher&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">84541</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP8/SP5 or SPE confocal</td>
			<td style="width:237px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;LAS Leica capture software&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aviso (version 7.0.0)</td>
			<td style="width:237px;">FEI Visualization Science Group</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3D image analysis software (Section 2)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10)</td>
			<td style="width:237px;">Altair Engineering</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FE model generating software (Section 4-5)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Abaqus (version 6.14)</td>
			<td style="width:237px;">SIMULIA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FE analysis software (Section 5.7-5.8)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

building finite element models to investigate zebrafish jaw biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

Immunostaining עבור שריר (איור 1 א) וסחוס (איור 1B) או הדמיה של כתבים מהונדסים (תרשים 1C) מאפשר מבנה 3D של הלסת להיות מדמיין, יחד עם השרירים הקשורים. על ידי הדמיה ברזולוציה גבוהה ניתן היה לבנות מודל לוכד הוא הצורה התל-ממדית של הלסת (איור 2) ואת המיקום ומיקום של עומסים (איור 3). ניצול ב התקות vivo לראות דרך לכיד וידאו במהירות גבוהה (איור 4) אנו מאשרים כי את טווח התנועה במודל היה בטווח מציאותי. מודלי FE פעם ריצה יכולים לשמש כדי להציג מגוון של נתונים, כגון מתח (איור 5 א), מינימום ומתח עיקרי מרבי (איור 5 ב - K). תוצאות אלו עולות שלושה עמומות<html> ensional כך המודל יכול להיות מוגדל לראות דפוסים בסדר הפירוט (איור 5E, 5i) לסובב להשיג צפיות רלוונטי (איור 5F, 5G, 5J, 5K) מחולק באופן דיגיטלי (5E איור &#39;, 5E&#39; &#39;, 5i&#39;, 5i &#39;&#39;) כדי להראות עד כמה דפוסי מתח, מתח או שינוי בלחץ לאורך כל דגם. כמו כן ניתן לחלץ נתונים כמותיים מהמודל (לא מוצג). על ידי אימות המודל באמצעות תכונות חומר המדויק ביותר, המון רשת צורת המודל FE יכול לשמש כדי לחקור את האומדן הטוב ביותר של הסביבה המכאנית נחווים על ידי תאים במהלך החלון של פיתוח. התוצאות של המודל ניתן להשוות באופן ישיר לשינויים בהתנהגות הסלולר ביטוי גנים 20. <html> בתשובה לשאלה 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54,811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1:. נציג תמונות של אלמנטי השלד של לסת דג הזברה הנמוכה ב 5 DPF ערימות confocal נציג של הלסת התחתונה של זחלי 5dpf כל מוצג עם קדמי למעלה (א) Immunostaining עבור A4.1025 אשר מכתים את כל שרירן השלד (B) immunostaining עבור קולגן סוג II המסמן את כל הסחוס (C) סטאק של פגיית חיים המבטאים את col2a1 הכתבים המהונדס: mCherry סימון סחוס (אדום) ו smyhc: שרירים איטיים GFP (ירוק). IA: הקדמי intermandibularis, PH: המד hyoideus, AM: adductor mandibulae, HI: hyoideus נח, HI: hyoideus מעולה, CH: sternohyoideus, MC: הסחוס של המקל, PQ: Palatoquadrate, CH:. Ceratohyal <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.</a> &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> איור 2: דור של משטח 3D מנתונים confocal תמונות מראות את המעבר מנתוני confocal לתוך משטח 3D עבור לסת דג הזברה הנמוכה עם גדלה גבוהה של האזור המשותף.. (א) נתונים confocal גלם; (ב) מערך נתונים לאחר היישום של מסנן גאוס; (ג) מתאר מסונן; (ד) משטח 3D. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> איור 3: משתלב נציג מראים אילוצי וקטורי כוח משתלב נציג עבור זחל 5 DPF עבור (א) סגירת פה.(ב) פתיחת פה. נקודות לבנות מציינים במקומות בהם מודל מוגבל ושבהם ממדים (למשל, x ו- y או x, y ו- z). קווים לבנים לציין עמדות שרירות, עם הווקטור בכוח השריר כונה על ידי חצים לבנים. אדום עולה סחוס צהוב interzone. נתון זה יש הבדל בין חומר משלים שפורסמו בעבר בנטל et al. 15. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> איור 4:. בדיקות רגישות FE-מודל המדמה עקירה בלסת דג הזברה 5dpf לסחוס שונים moduli של interzone יאנג. לסת עקירה (פתוח סגור מיקרומטר) מסומן על הלסת; רשם באמצעות מקש הצבע. כל דגם (A - L) יש שילוב שונה של סחוס (c = 1.1, 3.1, או 6.1 MPA) או interzone (i = של 0.25, 0.5, 0.75, או 1 נכסים MPA). חץ שחור אופקי מדגיש את הערך של עקירת בלסת בקצה של הסחוס של המקל (המיוצגים על ידי החץ השחור האנכי). M ו- N סטילס מתוך וידאו של 5 DPF מינימום מראה זחלים, כלומר, לסת סגורה (M) ומקסימום, כלומר, לסת פתוחה לגמרי (N) עם שני גבים (O) - קו לבן על O מייצגת את העקירה (43 מיקרומטר). יחסית במקרה זה תכונות סחוס של 1.1 עם interzone של 0.25 (א) ההתאמה הטובה ביותר התקות לראות דגים חיים (O). לוחות AL של נתון זה פורסמו בעבר בנטל et al. 15. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג vers גדול</a>יון של נתון זה. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> איור 5: נציג נתונים מהמודלים FE סימולציה FE-מודל של כל השרירים מיושם 5 DPF הזחל (A - C).. (א) פון מיזס (EMaxmin) (B) זן עיקרי מינימום (E Min. P, μɛ) (ג) זן העיקרי מקסימלי (E מקס. פ, μɛ). FE-מודל סימולציה של זנים עיקריים מינימום ומקסימום במהלך פתיחת הלסת. (D - K): זן עיקרי מקסימאלי (. E מקס פ, μɛ) (ד) צפה לסת גחון (E) נוף משותף גחון (E) מציג את המיקום של חלקים הפרוקסימלי-דיסטלי דרך הסחוס של המקל משותף ואת interzone ב (E &#39;) ו- (ה&#39; &#39;), בהתאמה. (F): לרוחבלסת בעלת נוף. (G): נוף משותף לרוחב. (H - K): זן עיקרי מינימום (. E Min P, μɛ) ב (H) גחון לסת הצגה (I) נוף משותף גחון. (אני) מציג את המיקום של חלקים הפרוקסימלי-דיסטלי דרך משותפת הסחוס של מקל ו interzone ב (אני) ו (אני &#39;&#39;) בהתאמה (J): נוף הלסת לרוחב. (K): נוף משותף לרוחב. נתון זה כבר פורסם בעבר בנטל et al. 15. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> מספר סיבי שריר </td><td> שריר סיבים באזור (מיקרומטר 2) </td><td> שרירים באזור הקבוצה (מיקרומטר2) </td><td> חיל (N) </td></tr><tr><td> 5 DPF intermandibularis קדמי </td><td> 5 </td><td> 23.8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF מד hyoideus </td><td> 6 </td><td> 23.8 </td><td> 142.8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF adductor mandibulae </td><td> 9 </td><td> 23.8 </td><td> 214.2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> שולחן 1: כימות שרירים. לפי חישוב כוחות שריר הממוצע עבור Anterior Intermandibularis, adductor Mandibulae ואת זוית Hyoideus ב 5 DPF באמצעות 40 ננ / מיקרומטר 2 (ערך ליחידת שטח שנלקח התייחסות 17). (Lorga et al., 2011) (n = 3).

Watch this Scientific Journal Video about Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics at JoVE.com

בניית מודלים של אלמנטים סופיים כדי לחקור את הביומכניקה של הלסת של דג הזברה | ביולוגיה התפתחותית | וִידֵאוֹ

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

בניית מודלים אלמנטים סופיים לחקור ביומכניקה לסת דג הזברה

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

building-finite-element-models-to-investigate-zebrafish-jaw

Microsoft Bing

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Human Biology

Musculoskeletal System

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K Views.  University of Bristol. Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw. 

Video: Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of &#946;-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

A primary culture of bovine corneal endothelial cells was used to investigate the mechanism of corneal endothelial-mesenchymal transition. Furthermore, a rat corneal endothelium cryoinjury model was used to demonstrate corneal endothelial-mesenchymal transition in vivo.

במבחנה מודלים Vivo ללמוד קרנית האנדותל-mesenchymal מעבר

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

ניתוח של כלי דם כליליים ב הותרו עוברי לבבות

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological problems after stroke and is shown to impair neurogenic processes. Interestingly, the adult zebrafish has recently emerged as a relevant and useful model to mimic hyperglycemia/diabetes and to investigate constitutive and regenerative neurogenesis. This work provides methods to develop zebrafish models of hyperglycemia to explore the impact of hyperglycemia on brain cell proliferation under homeostatic and brain repair conditions. Acute hyperglycemia is established using the intraperitoneal injection of D-glucose (2.5 g/kg bodyweight) into adult zebrafish. Chronic hyperglycemia is induced by immersing adult zebrafish in D-glucose (111 mM) containing water for 14 days. Blood-glucose-level measurements are described for these different approaches. Methods to investigate the impact of hyperglycemia on constitutive and regenerative neurogenesis, by describing the mechanical injury of the telencephalon, dissecting the brain, paraffin embedding and sectioning with a microtome, and performing immunohistochemistry procedures, are demonstrated. Finally, the method of using zebrafish as a relevant model for studying the biodistribution of radiolabeled molecules (here,[18F]-FDG) using PET/CT is also described.

This work describes methods to establish acute and chronic hyperglycemia models in zebrafish. The aim is to investigate the impact of hyperglycemia on physiological processes, such as constitutive and injury-induced neurogenesis. The work also highlights the use of zebrafish to follow radiolabeled molecules (here, [18F]-FDG) using PET/CT.

מודלים חריפים כרוניים של היפרגליקמיה דג הזברה: שיטה להעריך את ההשפעה של היפרגליקמיה על נוירוגנזה ועל ביודיסטריבוצי של מולקולות Radiolabeled

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

הקמתה של הזחל דג זברה כמודל חיה כדי Investigate Trypanosoma cruzi תנועתיות Vivo ב

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

כריתה של ספרות עכבר למבוגרים והתחדשות: מודל פשוט כדי לחקור ממגי בלסטאמה היווצרות הIntramembranous פיקציה

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

מתרגם הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) כדי לחקור את התפתחות השורש של הספר הבסיסי בקנה מידה ספציפי לסוג תא

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...