저자는 또한 제조 및 cDNA를과의 shRNA 벡터를 neogenin의 구조를 공유 조지아 건강 과학 대학에서 박사 시옹의 그룹을 인정하고 싶습니다. 본 연구는 한국 연구 재단의 자금을 지원 기초 과학 연구 프로그램 (2013R1A1A4A01012572)에서 보조금과 삼육 대학에서 연구비에 의해 지원되었다.

참고 : 동물 사육과 염려에 관한 모든 절차는 삼육 대학교, 서울, 대한민국의 IACUC 규정에 따라 실시 하였다. 1. 과배란, 육성 난관 격리 <ol><li> 다음과 같은 조건에서 근친 C57BL / 6 마​​우스 유지 : 22 ± 3 ° C ~ 60 % 습도, 12 시간 빛 / 어둠주기, 물과 음식 광고 무제한입니다. </li><li> 0.1 ml의에서 5 IU 임신 암말 혈청 성선 자극 호르몬 (PMSG)의 복강 내 주사에 의해 3-5주 된 여성 생쥐의 과배란을 유도 / 머리는 0.1 ml의에서 5 IU 인간 융모 성 성선 자극 호르몬의 복강 내 주사 (hCG의)에 의해 48 시간 이상 이어 /머리. </li><li> 즉시 hCG의 주입에 따라, 하룻밤 같은 케이지에서 그들을 유지하여 동일한 균주의 성적으로 성숙한 남성으로 과배란 유도 여성을 짝. </li><li> 다음날 아침, 여성 생식기의 정합 플러그 또는 질 플러그의 존재에 의해 성공적인 짝짓기를 확인한다. </li><li> 임신 여성 쥐를 희생CO에 의해 2 중독은 hCG의 주입 후 자궁 전위 18 ~ 20 시간 뒤에. </li><li> 피부와 다음 미세 가위로 복막 층을 절단하여 복강을 엽니 다. </li><li> 미세 집게와 자궁 뿔을 들고 체강에서 조심스럽게 자궁, 난관, 난소, 지방 패드를 멀리 당기십시오. </li><li> 난관 미세 가위로 난소 사이의 영역을 잘라. 첨부 된 자궁의 상부 중 적어도 1cm를 떠나, 포셉 위치를 조정하고 난관 근처의 자궁을 잘라. </li><li> 실온에서 M16 매체를 포함하는 35mm 페트리 접시에 oviductal 팽대부 전송. 같은 접시에 여러 생쥐의 난관을 풀. </li><li> 배아의 검색을위한 실체 현미경 아래에 접시를 놓습니다. </li></ol> 2. 검색 2- 전핵의 배양 (2-PN) 배아 <ol><li> , 30 또는 32 G 피하 주사 바늘의 끝을 잘라 무딘 끝으로 갈기, 그리고 플러싱 바늘로 사용합니다. </li><li> 용도미세 집게는 플러싱 바늘에 난관의 끝을 밀어합니다. 조심스럽게 제자리에 고정 할 수있는 접시의 바닥에 대한 플러싱 바늘의 끝을 누릅니다. M16 매체의 0.1 ㎖를 페트리 접시에 2 PN 배아를 분리합니다 ~와 난관을 플래시합니다. </li><li> 멸균 유리 피펫을 사용하여 새로운 배양 접시로를 전송할 실체 현미경 아래에서 플러시 M16 매체에서 운 질량을 주변과 함께 2-PN의 배아를 복구 할 수 있습니다. </li><li> 50-10 분 동안 37 ° C에서 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)에서 0.1 ~ 0.5 %의 히알루로 1.0 ㎖의 효소 적 절단에 의해 2 PN 배아에서 운 세포 해리. </li><li> 부드럽게 유리 피펫 및 난구 세포의 물리적 제거와 피펫 팅에 의해 배아를 박탈하다. </li><li> 배아 당 신선한 인산염 완충 식염수 (PBS)의 30 ~ 50 ml의 무 결함 배아 세 번 씻으십시오. </li><li> 10 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA, Fract 보충 M16 미디어에서 35mm 플라스틱 페트리 접시에 배아를 품어이하 4 시간 후에 일반적으로 마이크로 인젝션이 이루어질 때까지 가습 인큐베이터에서 5 % CO 2, 37 ℃에서 이온 V). </li></ol> 3. 배아 역전사 (RT)와 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) <ol><li> 포배기까지의 각 단계에서 적어도 10 배아 모아서 역전사 효소, RNA 분해 효소 억제제, 올리고 DT 프라이머 랜덤 6mers,의 dNTP 혼합물을 함유 효소 미리 혼합액 역방향 배 4.0 μL 그들을 수영장,에 반응 완충액 PCR 튜브. </li><li> W. 95 ° C에서 5 분 동안 배양 한 다음, 1 시간 동안 42 ° C에서 즉시 RT 반응을 개시 (200)에서 30 초 동안 풀링 된 배아를 20 ㎕의 총 부피의 RNase가없는 증류수 H 2 O를 첨가하고 초음파 처리. </li><li> 생성 된 cDNA 솔루션의 각 5.0 μl를 들어, neogenin을위한 프라이머와 일반 PCR 증폭을 실시, CDX2는, Sox2이는 Tead4는, Nanog를이 Oct3 / 4, β - 굴지 (프라이머 서열은 표에 주어진 </strong&gt; 1. PCR은 95 ℃에서 15 초 동안 배양 40 사이클 구성, (표 1) 소둔 온도에서 30 초, 72 ℃에서 30 초. </li><li> 2 % 아가 로스 겔상에서 전기 영동에 의해 분리 된 PCR 제품, 에티 디움 브로마이드로 염색 한 후, UV 광 하에서 겔을 시각화. </li><li> β - 굴지 수준에 대한 표적 유전자의 발현을 정상화. </li></ol> 태아의 면역 세포 화학 (4) <ol><li> PBS에 0.​​01 % BSA를 함유하는 짧은 세척하여 세 번을 실온에서 30 분 동안 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데히드와 각 단계에서 배아를 수정. </li><li> 10 분 동안 실온에서 0.1 % 트윈 20, 0.1 % 트리톤-100을 함유하는 PBS 1.0 ㎖에 10 배아를 배양하여 Permeabilize 하시려면 세포막. </li><li> 1.0 ml의 PBS에 투과성이 배아 부화 비특이적 블록을 실온에서 30 분 동안 10 % 정상 염소 혈청. </li><li> 차단 된 배아의 재치를 품어1에서 시간 토끼 안티 neogenin 항체 : PBS 100 희석 밤새 4 ° C에서 0.1 % BSA를 포함. </li><li> PBS의 방울에서 30 초마다 세 세척 한 후, 1 알렉사 488 결합 염소 항 - 토끼 IgG의 또는 알렉사 568 결합 염소 항 - 토끼 IgG의 하나와 배아를 배양 : PBS / BSA 용액 500 희석 4 ° C에서 하룻밤 . </li><li> 액틴 필라멘트를 시각화하고 실온에서 1 시간 동안 PBS에 1 μg의 / ㎖의 팔로이 딘에 배아를 배양한다. </li><li> PBS는 실온에서 5 분간 1 μg의 / ㎖의 DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-페닐 인돌, 다이 하이드로 클로라이드)를 함유하는 5 mL를 첨가하여 핵을 염색. </li><li> 워시는 PBS로 세 번 짧게 배아. </li><li> 유리 슬라이드에 배아를 전송 및 미네랄 오일 방울을 커버. </li><li> 적절한 파장의 여기와 공 초점 현미경으로 1000 배 배율에서 이미지를 가져 가라. </li></ol> Neogenin-RFP 및 Neogenin-siRNA를 GFP 플라스미드 5. 준비 <ol><li> 보결cDNA를 빨간색 형광 단백질 (RFP), 벡터를 함유 neogenin 플래그 - RFP의 결과로 마우스 neogenin을 인코딩 복제. </li><li> 에메랄드 녹색 형광 단백질 (EmGFP), 벡터를 함유 pcDNA 벡터 - EmGFP-은 miR-neogenin의 결과로 neogenin 대상으로 작은 헤어핀 RNA를 서브 클로닝 (그림 1). </li><li> neogenin 플래그 - RFP 및 pcDNA 벡터 - EmGFP-은 miR-neogenin 플라스미드를 모두 증폭하고 기존의 방법으로 그들을 정화. </li><li> 플라스미드의 최종 농도를 조정에 ~ 멸균 트리스 - EDTA (TE) 버퍼 / ㎖ 1.0 μg의. </li></ol> 2-PN 배아에 플라스미드 6. 미세 주입 <ol><li> 신선한 M16 매체와 짧게 한 번 무 결함이-PN의 배아를 씻으십시오. </li><li> 전핵의 관찰이 가능하도록 테이블 탑 원심 분리기에서 1,000 × g으로 10 분간 2 PN 배아를 원심 분리기. </li><li> additi 5 % CO 2에서 37 ° C에서 미네랄 오일 아래 M16 배아 당 매체의 20 내지 30 μL의 미세 드롭 배아 부화도 그러 1-2 시간. </li><li> 붕규산 유리 모세관 튜브를 당겨 주입 피펫을 들고 피펫 제조 (OD = 1.2 mm를, ID = 0.94 mm) 기계 풀러와 함께. </li><li> microgrinder 및 microforger를 사용 무딘 팁과 &lt;500 μm의 팁 길이와 1 ~ 2 μm의 팁 내경 연마 구멍을 가지고 주입 피펫을 제조. </li><li> 그들은 20 ㎛, 내경 100 ㎛, 외경 무딘 팁 연마 개구를 갖도록 피펫 들고 제조. </li><li> 1.0 μg의 / μL에서 플라스미드 솔루션의 충분한 양의로드 주입 피펫 (&gt; 200 NL). </li><li> Microinject ~ 전동 micromanipulator에 부착 된 마이크로 인젝터를 사용 전핵 중 하나에 각각 2 PN 배아 용 플라스미드 용액 10 PL; 이 과정에서 보유 피펫 부압을 적용하여 위치 배아를 유지한다. </li><li> 미세 주입 한 후, 난 신선한 M16 매체와 2 PN 배아 3 회 세척1 분마다 시간보다 ESS. </li><li> 배양기 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일 방울에 의해 덮여 플라스틱 배양 접시에 신선한 M16 매체의 드롭 2 PN 배아. </li><li> 미분 간섭 대비에서 24 시간 간격 (DIC) 200X 배율에서 거꾸로 현미경에서 배아를 관찰한다. </li></ol>

<ol>
	<li>Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+molecular+regulation+of+the+mouse+blastocyst.">Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst.</a> Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).</li><li>Sasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+trophectoderm+fate+specification+in+preimplantation+mouse+development.">Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development.</a> Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).</li><li>Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tead4+is+required+for+specification+of+trophectoderm+in+pre-implantation+mouse.">Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse.</a> Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).</li><li>Ovitt, C. E., Sch&#246;ler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+Oct-4+in+the+early+mouse+embryo.">The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo.</a> Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Oocyte+Microinjection,+Maturation+and+Ploidy+Assessment.">Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment.</a> J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).</li><li>Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mouse+blastocyst+genes+that+are+down+regulated+by+double-stranded+RNA-mediated+knockdown+of+Oct-4+expression.">Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression.</a> Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).</li><li>Khang, I., Sonn, S., Park, J. -. H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithin+in+mouse+preimplantation+development:+Its+role+in+compaction.">Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction.</a> Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).</li><li>Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+DNA-Specific+Stain+Methyl+Green+in+the+Fluorescent+Labeling+of+Embryos.">Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos.</a> J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).</li><li>Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neogenin+as+a+receptor+for+early+cell+fate+determination+in+preimplantation+mouse+embryos.">Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos.</a> PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).</li><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).</li></ol>

저자는 공개 경쟁 금융 이익을 더이 없습니다.

본 프로토콜에서, 우리는 마우스 배아 초기의 세포 분화에 neogenin의 역할을 탐구하는 2-PN 마우스 배아에 유전 물질의 미세 주사의 새로운 방법, cDNA를 또는 shRNA를 하나를 보여줍니다. 착상 전 배아의 유전자 변형은 예를 들어 대한 기본 분자 메커니즘, 첫 번째 셀의 혈통 결정에 대한 주요 정보를 폭로에서 강력한 기술이다. 유전 적 변형은 유전자의 기능을 확인하는 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나이다. 해외 유전 물질에 대한 2-PN 배아 및 2-PN 배아로의 cDNA와의 shRNA의 미세 주사의 타당성의 비교적 큰 receptibility으로,이 배아 조작 기술은 고유 말할 것도없고, 배아에 최소한의 물리적 방해로 구현 될 수있다 이 유전자 조작과 관련된 보완. 그 세포질 주입을 고려하면 더 쉽고 덜 해로운핵 주입보다 생존하지만, 그럼에도 불구하고, 강조되어야 핵 주입과 연관된 외래 DNA의 높은 발현 한 개선이 핵 내로 마이크로 인젝션 전에 전핵 위치 원심 분리의 사용이다. 가장 기술적으로 복잡하고 까다로운 단계는 수정 된 난자의 전핵에 외래 DNA의 미세 주입입니다. 이 단계는 중요하며 상당한 기술적 능력과 미세 주입 과정을 마스터하기 위해 광범위한 훈련이 필요합니다. 이 기술은 그러나 인수되면, 기술 변화 및 ​​오류 최소화된다. 미세 주입 배아의 일상 생존은 우리 시설에서 80-90% 사이입니다. 본 연구는 달리, 다른 연구자들은 세포막 근처 전핵이 미세 가까이가되도록 피펫을 유지함으로써 배아 위치. 미세 바늘 후 전핵 10,11 삽입된다. 우리는 프로를 시각화 어려움을 경험제대로 원심 분리하지 않고 현미경 핵. 물론, 원심은 더 나은 식별을 위해 세포막에 핵 주변을 제공합니다. 동시에, 전핵의 더 나은 시각화 따라서 측위 개선의 여지가있을 것이다. 형질 전환 마우스의 생산과는 달리, 배아로 플라스미드의 미세 주입을위한 우리의 프로토콜은 자연에 의해 일시적 형질이며, 착상 전 배아 개발하는 동안 유전자 기능을 해부를위한 따라서 적합하다. 따라서, 고 우리의 loss-을위한 프로토콜 및 기능 획득 기술은 더 초기 배아 발달에 관여하는 분자 신호 식별하기 위해 일반화 될 수 있습니다. neogenin 및 리간드는 Oct3 / 4, Sox2이 한 Nanog를 같이 줄기 세포의 특정 전사 인자를 향상시키는 경향이 있다는 또한 neogenin 시그널링은 주어진 배아 줄기 세포주의 개발에 매우​​ 유용 할 수있다.

착상 전 배아 발달이 상실 배와 배반포로 한 세포 단계에서, 여러 가지 구별되는 단계로 나눌 수있다. 많은 증거가 극성 위치 단서가 trophectoderm (TE) 및 내부 세포괴 (ICM)에 이른 세포 운명 결정에 중요한 역할을 제안합니다. 그러나, 셀룰러 신호로 형질 도입 방법을 단서의 특성 및 생리적 컨텍스트는 이러한 신호들은 알려지지 않은 세포 계통의 분화를 개시 할 수있다. 이 분화 된 세포는 태반 1-3의 배아 적절한 형성과 성장에 필요한 특성 구조와 기능에 걸릴 시작, 전문화를 받다. 착상 전 배아의 siRNA 또는 표적 cDNA의 변성 등의 유전 재료의 직접적인 주사에 의한 조작에 특히 순종하며, 따라서 특정 표적 분자를 연구하는데 이용 될 수있다. 유전이 성장 이해가척추 동물 배아의 분석은 배아 발달 4에 대한 우리의 이해를 발전에 매우 중요합니다. 적시 문맥 배아 내로 야생형 유전자 또는 돌연변이 형태의 정밀한 도입 이득 - 또는 기능 상실 유전자 크게 발달 조절 유전자에 대한 연구를 촉진했다 수행한다. Loss- 및 이득의 기능 개별 이른 비 포유 동물과 포유 동물의 배아에 유전 물질의 미세 주입을 통해 이유로 인해 그들의 큰 크기와 큰 감수성 (5)의 상대적으로 간단하다. 마이크로 인젝션은 전형적으로 비 - 바이러스 성 벡터를 사용하여 수행된다. 특별한 장점은 바이러스 벡터 및 유전자 위에 비 바이러스 성 벡터를 사용의 용이성이 고려되어왔다. 마우스 배아 급격한 loss- 또는 기능 획득 발현 시스템은 우리 해부 척추 동물 배아 -6,7- 유전자 기능을 이해할 수 있도록 개발되어왔다. 배아의 형광 라벨이 크게 MICR의 선택을 용이하게 할oinjected 또는 유 전적으로 조작 된 배아를 동시에 간접 형광 강도 (8)에 기초하여 마이크로 인젝션의 siRNA 또는 cDNA의 발현 수준을 정량 할 수있는 수단을 부여. 이 라벨 형광 단백질 cDNA를, GFP 또는 RFP를 달성하기 위해 공동 주입 융합 구조물 또는 별도로 하나 같다. GFP 또는 RFP의 형광 강도는 loss- 보장 또는 기능 획득 이루어진 것으로하기의 siRNA 또는 외부 DNA의 발현의 정도를 보여준다. 여기, 우리는 우리가 착상 마우스 배아의 초기 세포 분화에 중요한 세포 외 신호를 중계하는 수용체로 neogenin 식별 할 수 loss- 이득 외 기능 기술에 대한 미세 조작 프로토콜을 제시한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1507">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">M16 medium,</td>
			<td style="width:519px;">Gibco BRL (Grand Island, NY)</td>
			<td style="width:232px;">M7292 LOT# 11A832</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Goat serum,&#160;</td>
			<td style="width:519px;">Dako (Glostrup, Denmark)</td>
			<td style="width:232px;">X0907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">PMSG</td>
			<td>Folligon, Intervet, Holland</td>
			<td style="width:232px;">G4877-1000IU LOT#SLBD0719V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Mineral olie</td>
			<td style="width:519px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:232px;">CG5-1VL LOT# SLBC6783V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin&#160;</td>
			<td style="width:519px;">(Intervet, Holland)</td>
			<td style="width:232px;">(invitrogen , 15596-026)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">SuperScript&#174; III Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:519px;">lifetechnologies</td>
			<td style="width:232px;">18080-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">PCR pre mixture</td>
			<td style="width:519px;">&#160;(Bioneer, Daejon, S. Korea)</td>
			<td style="width:232px;">GenDEPOT , A0224-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Agarose (molecular grade)</td>
			<td style="width:519px;">BioRad</td>
			<td style="width:232px;">161-3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
			<td style="width:519px;">Affymetrix USA</td>
			<td style="width:232px;">19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">polyclonal rabbit anti-neogenin antibody</td>
			<td style="width:519px;">Santa Cruz Biotechnology, US</td>
			<td style="width:232px;">SC-15337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:519px;">Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td>
			<td style="width:232px;">A-11094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:519px;">Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td>
			<td style="width:232px;">A-21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Alexa Fluor&#174; 555 Phalloidin</td>
			<td style="width:519px;">Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td>
			<td style="width:232px;">A34055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:519px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:232px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin</td>
			<td style="width:519px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:232px;">3720-RG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:496px;">all plasmid constructs&#160;</td>
			<td style="width:519px;">Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA).</td>
			<td style="width:232px;"></td>
			<td>the present studies were kindly provided by&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Neon&#174;&#160; Transfection System</td>
			<td style="width:519px;">lifetech</td>
			<td style="width:232px;">MPK10096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Stereo Microscrope</td>
			<td style="width:519px;">Nikon</td>
			<td style="width:232px;">SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Micromainpulation system with Nikon</td>
			<td style="width:519px;">Nikon</td>
			<td style="width:232px;">Narishige ONM-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">MicroInjector</td>
			<td style="width:519px;">Nikon Narishige</td>
			<td style="width:232px;">GASTIGHT #1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Holder</td>
			<td style="width:519px;">Nikon Narishige</td>
			<td style="width:232px;">Narishige IM 16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Microfoge</td>
			<td style="width:519px;">Nikon Narishige</td>
			<td style="width:232px;">Narishige MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">grinder</td>
			<td style="width:519px;">Narishige</td>
			<td style="width:232px;">EG400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Puller</td>
			<td style="width:519px;">Sutter Instrumnet company</td>
			<td style="width:232px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:519px;">Thermo Scientific Forma</td>
			<td style="width:232px;">EW-39320-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:496px;">Veriti&#174; 384-Well Thermal Cycler&#160;</td>
			<td style="width:519px;">lifetechnologies</td>
			<td style="width:232px;">4388444</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

loss- and gain-of-function approach to investigate early cell fate determinants in preimplantation mouse embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

우리는 neogenin이 일시적으로 초기 2 셀 단계에서와 같은 지속적인 초기 상실 배까지 등장하지만 후반 상실 배와 배반포 단계 (그림 2A)에서 결핍되고, 착상 마우스 배아의 초기 발달 단계에서 표현된다 발견했다. 또한 neogenin의 공간 분포는 주로 외부 세포로 제한 하였다. RT-PCR 분석의 결과는 4- 세포 단계 고점하지만 완전히 이상 (도 2b)를 16 세포 단계에서 부족하거나, neogenin 발현 초기 과도 특성과 일치 하였다. 반면, F - 굴지는 일시적인 및 편광 식 패턴을 공개하지 않았다. 우리는 다음 neogenin 수준이 로스 neogenin (shRNA를가 neogenin 대상으로 숨겨 neogenin cDNA를 벡터 (neogenin 이득) 또는 벡터 중의 미세 주입에 의해 조작 될 수 있는지 조사2 PN의 접합체로 S). 시각적으로 neogenin 손실, RFP에서 neogenin 이득을 차별화하고 GFP이었다에 표시 (그림 3)로 공동 표현하고 발현 수준 neogenin 발생하는 것은 면역에 의해 (그림 4) 면역 블 모두에 의해 확인되었다. 그림 5는 2-PN 단계에서 shRNA를 neogenin 또는 cDNA를 neogenin 중 하나를 수신 한 후 각 단계에서 배아의 대표 이미지를 보여줍니다. neogenin 손실과 neogenin 이득 배아와 배반포 단계 (표 2) 때까지 적어도 더 발달 전위차 사이에 명백한 심한 형태 학적 차이가 없었다. 사실, 각 단계에서 생존 한 배아의 개수 및 체포 배아의 개수는 모두 유의 한 차이가 없었다. 그러나, ICM 개발이 덜으로 이득 배아를 neogenin보다 neogenin 손실을 발음했다neogenin 이득 배아 (그림 6A)에 Oct3 / 4 ICM 고유의 높은 발현에 의해 neogenin 손실 배아 (그림 6B)보다 neogenin 이득 배반포 당 Oct3 / 4 긍정적 인 ICM 세포의 높은 숫자에 의해 입증. 또한, RT-PCR 분석은 표현의 세 가지 전사 인자의 수준과 neogenin의 사이에 강한 상관 관계를 밝혔다. neogenin 손실 포배에서 작은 Oct3 / 4, Sox2이 한 Nanog를 제어 배아 (도 6C) 위에 neogenin 이득 세 전사 인자의 발현을 크게 증가 대조적 인 검출 하였다. 예기치 않게, CDX2 및 Tead4의 발현은 전사 인자가 TE 분화 / 유지 -6,7- 연루 적은 상향 조절 neogenin의 전사 ICM 특정 레귤레이터하지만의 활성화에 이르게하는 것이 검증, neogenin의 발현에 의해 영향을 받았다 하지 TE의 설립. 표시된 모든 데이터는 m이다<html> 참조 9에서 odified. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53696/53696fig1.jpg" /> 그림 1 :의 구조 pcDNA 벡터 - EmGFP-은 miR-neogenin. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53696/53696fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53696/53696fig2.jpg" /> 그림 2 :. 마우스 배아 개발하는 동안 Neogenin의 식 (A) 다른 발달 단계에 착상 전 배아에서 neogenin 표현의 공 초점 현미경 이미지. (B) 다른 발달 단계에서 착상 전 배아 neogenin mRNA를 역전사 중합 효소 연쇄 반응. β 액틴 내부 대조군으로 이용 하였다.96fig2large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53696/53696fig3.jpg" /> 그림 3 :. 녹색 형광 단백질 (GFP)과 빨간색 형광 단백질 (RFP) 각각 Neogenin 손실 및 Neogenin 이득에 대한 지표 등의 식으로 RFP를 형질 neogenin cDNA를 벡터의 복합 GFP 또는 미세 주입을 형질 neogenin 타겟팅의 shRNA 벡터의 미세 주입 한 후 2 PN의 접합체, 및 RFP GFP의 발현은 2 셀 및 4 셀 단계에서 형광 현미경으로 시각화 하였다. 왼쪽 패널, 위상차 이미지; 중간과 오른쪽 패널, 형광 이미지. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53696/53696fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4"SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 53696 / 53696fig4.jpg&quot;/&gt; 그림 4 :. shRNA를가 Neogenin 또는 Neogenin cDNA를 대상으로 하나의 미세 주입 한 후 배반포에서 Neogenin의 식 (A) 2-PN의 접합체로 neogenin 타겟팅의 shRNA 벡터의 미세 주입 한 후, 각각의 배반포 세포에서 neogenin의 발현 수준으로 평가 하였다 안티 - 플래그 항체와 면역 염색. shRNA를 벡터는 (제어) 미세 주입 된 neogenin 왼쪽 패널에서 스크램블. 오른쪽 창에서 neogenin 타겟팅의 shRNA 벡터를 미세 주입 하였다. DAPI는 DAPI (청색) 핵을 염색하기 위해 사용되었다; 안티 - 플래그, neogenin에 플래그 태그의 시각화 (빨간색); GFP, 녹색 형광 단백질 (녹색) 합병, DAPI, 안티 - 플래그 및 GFP의 중첩. (B) 포배의 전 세포 용 해물을 항 - 플래그 항체 immunoblotted 하였다. GFP는 로딩 대조군으로 사용 하였다. shRNA를 스크램블, shRNA를 주입 neogenin 스크램블링 잉 shRNA를, neogenin 타겟팅의 shRNA injec<html> 기. (C)가 neogenin cDNA를 벡터 또는 neogenin-shRNA를 타겟팅 벡터는 2 PN의 수정란에 미세 주입시키고, 생성 된 포배는 neogenin 발현 수준을 측정하기 위해 항 neogenin 항체로 면역 염색을 실시 하였다. 상단 패널에서 neogenin 타겟팅 shRNA를 주입했다. 배반포는 안티 neogenin 항체 (적색)으로 면역 염색 하였다. GFP, 녹색 형광 단백질 (녹색) 합병, DAPI, 안티 neogenin 및 GFP의 중첩. 하단 패널에서 neogenin cDNA를 벡터를 미세 주입 하였다. 포배는 반 neogenin 항체 (녹색)으로 면역 염색 하였다. DAPI, DAPI 핵 얼룩 (파란색) RFP, 적색 형광 단백질 (빨간색); 합병, DAPI, RFP, 및 안티 neogenin의 중첩. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53696/53696fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> PLOAD / 53696 / 53696fig5.jpg &quot;/&gt; 그림 5 : 배아 개발에 Neogenin 손실 또는 이득의 효과. 2-PN 마우스 배아는 작은 헤어핀 RNA (shRNA를) (손실 neogenin) neogenin 대상 또는 cDNA를 (neogenin 이득) neogenin 숨겨 벡터와 중 미세 주입하고, 배반포 단계에 도달 할 때까지 배양 하였다. neogenin 이득 배아에서 neogenin 손실을 구분하기 위해, GFP 및 RFP는 각각 공동으로 표현 하였다. 위상차 다른 발달 단계에서 배아의 이미지가 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53696/53696fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53696/53696fig6.jpg" /> 그림 6 :. Neogenin 과발현은 ICM 차별화 배반포에서 (A) ICM 세포 Oct3 / 4에 대한 면역 염색 볼 하였다 호의. DAPI는 역에 사용핵이다. (B) 제어, neogenin 손실 및 neogenin 이득 배아의 배반포에서 Oct3 / 4 양성 ICM 세포의 수는 각 실험에 사용 적어도 10 배아와 3 개의 독립적 인 실험에서 SEM 평균 ±로 표시됩니다. * 학생의 t의 -test로 P &lt;0.05에서 컨트롤에서 유의 한 차이. neogenin 손실, neogenin 이득 및 제어 배아의 배반포에서 Oct3 / 4, Sox2이, Nanog를, CDX2, 및 Tead4의 mRNA의 (C) RT-PCR 분석. β - 굴지는 내부 통제로 사용되었다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53696/53696fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/53696/53696table1.jpg" /> 표 1 : RT-PCR에 사용 된 프라이머와 PCR 조건의 시퀀스. <img alt= &quot;표 2&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 53696 / 53696table2.jpg&quot;/&gt; 표 2 : 2-PN 단계에서 Neogenin의 shRNA 또는 Neogenin cDNA를 수신 한 후 각 개발 단계에서 마우스 태아를 생존의 수입니다.

Watch this Scientific Journal Video about Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos at JoVE.com

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

이 프로토콜의 목표는 loss-을 설명하고 이득의 trophectoderm 및 착상 마우스 배아의 내부 세포 덩어리 분화에 이르게 무대 특정 수용체​​로 neogenin 확인할 적용 기능 방법입니다.

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

loss-gain-function-approach-to-investigate-early-cell-fate

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.7K 조회수.  Dankook University.  이 프로토콜의 목표는 loss-을 설명하고 이득의 trophectoderm 및 착상 마우스 배아의 내부 세포 덩어리 분화에 이르게 무대 특정 수용체​​로 neogenin 확인할 적용 기능 방법입니다. 

비디오: Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, cell culture has been widely used in developmental biology studies. However, it is important to determine whether in vitro cultured cells truly represent in vivo cell types. Grafting cells into embryos, followed by an assessment of their contribution during development is a useful method to determine the potential of in vitro cultured cells. In this study, we describe a method for grafting cells into a defined site of early postimplantation mouse embryos, followed by ex vivo culture. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing precise localization and adjustment of the number of cells receiving exogenous DNA with both high transfection efficiency and low cell death. These techniques, which do not require any specialized equipment, render experimental manipulations of the gastrulation and early organogenesis-stage mouse embryo possible, allowing analysis of commitment in cultured cell subpopulations and the effect of genetic manipulations in situ on cell differentiation.

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

연구

발생학

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

의 사체 프로파일 링<em&gt; 생체</em2 색의 마이크로 어레이 플랫폼을 사용하여&gt; 제작 소 착상 전 배아

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

마우스 Preimplantation 배아에서 줄기 세포 라인의

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

마우스에서 초기 임신 특성에 대 한 3 차원 높은-주파수 초음파의 새로운 사용

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...