LHBは、ウェルカム・トラスト動的セルの博士課程のプログラムによって資金を供給されました。 KARは、MRCプロジェクトの助成金によって賄われていたMR / L002566 / 1（EJR及びCLHに授与）とCLHは、我々はまた、イメージング・アドバイスウォルフソンバイオイメージング施設に感謝したいと思いARUKグラント19479.によって賄われていました。

プロトコル内のすべてのステップは、ブリストル大学の動物のケアの福祉ガイドラインや英国内務省のものに従ってください。 筋骨格解剖学の1可視化注：筋肉を定量化するために、筋肉の添付ファイルの正確な配置を識別するために、骨格要素の形状を可視化するために、免疫染色（セクション1.1）（筋肉を明らかにする）骨格筋ミオシンのための適切な年齢で魚やII型コラーゲン（可視化します軟骨）。筋肉の添付ファイル（1.2節）の位置を視覚化するために、GFP 15：軟骨と遅いミオシン重鎖レポーターsmyhcを可視化するためにmCherryを13,14：別の方法として、例えば、コラーゲンa1のレポーターCOL2A1トランスジェニック蛍光レポーターラインを使用して、筋骨格解剖学を視覚化します。 軟骨や筋肉をマーク代替行が等しく十分に仕事ができます。 <ol><li> 蛍光Immunostaining <ol><li> 1時間、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で、過剰の4％パラホルムアルデヒド（PFA）で幼虫を固定します。 0.1％のTween 20（PBT）を含むPBSで洗浄し、それぞれ5分間、PBT中の50％メタノール（MeOH）で100％MeOHに脱水。 注意：PFAは毒性があり、材料安全シートに従って処理する必要があります。 注：必要になるまで幼虫が100％MeOH中に格納することができます。 </li><li> 5分間PBTに50％MeOH中の幼虫を再水和。 5分間PBTで洗浄します。 </li><li> 5-6分間氷上でPBTで0.25％トリプシンで幼虫を透過性。 5分ごとに4倍PBTで洗います。 </li><li> PBTの5％血清中で2-3時間ブロックします。 </li><li>室温でまたは一晩4℃で1時間、PBT中の5％血清中のウサギ抗2型コラーゲンとマウスの推奨希釈抗ミオシン抗体で幼虫をインキュベートします。 注：推奨される希釈範囲は、抗体のデータシートに通常です。互いに異なる種に対して惹起されたとのこともdiffeされている抗体を選択してください組織に借ります。 </li><li> PBTで15分間幼虫の6倍を洗ってください。 </li><li> PBTの5％血清中で1〜2時間ブロックします。 </li><li>暗闇の中で二次抗体でインキュベートします。特定の抗体のための5％血清およびPBT中の適切な希釈で蛍光標識した抗マウス（550）および抗ウサギ（488）二次抗体を使用してください。 </li><li>できるだけ早く10X共焦点顕微鏡上のPBTと画像内の各10分間洗浄6X。 </li></ol></li><li> イメージング筋骨格ジオメトリ <ol><li> Danieauの溶液16中のぬるい0.3から0.5パーセントの低融点（LMP）アガロース中のカバースリップ上で腹側幼虫をマウントします。 注：トランスジェニック魚は、装着前と撮像中に0.02％MS222（トリカインメタンスルホン酸、pHが7）で鎮静される必要があります。 </li><li> 10倍対物レンズと、約2.5倍デジタルズームを使用して、関心領域の共焦点画像スタックしてください。 488 nmおよび561のnを使用して、緑と赤チャンネルの画像を用意mはそれぞれレーザーです。 1.3ミクロンと3ライン平均値のZ面の間の間隔が512×512ピクセルの解像度での画像。結果のスタックは約100 zのスライスで構成されます。 </li><li> tiffのシリーズとしてデータをエクスポートします。 5dpfゼブラフィッシュ幼虫から筋肉および軟骨の要素の最大投影は、図1に示されています。 </li></ol></li></ol> 2. 3Dサーフェスの生成<ol style="margin-left: 40px;"><li> 3、4、5、DPFの各時点での代表的なデータセットを選択してください（複数のサンプルの可視化の後に選択します）。 </li><li> 3次元tiffのスタックを開き、解析ソフトウェアのすべてのチャネルを選択します。右軟骨チャンネルをクリックして、画像フィルタと平滑化を選択：ガウス（ 図2B）。 </li><li>プロジェクトビューで右フィルタ処理された画像を上にクリックして、「画像分割」を選択し、「新しいラベルを編集します」。各材料、 すなわち、軟骨とjのための新しいラベルを作成します。OINT。魔法の杖ツールを使って画像の軟骨領域（ 図2C、白信号、紫色のアウトライン）を選択します。アウトラインからノイズを除去するブラシツールを使用してください。 注：魔法の杖ツールを使用している場合、「すべてのスライス」をクリックします。 </li><li>ブラシツールと共同で地域を選択して、関節構成要素に割り当てる（ 図2C、青のアウトライン） </li><li>トップメニューと滑らかなラベルでセグメンテーションを選択することにより、一度に滑らかな複数のスライス。右の画像をクリックして、3D表面は、コンポーネント（ 図2D）のレンダリング生成するために表面を生成する]を選択します。 </li><li>面をクリックして、メッシュ生成ソフトにインポートするhmasciiファイルとしてデータを保存します。 </li></ol> 3. FEモデルで使用される筋力の計算<ol style="margin-left: 40px;"><li> smyhcの共焦点画像からの筋線維の数を数える：GFPトランスジェニックゼブラフィッシュ（ 図1A、矢じり、1C）とDIAMを測定繊維の計は、その断面積を計算する（πR2）。 </li><li>文献からの筋肉単位面積あたりの適切な力を識別します。幼生ゼブラフィッシュ骨格筋（40 nNの個/μm2）の単位面積当たりに発生最大筋力17を使用しました。 </li><li>単位面積当たりの力によって繊維の数とその面積を乗じて各解剖学的筋肉群のための力を計算します。 表1を参照してください。 </li></ol> 4.メッシュの生成<ol style="margin-left: 40px;"><li>有限要素メッシュを生成することができるソフトウェアパッケージにセクション2（上記）で生成された3Dモデルをインポートします。 </li><li> 2Dメニューのシュリンクラップ・ツールを使用して、軟骨および接合面のA2Dメッシュを生成します。適切な要素サイズを選択します。 注：1.5から2.5の間の要素サイズを使用します。必要に応じて、異なるサイズの2次元面の範囲を生成する3次元メッシュ最適化（セクション4を行うことが噛合しています。4）。 </li><li> &#39;&gt; 2D&gt;ツール要素チェック]の下にあるメッシュ品質チェックを行うメッシュ内の重複した要素、挿入および貫通をチェックするためのパネルを。モデルツリーでユーティリティ]タブを使用して二面角を修正しました。 </li><li> 3D&gt; tetrameshをサブパネルを使用して、要素の大きさの異なる2次元表面メッシュから3Dメッシュを生成します。 注：異なるメッシュサイズの結果を比較し、さらにシミュレーション後に収束し、機能の定義を損なわない最低のメッシュサイズでFEモデルを選択します。 図3の例では、下顎軟骨のための150万四面体要素が含まれており、2.0の2D要素サイズを有していました。 </li><li>顎モデルはジオメトリ&gt;距離のサブパネルを用いた共焦点スタックごとにスケールすることですので、メッシュを変換します。 注：軟骨を確認して、関節構成要素がマージされたモデルをエクスポートすることにより、またはタイを使用してモデルに接続されています。 </li></ol> 5.有限要素のModエル建設<ol><li>商業有限要素（FE）ソフトウェアを使用して、FEモデルを作成します。ガイドとしてセクション1で生成された共焦点スタックをラベルされた3Dの筋肉や軟骨を使用して、筋肉の付着点に対応するノードを割り当てます。各筋肉（ 図3）の起源と挿入を表す2つのノード間のベクトルを作成します。 </li><li>各筋肉のための &#39;C・ロード」を適用するタイプの歴史」のロードコレクタを作成します。 （ステップ3.3で計算）ニュートンで大きさを指定し、関連するベクトルを割り当てる。 図3は、内転下顎（AM）、分度器hyoideus（PH）とintermandibularis（IM）のための接続点を示しています。 注：これらの顎の筋肉の場合、最大の収縮力は、各負荷の50％のみが、各サイトで適用されるように、原点と挿入の間に分配されます。 </li><li>文献によって決定されるような適切な弾性等方性材料特性を割り当てます。軟骨のためのヤング率このモデルではゾーン間はそれぞれ1.1 MPaの0.25 MPaであったとポアソン比は両方18,19のために0.25でした。 </li><li>モデルの初期の制約を適用するタイプ &#39;境界」のロードコレクタを作成します。タブの分析&gt;制約に移動して、作成サブパネルで、あなたが制約したいモデル上のノードを選択します。その動きの自然な範囲の最良の近似にモデルの動きを制限する自由（DOF）の度を選択します。 注： 図3のモデルは、動きの全ての軸に拘束したモデルでとで中間点に空間にそれを固定する舌骨角の時（DOF 1、2、3はそれぞれx、yおよびzを表します） palatoquadrateはゼブラフィッシュ頭蓋の残りの部分に接続する時点でy及びz軸（ 図3、 表1）。モデルは、1つ以上のノードにすべての3つの自由度に制限される必要があります。 </li><li>あなたはサイマルしたい運動の種類ごとに、「ロード・ステップ」を作成します。分析メニューの下で、（ すなわち、開口部、閉鎖を）食べて、この動きをシミュレートするために、（5.4節で行われた）と制約（セクション5.2で行われた）関連するすべての負荷を選択します。それが表示されたら、ドロップダウンメニューから「静的」を選択します。 </li><li>この場合には、メッシュ、荷重、拘束と適切なファイル形式の材料特性などの輸出モデル、「.INP」形式。 </li><li> FE解析ソフトウェアへの負荷モデル。ジョブモジュールを使用して、モデルの仕事を作成し、実行します。 </li><li>結果タブと可視化メニューにあるなど 、応力、ひずみ、変位、のための出力を分析した （ 図4および5）。 </li></ol>顎変形/変位距離の6検証<ol><li>トランスジェニックゼブラフィッシュ：3-6のTg（mCherryをCol2a1aBAC）を選択します 。 </li><li>彼らは触れることなく、彼らの心はまだ鼓動している回答するのをやめるまで軽く0.02％MS222との幼虫をanaesthetize。 </li><li>マウント横方向にぬるい1％LMPアガロースでカバースリップ上（麻酔をかけながら）（Danieauの溶液中に作られた）の幼虫。 </li><li>鉗子で頭とあごの周りからアガロースを削除してください。 </li><li>通常の口の動きが再開されるまで、パスツールピペットを使用して麻酔を除去するために、幼虫の頭の上（無MS222付き）新鮮Danieauのソリューションをフラッシュします。 </li><li>口の動きの明視野高速ビデオを撮影する動画キャプチャソフトウェアを使用してください。最も高いフレームレートで1分の持続時間の周りの映画を撮る、または十分な顎の開口部の複数のサイクルを記録します。 </li><li>その最大変位にオープンジョーを表示するフレームを選択してください。 μm単位でメッケル軟骨および上顎（篩骨プレートの先端）の前部先端との間の距離を測定します。 </li><li>複数の稚魚からの平均変位を計算します。 </li><li>モデルから変位データを抽出します。 （モデル変位の挙動を確認するために、6.8で算出した平均変位を使用します<stronグラム&gt;図4）。モデルが予想から外れる場合は、順次材料特性と筋肉の負荷を変化させることによって、感度分析を実行します。 </li></ol>

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	<li>Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finite+Element+Analysis+and+Understanding+the+Biomechanics+and+Evolution+of+Living+and+Fossil+Organisms.">Finite Element Analysis and Understanding the Biomechanics and Evolution of Living and Fossil Organisms.</a> Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 35, 541-576 (2007).</li><li>Rao, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Finite Element Method in Engineering: Fifth Edition. , (2010).</li><li>Taylor, M., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+decades+of+finite+element+analysis+of+orthopaedic+devices:+Where+are+we+now+and+what+are+the+opportunities.">Four decades of finite element analysis of orthopaedic devices: Where are we now and what are the opportunities.</a> J Biomech. 48, 767-778 (2015).</li><li>Button, D. J., Rayfield, E. J., Barrett, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+biomechanics+underpins+high+sauropod+diversity+in+resource-poor+environments.">Cranial biomechanics underpins high sauropod diversity in resource-poor environments.</a> Proc Royal Soc London B: Biol Sci. 281. 281, (2014).</li><li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 27-61 (2013).</li><li>Shwartz, Y., Farkas, Z., Stern, T., Aszodi, A., Zelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+contraction+controls+skeletal+morphogenesis+through+regulation+of+chondrocyte+convergent+extension.">Muscle contraction controls skeletal morphogenesis through regulation of chondrocyte convergent extension.</a> Dev biol. 370, 154-163 (2012).</li><li>Rolfe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mechanosensitive+genes+during+skeletal+development:+alteration+of+genes+associated+with+cytoskeletal+rearrangement+and+cell+signalling+pathways.">Identification of mechanosensitive genes during skeletal development: alteration of genes associated with cytoskeletal rearrangement and cell signalling pathways.</a> BMC genomics. 15, 48 (2014).</li><li>Roddy, K. A., Kelly, G. M., van Es, M. H., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+patterns+of+mechanical+stimulation+co-localise+with+growth+and+cell+proliferation+during+morphogenesis+in+the+avian+embryonic+knee+joint.">Dynamic patterns of mechanical stimulation co-localise with growth and cell proliferation during morphogenesis in the avian embryonic knee joint.</a> J Biomech. 44, 143-149 (2011).</li><li>Haudenschild, D. R., Chen, J., Steklov, N., Lotz, M. K., D'Lima, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+chondrocyte+actin+cytoskeleton+in+living+three-dimensional+culture:+response+to+anabolic+and+catabolic+stimuli.">Characterization of the chondrocyte actin cytoskeleton in living three-dimensional culture: response to anabolic and catabolic stimuli.</a> Mol cell biomech. 6, 135-144 (2009).</li><li>Nowlan, N. C., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+pattern+of+mechanical+stimulation+promotes+ossification+in+avian+embryonic+long+bones.">A dynamic pattern of mechanical stimulation promotes ossification in avian embryonic long bones.</a> J Biomech. 41, 249-258 (2008).</li><li>Giorgi, M., Carriero, A., Shefelbine, S. J., Nowlan, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiological+simulations+of+prenatal+joint+morphogenesis.">Mechanobiological simulations of prenatal joint morphogenesis.</a> J Biomech. 47, 989-995 (2014).</li><li>Heegaard, J. H., Beaupre, G. S., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+modulated+cartilage+growth+may+regulate+joint+surface+morphogenesis.">Mechanically modulated cartilage growth may regulate joint surface morphogenesis.</a> J Ortho Res. 17, 509-517 (1999).</li><li>Hammond, C. L., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+populations+of+endochondral+osteoblasts+with+differential+sensitivity+to+Hedgehog+signalling.">Two populations of endochondral osteoblasts with differential sensitivity to Hedgehog signalling.</a> Development. 136, 3991-4000 (2009).</li><li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarth Res Soc. 21, 269-278 (2013).</li><li>Elworthy, S., Hargrave, M., Knight, R., Mebus, K., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+slow+myosin+heavy+chain+genes+reveals+a+diversity+of+zebrafish+slow+twitch+muscle+fibres+with+differing+requirements+for+Hedgehog+and+Prdm1+activity.">Expression of multiple slow myosin heavy chain genes reveals a diversity of zebrafish slow twitch muscle fibres with differing requirements for Hedgehog and Prdm1 activity.</a> Development. 135, 2115-2126 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danieau's+solution+(30&#215;).">Danieau's solution (30&#215;).</a> Cold Spring Harb Prot. , (2011).</li><li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish.">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> J Gen physiol. 137, 255-270 (2011).</li><li>Tanck, E., Blankevoort, L., Haaijman, A., Burger, E. H., Huiskes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+muscular+activity+on+local+mineralization+patterns+in+metatarsals+of+the+embryonic+mouse.">Influence of muscular activity on local mineralization patterns in metatarsals of the embryonic mouse.</a> J Ortho Res. 18, 613-619 (2000).</li><li>Tanck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+consequences+of+mineralization+in+embryonic+bone.">The mechanical consequences of mineralization in embryonic bone.</a> Bone. 35, 186-190 (2004).</li><li>Brunt, L. H., Norton, J. L., Bright, J. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finite+element+modelling+predicts+changes+in+joint+shape+and+cell+behaviour+due+to+loss+of+muscle+strain+in+jaw+development.">Finite element modelling predicts changes in joint shape and cell behaviour due to loss of muscle strain in jaw development.</a> J Biomech. 48, 3112-3122 (2015).</li><li>Roddy, K. A., Prendergast, P. J., Murphy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+influences+on+morphogenesis+of+the+knee+joint+revealed+through+morphological,+molecular+and+computational+analysis+of+immobilised+embryos.">Mechanical influences on morphogenesis of the knee joint revealed through morphological, molecular and computational analysis of immobilised embryos.</a> PloS one. 6, e17526 (2011).</li><li>Cuff, A. R., Bright, J. A., Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+experiments+on+finite+element+models+of+an+ostrich+(Struthio+camelus)+cranium.">Validation experiments on finite element models of an ostrich (Struthio camelus) cranium.</a> Peer J. 3, 1294 (2015).</li><li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Musculoskeletal+patterning+in+the+pharyngeal+segments+of+the+zebrafish+embryo.">Musculoskeletal patterning in the pharyngeal segments of the zebrafish embryo.</a> Development. 124, 2945-2960 (1997).</li><li>Dowthwaite, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+underlying+the+movement+requirement+for+synovial+joint+cavitation.">A mechanism underlying the movement requirement for synovial joint cavitation.</a> Matrix biol. 22, 311-322 (2003).</li><li>Nia, H. T., Han, L., Li, Y., Ortiz, C., Grodzinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poroelasticity+of+cartilage+at+the+nanoscale.">Poroelasticity of cartilage at the nanoscale.</a> Biophys J. 101, 2304-2313 (2011).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。 図3-5のいくつかのデータはJ.Biomech、48（12）、ブラントらから再版された、有限要素モデリングが原因で顎の開発、3112から22で筋肉の緊張の損失に接合形状と細胞の挙動の変化を予測します。 2015年、エルゼビア15からの許可を得て。

有限要素モデルは、骨形成10を受けるものと緊張下にある骨格要素の領域を関連付けるために、ならびに軟骨内骨化や関節の形態形成8,12,21時のひずみの下の領域をマッピングするために使用されてきました。他の研究はまた、共同開発11,12の間に変更を複製するための理論的な成長モデルを適用することができました。ここでは、比較的単純なシステム、ゼブラフィッシュ顎20のためのFEモデルを構築するためのプロトコルを示します。複数の組織を研究するために、このようなCTスキャン22、トランスジェニック系統の共焦点イメージングまたは免疫染色ゼブラフィッシュなどのFEモデルのための生の画像を収集する別の方法とは異なりできます。それは、したがって、軟骨に関連する筋肉の接続点に直接情報を提供することができます。脊椎動物のモデルの中ではゼブラフィッシュは、遺伝的および薬理学的操作に特に適しています。ゼブラフィッシュのためのFEモデルの生成頭蓋顔面の軟骨は現在、関節の形態形成におけるバイオメカニクスと遺伝学の間の相互作用のさらなる研究の可能性を開きます。 FEモデルを作成するプロセスの重要なステップの数があります。まず、システムの正確な三次元表現を生成しています。これは明らかに境界を定義するために十分な高解像度で撮影する必要があります。でも、高分解能イメージングとの良好な一面は、いくつかの領域を平滑化する必要があるかもしれ作ることに注意してください。もう一つの重要なステップは、負荷と正しい制約の正しい配置を定義しています。不十分な制約モデルは、解決に失敗し、負荷の不正確な配置は、異常な動きの原因となります。 生データから生成された表面（ 図2B）をメッシュすることが困難であるように、生データのいくつかの処理（ 図2）が必要です。我々は、ガウスフィルタを使用してデータ（ 図2Cを濾過しました</strong&gt;）、我々は3D表面に変換することができるきれいなアウトラインのセットを生成するために、曲線のいくつかの手動の平滑化を行いました。あまりにも多くの平滑化は、その機能の多くを失った「溶融」表面を生成することができます。小さすぎる要素サイズを選択すると、計算集約的である大きすぎるメッシュを作成するように正しい要素サイズを選択すると、反復的なプロセスです。しかし、あまりにも大きな要素サイズを選択すると、構造の正確な形状を再現するために失敗したメッシュを生成します。正しいメッシュは顎の正確な形状を捕獲し、正解に収束、顎の変位を用いて検証最小の要素サイズを有していました。また、異なる年齢及び種は実質的に異なる特性を有するように、より良い正確な変位をエミュレートするために、材料特性や負荷の計算を変更する必要があるかもしれません。 常に仮説モデルであり、aには限界があることを覚えておくことが重要ですssumptionsはFEモデルを実行するために作られました。 1つまたは少数のサンプルをモデル化する際には、個人間の小さな変動である可能性があるように代表的なサンプルが選択されることを確実にするために重要です。唯一の顎要素と筋肉の一部が含まれていたように、モデルは、ゼブラフィッシュ頭蓋顔面筋骨格系の簡易版です。そのため、制約は、モデル化された顎要素が頭蓋骨の残りの部分と接続する場所を考慮して配置されるように持っていたモデルは、人工的に「スペース」でそれを修正するために中央に拘束されました。この人工的な制約は、それ自体が分析されていなかった舌骨角のようなモデルから引き出された解釈に影響を与えませんでした。頭蓋顔面構造のより多くを含めることは、そのようなsternohyals及びその添付軟骨23、として特に他方のジョー開く筋肉がモデルに追加されたかもしれないが、制限は、有限要素ソフトウェアで実行する大きなモデルの機能が含まれています。 S = &quot;jove_contentは&quot;&gt;別の制限は、これは、ばね8を挿入することによって達成することができるものの、我々は、靭帯の挿入をモデル化していないことです。この場合には作られたもう一つの仮定は、モデルが直線的に振る舞うというものでした。モデルの株の大きさは、発行されたモデルのものと同等であったと株が3500を下回ると制約と筋肉の付着点から離れ-5000μɛの上にあることで、in vitroでの細胞10,24に適用されます。したがって、モデルの関連領域での株は線形モデルの許容範囲内にあると考えられました。軟骨は、線形材料として完全に動作しないと、以前のモデル25内の流体挙動の分析を可能に多孔質弾性材料としてモデル化されています。ローカルノードのクラスタ間で筋肉の付着点を拡散することは、ピーク力を分配し、より正確に特定の筋肉のための筋肉の挿入を表すことになります。 ENT &quot;&gt; FEの使用は、構造に作用するひずみと応力の評価を可能にする。それは頻繁に整形外科、古生物学、より最近では発生生物学を含む多くの生物科学分野で用いられている技術として。ここでは、ゼブラフィッシュのためのFEを構築する方法について説明します下顎。将来的にはこれらのモデルは、口蓋を含め、全体の顎を見て拡張することができる。同様の技術は、現在までにほとんどが動によって研究されてきた魚で脊椎の生体力学をモデル化するために使用することができます。

有限要素（FE）モデリングは、計算構造体1に作用するひずみの大きさと位置を計算し、マッピングすることができ工学的手法です。このモデルは、「有限要素」のメッシュで表される立体構造で構成され、分析の最終結果は、メッシュ、機械の大きさや位置の要素の構造及び数を含む多くの因子によって支配されます負荷や材料特性。材料特性は、負荷の与えられたタイプの下で、材料の挙動の特定の側面を説明します。試料を延伸したときポアソン比は、その長さの材料の幅の比例的減少を説明しながら、ヤング率（E）は、材料の弾性を記述する。 FEモデルは、「アカウントに構造に関する固有の入力データを取ることによって、モデルに作用する変位、応力、圧力、歪みなどの変数のさまざまを計算することができます; sの形状、位置、および負荷の大きさと特定の材料特性。 FEモデルは、広く工学2にますます3整形外科及び古生物学アプリケーション4のために使用されます。開発中の生体力学的力は、細胞応答5-8を活性化する多くの細胞における刺激として作用することが知られており、臓器システムを開発中での相対的な位置および機械的刺激の大きさの両方を予測するために有用であるが、現在、FEモデルはほとんど使用されていますゼブラフィッシュの開発のため。 軟骨および骨の両方が機械受容性材料であることが示されています。例えば、 インビトロでの圧縮は、張力が骨形成9のために必要であることが示されている一方で、軟骨形成経路を活性化することが見出されています。 FE解析（FEA）は、foの骨の間に骨格要素に作用するものを含め、生物試料に作用する菌株をモデル化するために利用されてきましたrmation 10。他の開発アプリケーションは、それが理論的な生体力学的な力11,12にさらされた後の関節の形状を予測するとひよこ膝関節の形態形成8の間に存在する株のパターンを表示するために、その使用を含みます。 このプロトコルは、開発組織の力学を理解することを視野に入れて共焦点画像から3次元サーフェス、メッシュおよび有限要素モデルを生成するの経験を共有することを目的としています。我々はまた、 生体内での実関節変位情報を取り込むのにFEモデルを検証する方法を示しています。我々は模範としてゼブラフィッシュ顎を使用しながら、同じ技術は筋骨格系の構造の3次元情報を、共焦点又は多光子イメージングにより得ることができるため、任意の小さな生物学的システムで使用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="937">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coll2</td>
			<td style="width:237px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab34712</td>
			<td style="width:365px;">Type II collagen antibody - stains all cartilage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">A4.1025 / MF20</td>
			<td style="width:237px;">Developmental studies hybridoma bank</td>
			<td style="width:119px;">A4.1025</td>
			<td>Skeletal mysoin antibody - marks all skeletal muscle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Low melt agarose</td>
			<td style="width:237px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A9414-5G</td>
			<td>For mounting zebrafish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate )</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>To make anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td>T/3760/48</td>
			<td>sample permeablilisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dylight 488Mouse IgG</td>
			<td style="width:237px;">Thermofisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">35502</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dylight 550 Rabbit IgG</td>
			<td style="width:237px;">Thermofisher&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">84541</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP8/SP5 or SPE confocal</td>
			<td style="width:237px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;LAS Leica capture software&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aviso (version 7.0.0)</td>
			<td style="width:237px;">FEI Visualization Science Group</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3D image analysis software (Section 2)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10)</td>
			<td style="width:237px;">Altair Engineering</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FE model generating software (Section 4-5)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Abaqus (version 6.14)</td>
			<td style="width:237px;">SIMULIA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FE analysis software (Section 5.7-5.8)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

building finite element models to investigate zebrafish jaw biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

筋肉（ 図1A）および軟骨（ 図1B）、またはトランスジェニックレポーター（ 図1C）のイメージングのための免疫染色は、顎の3D構造は、関連する筋肉組織とともに、可視化することを可能にします。高解像度で画像化することにより、顎の三次元形状（ 図2）と位置と負荷の配置（ 図3）の両方を捕捉するモデルを構築することが可能でした。高速ビデオキャプチャを通して見たin vivoでの変位（ 図4） に活用し、我々は、モデルの動きの範囲が現実的な範囲内であったことを確認しました。 実行するとFEモデルは、このような応力（ 図5A）、最小および最大主ひずみ（ - K 図5B）のようなデータの範囲を表示するために使用することができます。これらの結果は、3次元のあります<html> 5I、5I &#39;、&#39; &#39;、5E&#39;（図5E関連するビュー（ 図5F、5G、5J、5K） を得るために回転させ、デジタル切片（ 図 5E、5I）モデルは、細部の微細パターンを見るために拡大することができますので、ensional &#39;&#39;）を表示する方法を説明したモデルを通じて、応力、ひずみや圧力変化のパターン。モデル（図示せず）からの定量的データを抽出することも可能です。モデルを検証し、最も正確な材料特性を使用することにより、負荷および形状をメッシュFEモデルの開発の窓の間に細胞によって経験される機械的な環境の最良の推定値を探索するために使用することができます。モデルの結果は、直接細胞挙動と遺伝子発現の20の変化と比較することができます。 <html> 1再 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：5 DPFでのゼブラフィッシュ下顎の筋骨格系の要素の代表的な画像 5dpf幼虫の下顎の代表的な共焦点スタックは、すべてのすべての骨格筋ミオシンを染色A4.1025の免疫染色トップに前方（A）（B）で示しますトランスジェニック記者のCOL2A1を表現するライブ幼虫からすべての軟骨（C）スタックをマークII型コラーゲンの免疫染色：GFP遅筋（緑）：mCherryを軟骨（赤）とsmyhcをマーク。 IA：intermandibularis前部、PH：分度器hyoideus、AM：転下顎、HI：hyoideus HI、劣っ：hyoideus優れ、CH：胸骨舌骨筋、MC：メッケル軟骨、PQ：Palatoquadrate、CH：舌骨角のは、 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の。</a> 「FO：キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> 図2： 共焦点データから3D表面の世代接合部の高倍率とゼブラフィッシュ下顎のための3D表面への共焦点データから遷移を示す画像。 （A）生共焦点データ。ガウシアンフィルタの適用後（B）データセット。 （C）フィルタ処理概要; （D）3D表面が。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> 図3： 制約と力のベクトルを示す代表的メッシュ （A）、口閉鎖と5 DPFの幼虫のための代表的なメッシュ。（B）口の開口部。白丸は、モデルが制約された場所を表し、ここでの寸法（ 例えば、XおよびYまたはX、YおよびZ）。白い線が白い矢印で示される筋力のベクターを用いて、筋肉の位置を示します。レッドは、軟骨やイエローゾーン間を示します。この図は、以前ブラントら 15に発表された補足資料から変更されている。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> 図4： 感度試験 FE-モデルが異なる軟骨およびゾーン間のヤング率のため5dpfゼブラフィッシュで顎変位をシミュレートします。 （ミクロンで閉じに開放）顎変位が顎にマークされています。カラーキーを使用して記録しました。各モデル（- L）が異なる軟骨の組み合わせ（C = 1.1、3.1、または6.1メガパスカル）またはゾーン間（0.25、0.5、0.75、または1 MPaでのI =）特性を有しています。 、すなわち 、水平方向の黒い矢印が（黒い縦の矢印で示す）メッケル軟骨の先端に顎変位の値を強調しています。5のビデオからMとNの静止画幼虫示す最小DPF、すなわち、顎は（M）を閉鎖し、最大重ね合わせた2（O）と（N）は、完全にオープンジョー- O上の白い線は（43ミクロンの）変位を表します。この場合、0.25（A）ベストマッチのゾーン間で1.1の相対的な軟骨特性活魚（O）で見られる変位。 ALこの図のパネルは、以前ブラントら 15で公開されている。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">より大きな輸出自主規制を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図のイオン。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> 図5：FEモデルからの代表的なデータ 5 DPFの幼虫に適用されるすべての筋肉のFE-モデルシミュレーション（A - C）。 （A）ミーゼス（EMaxmin）（B）最小主ひずみ（E最小P、μɛ）（C）最大主歪（Eマックス。P.、μɛ）。顎の開口部の間の最大値と最小主ひずみのFE-モデルシミュレーション。 （D - K）：最大主歪（EマックスP.、μɛ）（D）腹側顎図、（E）腹側ジョイントビュー（E）内はメッケル軟骨を通して近位-遠位セクションの位置を示しジョイントとゾーン間（E &#39;）及び（E&#39; &#39;）において、それぞれ。 （F）：横顎ビュー。 （G）：横方向の関節ビュー。 （H - K）：最小主ひずみ（EミンP、μɛ。）中の（H）腹側顎図、（I）腹側ジョイントビュー。 （ 私は ）メッケル軟骨ジョイントを介して近位-遠位セクションの位置を示しており、（I &#39;）および（I&#39; &#39;）は、それぞれ（J）でのゾーン間：横顎ビューを。 （K）：横方向の関節ビュー。この図は、以前ブラントらに掲載されました。15。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td>筋線維の数</td><td>筋線維面積（ 平方 μm） </td><td>筋肉群の面積（μmで2） </td><td>力（N） </td></tr><tr><td> 5 DPF intermandibularis前方</td><td> 5 </td><td> 23.8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF分度器hyoideus </td><td> 6 </td><td> 23.8 </td><td> 142.8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF内転筋下顎</td><td> 9 </td><td> 23.8 </td><td> 214.2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> 表1： 筋肉の定量化。40 nNの個/μm2（参照17から採取された単位面積あたりの値）を使用して、DPF 5でIntermandibularis前部、転下顎と分度器Hyoideusの平均筋力を計算。 （Lorga ら 、2011）（n = 3）でした。

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ゼブラフィッシュの顎の生体力学を調査するための有限要素モデルの構築 |発生生物学 |ビデオ

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

ゼブラフィッシュジョーバイオメカニクスを調査するために有限要素モデルの構築

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

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9.0K ビュー.  University of Bristol. Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw. 

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Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

の共焦点分析を用いました<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt; WntおよびShhのモルフォゲン勾配の調節を調査するために、

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

発生生物学

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of &#946;-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

A primary culture of bovine corneal endothelial cells was used to investigate the mechanism of corneal endothelial-mesenchymal transition. Furthermore, a rat corneal endothelium cryoinjury model was used to demonstrate corneal endothelial-mesenchymal transition in vivo.

in vitroおよびin vivoモデルで角膜内皮間葉転換を研究します

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

クリア胚ハーツにおける冠状血管の分析

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological problems after stroke and is shown to impair neurogenic processes. Interestingly, the adult zebrafish has recently emerged as a relevant and useful model to mimic hyperglycemia/diabetes and to investigate constitutive and regenerative neurogenesis. This work provides methods to develop zebrafish models of hyperglycemia to explore the impact of hyperglycemia on brain cell proliferation under homeostatic and brain repair conditions. Acute hyperglycemia is established using the intraperitoneal injection of D-glucose (2.5 g/kg bodyweight) into adult zebrafish. Chronic hyperglycemia is induced by immersing adult zebrafish in D-glucose (111 mM) containing water for 14 days. Blood-glucose-level measurements are described for these different approaches. Methods to investigate the impact of hyperglycemia on constitutive and regenerative neurogenesis, by describing the mechanical injury of the telencephalon, dissecting the brain, paraffin embedding and sectioning with a microtome, and performing immunohistochemistry procedures, are demonstrated. Finally, the method of using zebrafish as a relevant model for studying the biodistribution of radiolabeled molecules (here,[18F]-FDG) using PET/CT is also described.

This work describes methods to establish acute and chronic hyperglycemia models in zebrafish. The aim is to investigate the impact of hyperglycemia on physiological processes, such as constitutive and injury-induced neurogenesis. The work also highlights the use of zebrafish to follow radiolabeled molecules (here, [18F]-FDG) using PET/CT.

ゼブラフィッシュにおける高血糖症の急性および慢性モデル：高血糖が神経新生および放射性標識分子の生体内分布に及ぼす影響を評価する方法

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

調査cruzi トリパノソーマの原因運動In Vivo動物モデルとしてのゼブラフィッシュ稚魚の確立

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

骨組織の再生にプレドニゾロンの効果を研究する大人のゼブラフィッシュ傷害モデル

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

成体マウスの解離と再生:哺乳類のブラステマ形成と腸内形成を調べるための簡単なモデル

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

iPSC-ICにおけるゼブラフィッシュ胚の全山ハイブリダイゼーションとチューブ形成アッセイは血管開発におけるエンドリンの役割を研究する

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...