We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.

엑소의 분리 및 정제 과정의 일반적인 그림은 그림 1에 나와 있습니다. 전체 혈액을 건강한 자원 봉사 기증자와에 모리 대학의 희망 클리닉과 그래 디 건강 시스템의 감염증 프로그램에 참석 항 레트로 바이러스 theraoy를 수신하지 HIV 양성 개인로부터 얻은 것 애틀랜타, 조지아. 본 연구는에 모리 대학과 의학의 모어 하우스 대학의 제도적 검토 보드에 의해 승인되었다. 연구에 참여하는 모든 사람은 서면 동의를 통보했다. 혈장에서 엑소 좀 1. 준비 <ol><li> 인간의 혈액 수집 및 처리 <ol><li> (18 mg의 칼륨 EDTA를 함유 함) EDTA 혈액 수집 튜브에 정맥 천자에 의해 말초 혈액 10 ㎖를 수집하고 부드럽게 혼합 5 배를 반전. </li><li> 혈액 세포 펠렛을 실온에서 20 분 동안 1,000 XG에서 혈액 수집 튜브를 원심 분리기. 멸균 피펫을 사용하여TE는 25 ㎖ 원뿔형 튜브에 혈장 분획 (4-5 ml)에 전송한다. 1 X PBS 10 mL로 혈장 희석. 생물 폐기물 용기에 적절하게 마킹 (또한 PBMC라고도 적혈구 및 백혈구)의 혈액 세포를 버린다. 주 : 감염되지 않은 공여자의 혈액 샘플의 경우에, PBMC는 상기 사용 (이하, 절차 IV.2 참조)를 위해 예약 될 수있다. </li><li> 단기 (2-3 일간) 또는 장기 저장을 위해 -80 ℃로 4 ℃로 플라즈마 샘플을 저장합니다. 참고 : 추가 처리를하기 전에 4 O C에 어떤 냉동 혈장 샘플을 가져와. </li></ol></li><li> 플라즈마로부터 엑소 분획 제제 <ol><li> 4 ℃에서 30 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기 플라즈마 세포 파편을 제거합니다. 깨끗한 25 ML의 초원 심 분리기 튜브에 삭제 플라즈마 뜨는을 전송하기 위해 멸균 혈청 학적 피펫을 사용합니다. 생물 학적 용기에 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 2 10 만 XG에서 삭제 플라즈마를 원심 분리기4 ℃에서 시간은 큰 소포를 제거합니다. 피펫 조심스럽게 100,000 XG 상층 액을 제거하고, 생물 학적 폐기물 폐기합니다. 깨끗한 튜브로 1X PBS 1 ㎖에 100,000 XG 펠렛을 재현 탁하고 부드럽게 이동시키다 분리 입자 소용돌이, 실온에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> PBS의 25 ㎖를 추가하여 중단 100,000 XG 엑소 / 바이러스 펠렛을 씻으십시오. 부드럽게 한 후, 혼합하여 4 ℃에서 2 시간 동안 100,000 XG에서 다시 원심 분리기 튜브 다섯 번 반전. 생물 학적 폐기물 용기에 PBS 세척 솔루션을 폐기하십시오. </li><li> 1 X PBS 1 ㎖에 100,000 XG 펠렛을 재현 탁하고시키다 펠렛을 용해 소용돌이 부드럽게 30 분 동안 RT에서 배양한다. 주 : iodixanol 그라데이션 단계까지 1-2일 4 ℃에서, 엑소 좀과 바이러스 입자를 함유하는, iodixanol 그라데이션 단계로 바로 진행 펠렛을 저장하는 것이 가능하지 않은 경우. </li></ol></li></ol> 엑소 좀 2. 정제 <ol><li> 6 % -18 %의 veloc 생성이중 챔버 구배 전자 장치를 사용 iodixanol 성만의 기울기. <ol><li> PBS에 희석하여 물에서 60 % 용액으로서 공급 iodixanol 시약 6 % 및 18 % 용액을 준비한다. 피펫 5.5 교반 챔버 내로 18 % 용액 ㎖, 및 피펫 저장 챔버에 6 %의 용액 5.5 mL로. , 교반기를 켭니다 마개를 열고 각각의 기울기는 14 ML의 초 원심 분리기 튜브로 유입 할 수 있습니다. 참고 : 즉시 사용하거나 사용하기 전에 4 ° C에서 준비 그라데이션 O / N를 저장 중 하나. </li><li> 신중하게 각 11 ㎖의 구배의 정상에 엑소 / 바이러스 액 1ml 계층. SW40Ti 스윙 버킷 로터를 사용하여 4 ℃에서 2 시간, 250,000 XG에 원심 분리기 그라디언트. </li><li> 12 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 레이블. 구배의 상부로부터 1.0 ㎖의 튜브를 제거하고 1 번에 옮긴다. 순차적으로 튜브 2-12에 남아있는 1ml의 분수를 전송합니다. 참고 : 맨 위 부분은 이렇게 # 1, 바닥 분수, # ​​12이 될 것입니다. 성4 ° C에서 그라데이션 분수 광석. 4 ℃에서 보관시 구배 상단 분획 1-3이어야 정제 엑소 좀은 3-4 주 동안 안정하다. </li></ol></li></ol> 3. 엑소 특성 <ol><li> 아세틸 콜린 (아세틸 콜린) 활동 분석 <ol><li> 1X PBS 1 ml의 아세틸 콜린 요오드화 28.9 mg을 혼합하여 100 mM의 기판 재고를 준비합니다. 1개월에 -20 ° C 최대 스토어 기판 재고. </li><li> 1X PBS 10ml에 벤조산 39.6mg과 탄산 수​​소 나트륨 15 mg을 혼합하여 10 mM의 색상 표시 주식을 준비합니다. 최대 2 주, 4 ℃에서 보관 색 표시 재고. </li><li> (예를 들면 10 ㎖ + 1X PBS 200 ㎕를 기질 + 500 μL 색 표시기)를 5 : 1 : 100의 비율로 혼합 1X PBS, 기판, 및 컬러 표시하여 측정 시약을 제조. </li><li> 96 웰 microtite의 우물로 전송 (프로 시저 III.3에서 1-12로 표시) 각 1.5 ml의 그라데이션 분수 관에서 50 μLR 판. 각 그라데이션 샘플에 대해 중복 우물을 준비합니다. </li><li> 첫 번째 PBS에 2000 μU / ml의 아세틸 콜린의 주식을하여 표준 세트를 준비합니다. 확인 11 개의 2 배 콘텐츠의 연속 희석하고, 마이크로 타이 터 플레이트의 단일 웰에 각 희석액 50 μL를 추가되도록 표준 # 1 = 2,000 μU / ㎖, # 2 = 1,000 μU / ㎖, # 3 = 500 μU / ㎖, 등 # 12 = 0.98 μU / ㎖까지. 열두 시린 표준 따라서 96- 웰 분석 플레이트의 하나의 행을 차지한다. </li><li> 각 측정 시약 혼합물의 200 μL를 첨가하고 잘 착색 반응 생성물의 개발을 허용하기 위해 RT에서 (어두운 곳에서) 20 분 동안 배양한다. 형광 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 450 nm의 파장에서의 AChE의 활성을 측정한다. 주 : 엑소 정제 후 남은 출발 물질의 비율은 비 분획 플라즈마의 통증 분석법에 의해 평가된다. </li></ol></li><li> 면역 분석 <ol><li> proced 그라데이션 분수 1-12에서 분리 된 단백질 (100V X 1 시간에 4~20% 트리스 - 염산 프리 캐스트 젤의 SDS-PAGE에 의해 URE 2.1.3). 제조업체의 지시에 따라 전기 블로 팅 전사 셀을 사용하여 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 겔에 옮긴다. 전송이 350V에서 12 ~ 16 시간 (O / N)에 대해시킨다하도록 허용합니다. </li><li> 블로 팅 장치로부터 막을 제거하고 5 분 동안 트리스 완충 염수 (TBS)로 세척 하였다. RT에서 진탕하여 1 시간 동안 (0.1 % 트윈 20과 TBS) TTBS 중 5 % 탈지 우유로 차단. </li><li> 12 ~ 16 시간 (O / N) 4 ℃에서 진탕 5 % 무 지방 우유에 엑소 좀 (CD9, CD45, CD63) 또는 HIV-1 캡시드 단백질 (P24)에 대한 특정 기본 항체와 멤브레인을 품어. 면역 블롯에 대한 일차 항체의 희석은 1 범위 : 2000 -1 : 5000. </li><li> 1 인큐베이션 20 분 동안 TTBS로 블롯을 세척 : 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) 2,000 희석액을 실온에서 1 시간 동안 5 % 탈지 우유, 안티의 IgG (이차 항체)에 π 공역 계. 오에게 TTBS 3 회, 세척 당 10 분을 씻으십시오. </li><l난&gt; HRP 표지 된 단백질은 CCD 카메라로 촬상 한 전자 시스템을 이용하여 화학 발광 신호를 검출에서 화학 발광 신호를 생성하기 위하여, 제조자의 지시에 따라 기판 루미놀 시약 오 부화. </li><li> 어도비 포토샵에서 볼 수있는 TIFF 파일로 이미지를 저장합니다. ImageJ에 소프트웨어 (건강의 국립 연구소, 베데스다, MD)를 사용하여 밴드의 밀도 측정 분석을 수행합니다. </li></ol></li><li> 사이토 카인 분석 <ol><li> 사이토 카인 분석에 앞서, 산해리 의해 인간 혈장에 존재하는 통상 세제 처리하여 엑소 좀을 용균 면역 복합체를 방해. 분석 모두 시작 플라즈마 샘플 및 정제 엑소 좀 준비. <ol><li> 인간 혈장 100 ㎕를 100 ㎕의 0.33 N HCL을 부가하고 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. 산 처리 된 플라즈마를 중화하기 위해 100 μL 0.33 N NaOH를 추가합니다. 인터넷에, 트리톤 X-100 중화 플라즈마 및 정제 엑소 모두 샘플을 추가1 %의 최종 농도는 엑소 좀의 분해를 야기한다. </li></ol></li><li> 이 분석 (형광 구슬 기반 절차)의 경우, 자석 구슬은 제조 업체에 의해 항체로 미리 코팅 사용합니다. 안티 - 인간 사이토 카인 항체 코팅 구슬의 맞춤 디자인 패널을 사용하여; 표 1. 30 초간 사이토킨 분석 키트에서, 항체 - 코팅 된 자성 비드 와동 및 분석에 사용되는 96- 웰 플레이트의 각 웰에 50 ㎕의 비드를 추가한다. </li><li> 8- 점 표준 곡선을 생성하기 위해, 사이토 카인 분석 키트의 사용 설명서에 기재된 바와 같이 플라즈마 표준 완충액 (사이토 카인 분석 키트에 함유 된 양)의 표준 희석 시리즈를 준비한다. </li><li> 사용 설명서에 설명 된 바와 같이, 물론 각 (키트) 1X 세척 버퍼의 150 μl를 추가하고 자기 비드 와셔를 사용하여 구슬을 씻는다. 각 웰 (키트) 25 μL 플라즈마 분석 버퍼를 추가합니다. 분석에 사용 된 모든 우물에 표준 및 샘플의 25 μl를 추가합니다. 플라즈마의 25 μl를 추가음성 대조군 우물에 샘플 버퍼. 밀봉하고 실온에서 60 분 동안 700 rpm에서 판을 흔들어 4 ℃에서 O / N을 품어. </li><li> 각 웰에 1X 세척 버퍼의 150 μl를 추가하고 (위의 단계 3.3.4에서와 같이) 접시를 씻으십시오. 각 웰, 인감로 검출 항체의 25 μl를 추가하고 실온에서 30 분 동안 700 rpm에서 판을 흔들어. 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 각 웰, 인감로 (키트에서 SAPE) 스트렙 타비 딘 용액 50 μl를 추가하고 실온에서 30 분 동안 700 rpm에서 판을 흔들어. 3.3.4에서와 같이 반복 플레이트 세척. </li><li> 형광 신호가 발전 할 수 있도록 실온에서 5 분 동안 700 rpm으로 실험실 탁상 통에 각에 (키트) 읽기 버퍼의 120 μl를 잘 추가하고 악수. 제조업체의 지침에 따라 플레이트 리더에 판을 읽어보십시오. </li><li> , 분리 과정 중에 손실 엑소 좀의 양을 설명하기 식을 사용하기 위해 [(원고 판독 / 혈장 부피) = 66.6 조절 사이토 카인 판독 X]. </li></ol></li></ol> 면역 잠재적 4. 분석 <ol><li> 엑소 좀 고갈 태아 소 혈청과 문화 매체의 준비 <ol><li> 원심 분리기 4 ℃에서 20 시간 동안 100,000 XG에 소 태아 혈청 (FBS) 500 ml의 엑소 좀과 마이크로 소포를 오염 펠렛. 조심스럽게 제거하고 엑소 좀 고갈 FBS 상층 액을 저장합니다. 생물 학적 폐기물의 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 로스웰 파크 메모리얼 연구소 1640 500 ㎖ (1640 RPMI) 매체와 엑소 좀 고갈 FBS 상층 액의 20 %를 결합합니다. 0.45 ㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 배지를 필터. </li><li> 여과 매체 스트렙토 마이신 (100 U / ㎖), 페니실린 (100 U / ㎖), L- 글루타민 (2 mM)을 HEPES 완충 식염수 용액 (10 μM) 및 IL-2 (20 U / ml)에 추가한다. </li></ol></li><li> 세포 배양 및 엑소 좀 노출 <ol><li> 건강한 지원자 클리닉 기증자로부터 얻은 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)에 엑소 좀을 노출. 에서 PBMC를 일시 중단배양 배지를 제조하여 (제조자의 표준 방법에 따라) 셀 / 입자 계수기를 사용하여 세포를 카운트. 주 : PBMC는 (단계 1.2) 상술 한 플라즈마 제조 동안 얻어진다. </li><li> 4.1.3 절차로부터 제조 매체를 이용하여, 공존 배양 3.0 × 106에서 엑소 좀 풀링 1 μg의 / ㎖와 (PBMC) 세 (3) HIV-1 혈청 양성 또는 삼 (3) HIV-1 혈청 음성 개체로부터 총 (뚜껑) 12 웰 배양 플레이트의 웰에 1 ml의 부피. 37 ℃에서 48 시간 동안 문화를 품어. </li><li> 콘 카나 발린으로 처리 미처리 PBMC 배양 물 및 배양 물 제조 (콘을 5 μg의 / ㎖) (4.2.2) 전술 한 바와 같이, 각각 같은 음성 및 양성 통제를 제공하기 위해. 37 ℃에서 48 시간 동안 모든 PBMC 문화를 품어. </li><li> 형석 알렉사 700 표지 항 CD3 (1 : 400 희석), allophycocy 직전에 세포를 수확하려면 다음, 형광 - 공액 모노클로 날 항체의 희석액을 제조(1 : 400), V450 표지 항 CD8, 바이오틴 : 엽록소 단백질 복합체 표지 항 CD4 (400 1) peridinin : ANIN (APC) / 시아닌 7 (Cy7)는 안티 CD4 (400 1) - 표지 안티 CD45RA (1 : 1,000) 표지, 피코 에리 트린 (PE) / 항 CD62L (1 : 1,000)를 Cy7 - 표지 : PE-텍사스 레드 -, PE는 / 시아닌 5 (Cy5에)는 안티 CD38 (200 1) - 표지 표지 항 streptavidin (1 : 000), 및 PE / Cy5에 표지 된 마우스 IgG1K 아이소 타입 컨트롤 (1 : 200). </li><li> 48 시간의 잠복기 후, PBMC를 수확. PBS에 세척 PBMC는 개인, 형광 표지 된 항체로 4 ℃에서 1 시간에 대한 배양 세포를 엑소 좀을 제거하고 얼룩합니다. (21의 설명 참조) 케모카인의 발현을 정량화하는 유동 세포 계측법에 의해 염색을 분석 PBMC. </li></ol></li></ol>

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	<li>Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , (2013).</li><li>Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+activation+markers+on+CD8+lymphocytes+in+human+immunodeficiency+syndrome:+staging+and+prognostic+value.">The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value.</a> Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).</li><li>Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+CD38++CD8++T+cells+in+HIV+infection+add+to+the+prognostic+value+of+low+CD4++T+cell+levels:+results+of+6+years+of+follow-up.+The+Los+Angeles+Center,+Multicenter+AIDS+Cohort+Study.">Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study.</a> J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).</li><li>Bofill, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+numbers+of+primed+activated+CD8+CD38+CD45RO++T+cells+predict+the+decline+of+CD4++T+cells+in+HIV-1-infected+patients.">Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients.</a> AIDS. 10, 827-834 (1996).</li><li>Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+CD38+antigen+expression+on+CD8++T+cells+is+a+stronger+marker+for+the+risk+of+chronic+HIV+disease+progression+to+AIDS+and+death+in+the+Multicenter+AIDS+Cohort+Study+than+CD4++cell+count,+soluble+immune+activation+markers,+or+combinations+of+HLA-DR+and+CD38+expression.">Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression.</a> J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).</li><li>Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+the+immunopathogenesis+of+AIDS.">Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS.</a> Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).</li><li>Roberts, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cytokine+levels+during+acute+HIV-1+infection+predict+HIV+disease+progression.">Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression.</a> AIDS. 24, 819-831 (2010).</li><li>Mueller, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-15+increases+effector+memory+CD8++T+cells+and+NK+Cells+in+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> J Virol. 79, 4877-4885 (2005).</li><li>Picker, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+induces+CD4+effector+memory+T+cell+production+and+tissue+emigration+in+nonhuman+primates.">IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates.</a> J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).</li><li>Mueller, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+treatment+during+acute+simian+immunodeficiency+virus+(SIV)+infection+increases+viral+set+point+and+accelerates+disease+progression+despite+the+induction+of+stronger+SIV-specific+CD8++T+cell+responses.">IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses.</a> J Immunol. 180, 350-360 (2008).</li><li>O'Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+in+HIV+infection.">Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection.</a> Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).</li><li>Chihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins+preferentially+activate+anti-inflammatory+M2-type+macrophages.">HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages.</a> J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).</li><li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+formation+during+reticulocyte+maturation.">Vesicle formation during reticulocyte maturation.</a> J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).</li><li>Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+and+viral+infection.">Microvesicles and viral infection.</a> J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).</li><li>Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Nef+protein+is+secreted+into+vesicles+that+can+fuse+with+target+cells+and+virions.">HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions.</a> Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).</li><li>Muratori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+Secretion+by+T+Cells+Is+Caused+by+HIV+Nef+in+Infected+Cells+and+by+Nef+Transfer+to+Bystander+Cells.">Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells.</a> Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).</li><li>Lenassi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Nef+is+Secreted+in+Exosomes+and+Triggers+Apoptosis+in+Bystander+CD4+T+Cells.">HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells.</a> Traffic. 11, 110-122 (2009).</li><li>Raymond, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Type+1+Nef+Is+Released+from+Infected+Cells+in+CD45++Microvesicles+and+Is+Present+in+the+Plasma+of+HIV-Infected+Individuals.">HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals.</a> AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).</li><li>James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Nef+Protein+Targets+CD4++T+Cells+for+Apoptosis+by+Interacting+with+CXCR4+Surface+Receptors.">Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors.</a> Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).</li><li>Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Nef-CXCR4+Interactions+Important+for+Apoptosis+Induction.">Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction.</a> Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).</li><li>Konadu, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+cytokines+with+exosomes+in+the+plasma+of+HIV-1-seropositive+individuals.">Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals.</a> Journal of Infectious Diseases. , (2014).</li><li>Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+between+exosomes+and+HIV-1:+purification+of+both+vesicles+from+cell-free+supernatants.">Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants.</a> J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+RNA-Containing+Exosomes.">Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes.</a> J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).</li><li>McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+microRNA+Profiling+of+Exosomes+Derived+from+Blood+and+Culture+Media.">Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media.</a> J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).</li><li>Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+Precipitation+Method+to+Isolate+Urinary+Exosomes.">A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes.</a> J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).</li><li>L&#246;tvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

만성 면역 활성화 (CIA) 및 CD4 + T 세포 고갈은 HIV-1 감염의 두 가지 중요한 특징이다. 그들은 중앙 정보국 (CIA)이 가장 좋은 예측 인자 인 상태, 발병 기전에 대한 예측 인자로 설립되었다. 그러나, 만성 전신성 면역 활성화와 CD4 + T 세포의 감소를 구동 기전은 아직 완전히 규명되지 않았다. 우리와 다른 연구소는 HIV-1에 감염된 세포에서 분비되는 엑소 좀은 모두 특징에 중요한 역할을한다는 확고한 증거를 개발했다. 모두 조성과 세포 외 소포의 기능에 계속 관심이 세포 배양 매체와 생물 유체 24-26 모두에서 엑소 좀 격리를위한 다양한 방법의 출판하게되었다. 엑소 콘텐츠 및 기능적 활동 모두를 조사 할 수있는 능력을 유지하면서 그러나, HIV-1 발병 엑소 좀의 역할을 조사하는 장벽은 HIV-1 입자로부터 엑소 좀의 효율적인 분리되었다. 우리는 프로토를 개발했다iodixanol 속도 구배를 이용하여 인간 혈장 내 HIV-1의 입자에서 엑소 좀 정화용 내지 컬럼. 본 연구에서 사용 된 HIV 양성 공여체는 항 레트로 바이러스 치료 및 206,000 바이러스 입자 / ㎖ (21)의 평균 40 만 1500 바이러스 입자 / ㎖를 함유 이들 실험에 사용되는 혈장 샘플을 수신하지 않았다. 따라서, 우리는 바이러스 부하가 높은 경우에도, HIV-1 감염자의 혈장에서 엑소 좀을 효율적으로 HIV-1 바이러스 입자로부터 분리 될 수 있다는 것을 보여준다. 크기 및 밀도에서 유사하지만, 엑소 좀은 고밀도 / 하부 분획으로 분리 바이러스 입자에 비해 iodixanol 구배 저밀도 / 상부 분획으로 분리. iodixanol 구배 법에 의해 제조 된 엑소 좀은 고순도 및 세포 외 단백질을 오염 자유 롭다. 절연 엑소 좀 인구의 순도 P24 ELISA 및 HIV-1 P24 캡시드 단백질을 웨스턴 블랏 분석을 이용하여 확인할 수 있었다뿐만 아니라 exosomal 마커, 아세틸 콜린, CD9, CD45, 및 CD63에 대한 서양의 분석과 같은. 이들 마커를 사용 엑소 식별 27 최근 발표 된 가이드 라인에 일치한다. 더 중요한 생리 면역 활성화에, HIV-1 감염자로부터 정제 된 엑소 좀은 HIV-1 엑소 좀 혈청 음성 대조군보다 훨씬 높은 농도의 사이토킨 / 케 모킨을 함유하는 것으로 확인되었다. 또한, HIV-1 감염된 개체로부터 엑소 좀은 메모리 및 중앙 나이브 CD4 + 및 CD8 + T 세포의 표면 상에, 활성화 마커 CD38의 수준 증가를 유도 할 수있는 능력을 나타내는 생물학적 활성이었다. 종합적으로, 이러한 데이터는 HIV 감염시 영구 면역 활성화를 구동 할 수있는 메커니즘을 제안한다. 결과 우리는 차등 원심 iodixanol 속도 구배 분리는 값을 보여 우리의 결합 엑소 정제 공정을 사용하여 수득 할 수 있었다생리적 기능에 대한 생물 검정 고순도 엑소 좀을 사용. 절차는 특정 함정과 한계를 가지고있다. 엑소 좀의 상당량, 아세틸 콜린 활성의 측정에 의해 계산 된 출발 물질들은 대부분은, 프로세스 동안 손실된다. 또한, 절차는 시간을 소비하며 고가의 장비에 대한 액세스를 필요로한다. 마지막으로, 그라데이션 fromer 장치를 이용 iodixanol 구배의 발생 재현성을 보장하기 위해 상당한 연습이 필요하다. 그라데이션 세대를위한 또 다른 방법은 그라디언트 형성 할 수 있도록 원심 분리기 튜브에 솔루션을 조심 레이어 및 배양 O / N 다음에 iodixanol 솔루션의 등급 시리즈를 준비 할 수 있습니다. 그러나, 우리는이 대안을 테스트하지 않았습니다. 인간 혈장에서 HIV-1 입자로부터 분리 및 엑소 좀의 분리를 위해 여기에 설명 된 실험 프로토콜은 EX의 순도를 보장하는 효과적인 방법osomes. 이 방법의 사용은 HIV-1 기전의 엑소 좀의 역할에 대한 미래의 질문에 대한 흥미로운 길을 주도하고 동등하게 다른 생물학적 과정에 대한 문의에 사용될 수있다.

HIV-1 전염병은 세계에 걸쳐 상당한 영향을 계속. 2013 년으로, 전 세계적으로 약 35 만 명이 HIV에 살고,이 중 210 만 새로 감염된 사람 1이었다. 예방 전략과 항 레트로 바이러스 치료에 증가 접근은 HIV의 전체 인수를 줄이는데 도움이되고있다. 그러나, 개인의 인구는 여전히 HIV 1의 인수에 상승을 경험하고있다. 따라서,이 전염병을 해결하기 위해 계속 노력이 필요하다. 에이즈 질병 진행의 가장 강력한 예측 인자 중 하나는 만성 면역 활성화 (CIA) 2-10이다. 검출 사이토 카인 및 T 림프구의 표면에 높은 표현 마커의 지속적으로 높은 수준의 정의, 중앙 정보국 (CIA)은에 기인하고있다 : 나는 11 IFN 유형 I) 연속 수지상 세포 생산; HIV 단백질 문신, 네프와 gp120의 (12)에 의해 구동 (II) 직접 면역 활성화; (III장 관련 면역 세포 6 박테리아 단백질) 전좌. 그러나, 정확한 메커니즘은 만성 하부는 HIV 감염에 전신성 면역 활성화는 완전히 밝혀지지 남아있다. 우리의 연구 그룹과 다른 사람은 에이즈 발병 15 ~ 18의 엑소 좀의 역할을 증명하고있다. 우리 그룹 네프 단백질 엑소 좀 15에 감염된 세포로부터 분비되는 것으로 판정하였으며, exosomal 네프 (exNef)은 나노 그램 수준 18 HIV 감염자의 혈장에 존재한다. 우리는 또한, 단핵구 / 대 식세포가 exNef에 의한 세포 사멸에 반응했다. exNef에 노출 된 CD4 + T 세포가 CXCR4 통로 (19), (20)에 따라 활성화 유도 된 세포의 죽음을 초래하는 방관자를 표시하지만, 변형 된 세포 기능 및 사이토 카인의 발현을 전시했다. HIV에 감염된 사람의 혈장에서 분리 된 가장 최근에, 우리 그룹이 보여 주었다 엑소 좀은 염증성 사이토 카인의 다양한 포함되어 있습니다. 부rther, 메모리 및 중앙 나이브 CD4 + 및 CD8 + T 세포상에서 CD38의 발현을 유도하는 HIV 감염 환자에서 혈장 유래 엑소 좀에 노출 나이브 말초 혈액 단핵 세포. 이 가능성이 전신 염증과 방관자 세포 활성화 (21)를 통해 바이러스 전파에 기여하고, 엑소 좀은 에이즈 발병 기전에 중요한 역할을한다는 것을 의미한다. HIV의 병인에서 엑소 좀의 역할을 조사하고, 하나의 도전은 HIV 입자로부터 효율적으로 분리 된 엑소 좀 exosomal 콘텐츠를 유지하면서,뿐만 아니라 면역 조절 성 기능적 능력에 기술들을 개발하고있다. 몇몇 방법은 세포 배양 물 및 생물학적 유체 (22, 23)에서 엑소 좀을 분리를 위해 설명되었다. 그들의 작은 크기 및 낮은 밀도 (엑소 좀은 1.15의 밀도 부동 - 1.19 g / ㎖), 차동 초 원심 분리 및 / 또는 한외 여과가 엑소 아이솔레이션 (23)이 가장 일반적으로 사용되는 기술이다.그러나 HIV에 감염된 세포 배양 상층 액과 환자의 혈장은 엑소 좀과 HIV-1 바이러스 입자를 모두 포함되어 있습니다. 엑소 좀과 HIV-1 입자 크기와 밀도 모두에서 매우 유사합니다. 대안 적으로, CD63, CD45 및 CD81와 같은 고유 exosomal 마커의 발현을 활용 엑소 좀은 면역 캡처 방법 (23)을 사용하여 분리되었다. 이 절차는 엑소 좀에서 바이러스를 분리 할 수​​ 있습니다. 그러나,이 기술의 단점은 배양에서 엑소 좀의 면역 가능성을 방해 할 수있는 평가 엑소 좀 정제, 항체의 단단한 부착이다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 Iodixanol 속도 구배를 사용하여 HIV의 Cantin에서 변성 인간 혈장 내의 입자 및 동료 엑소 좀 (22)로부터의 정제 방법을 개발 하였다. 바이러스 입자는 높은 반면에 편석 엑소 좀은 저밀도에서 iodixanol 구배 / 상부 분획을 분리하는 것으로 나타났다밀도 / 낮은 분수. 바이러스 입자는 P24 ELISA에 의해 식별하고, 엑소 좀은 아세틸 콜린 엑소 마커, CD9, CD63 및 CD45를 사용하여 확인 하였다. 수집 상단 저밀도 분수는 HIV-1의 P24 오염에 대한 음성이었다 엑소 좀을 포함. 인간 혈장에서 HIV 입자로부터 엑소 좀의 효율적인 정제 및 분리는 인간 혈장뿐만 아니라 면역 조절 성 전위의 조사 및 HIV-1 발병 엑소 좀의 진단 및 예후 유래의 엑소 좀의 컨텐츠에 대한 정확한 검사를 허용한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="506">
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">BD Vacutainer EDTA tubes (10ml)&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:101px;">368589</td>
			<td style="width:127px;">pink top tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Lymphoprep Ficoll reagent</td>
			<td style="width:92px;">Cosmo Bio</td>
			<td style="width:101px;">AXS-1114545</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Optiprep iodixanol reagent</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">D1556</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">14ml ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:92px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:101px;">344060</td>
			<td style="width:127px;">ultraclear tubes</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">Gradient Former Model 485</td>
			<td style="width:92px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:101px;">165-4120</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Acetylthiocholine iodide</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">1480</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Benzoic Acid</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">D8130</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">S5761</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Acetyl Cholinesterase</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">C3389</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:187px;">96-well clear microtiter plate</td>
			<td style="width:92px;">Medical Supply Partners</td>
			<td style="width:101px;">TR5003</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">SpectraMax 190 microplate reader</td>
			<td style="width:92px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:101px;">190</td>
			<td style="width:127px;">Fluorescent plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">Criterion Gel Electrophoresis Cell</td>
			<td style="width:92px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:101px;">165-6001</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">Transblot Gel&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:92px;">BIO-RAD</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">170-3910</td>
			<td rowspan="2" style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Transfer Cell</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">Tris-HCl Criterion precast gels</td>
			<td style="width:92px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:101px;">567-1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Anti-CD45 antibody&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Abcam&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Ab10558</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">CD63 Antibody (H-193)</td>
			<td style="width:92px;">Santa Cruz Biotech, Inc.</td>
			<td style="width:101px;">SC-15363</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">CD9 Antibody (H-110)</td>
			<td style="width:92px;">Santa Cruz Biotech, Inc.</td>
			<td style="width:101px;">SC-9148</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">Rabbit pAb p24 HIV-1&#160;</td>
			<td style="width:92px;">ImmunoDX, LLC</td>
			<td style="width:101px;">1303</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Nitrocellulose membrane&#160;</td>
			<td style="width:92px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:101px;">G1472430</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">Tris Buffered Saline</td>
			<td style="width:92px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:101px;">170-6435</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:187px;">HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td style="width:92px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">31460</td>
			<td style="width:127px;">Goat-Anti-Rabbit</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td style="width:92px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">31430</td>
			<td style="width:127px;">Goat-Anti-Mouse</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">Western Blotting Luminol Reagent</td>
			<td style="width:92px;">Santa Cruz Biotech, Inc.</td>
			<td style="width:101px;">SC-2048</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">GE LAS-4010 Imager</td>
			<td style="width:92px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">LAS-4010</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:187px;">Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix&#160;</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:127px;">Custom immunoassay panel</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">Bio-Plex 200 Immunobead Reader</td>
			<td style="width:92px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:101px;">171-000201</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">Coulter Z2 Particle Counter</td>
			<td style="width:92px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:101px;">383552</td>
			<td style="width:127px;">Cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:187px;">Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3</td>
			<td style="width:92px;">BD Bioscience (UCHT1)</td>
			<td style="width:101px;">300424</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">APC/Cy7-labeled anti-CD4</td>
			<td style="width:92px;">Biolegend (OKT4)</td>
			<td style="width:101px;">317418</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:187px;">PerCP-labeled anti-CD4</td>
			<td style="width:92px;">BD Bioscience (RPA-T8)</td>
			<td style="width:101px;">550631</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:187px;">V450-labeled anti-CD8</td>
			<td style="width:92px;">BD Bioscience (RPA-T8)</td>
			<td style="width:101px;">560347</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:187px;">Biotin-labeled anti-CD45RA</td>
			<td style="width:92px;">BD Bioscience (HI100)</td>
			<td style="width:101px;">555487</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">PE/Cy7-labeled anti-CD62L</td>
			<td style="width:92px;">Biolegend (DREG-56)</td>
			<td style="width:101px;">304822</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">PE/Cy5-labeled anti-CD38</td>
			<td style="width:92px;">Biolegend (HIT2)</td>
			<td style="width:101px;">303508</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">APC/Cy7-labeled anti-HLADR</td>
			<td style="width:92px;">Biolegend (L243)</td>
			<td style="width:101px;">307618</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin</td>
			<td style="width:92px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:101px;">551487</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">PE/Cy5-labeled mouse IgG1K</td>
			<td style="width:92px;">Biolegend (MOPC-21)</td>
			<td style="width:101px;">400116</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:187px;">APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK</td>
			<td style="width:92px;">Biolegend (MOPC-173)</td>
			<td style="width:101px;">400229</td>
			<td style="width:127px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of exosomes from the plasma of hiv-1 positive individuals

엑소 좀은 세포 유형의 다양한 구성 적 자극 모두에 릴리스이 30 nm 내지 100nm 범위의 크기에 작은 소포이다. 이들은 생물학적 유체의 번호에서 발견되는 단백질, 지질, 핵산 분자의 다양성을 수행하는 것으로 알려져있다. 원래 세포 파편을위한 저수지보다 더 작은, 생물학적 과정을 조절하는 엑소 좀과 질병의 역할이 점점 더 감사합니다 것으로 생각했다. 방법은 여러 세포 배양 배지, 생물학적 유체에서 엑소 좀을 분리를 위해 설명되었다. 그들의 작은 크기 및 저밀도, 초 원심 미분 및 / 또는 한외 엑소 격리를위한 가장 널리 사용되는 기술들이다. 그러나, HIV-1에 감염된 개인의 플라즈마는 크기와 밀도 비슷 두 엑소 좀과 HIV 바이러스 입자가 포함되어 있습니다. 따라서, 인간 혈장에서 HIV 바이러스 입자에서 엑소 좀을 효율적으로 분리하고있다도전. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 Cantin 등으로부터 변성 과정을 개발 하였다. 알., 인간 혈장에서 HIV 입자에서 엑소 좀 정화용 2008. Iodixanol 속도 구배는 HIV-1 양성 개인의 혈장에서 HIV-1 입자에서 엑소 좀을 분리 하였다. 바이러스 입자는 P24 ELISA에 의해 확인되었다. 엑소 좀은 엑소 마커 아세틸 콜린 에스 테라 제의 기초 (아세틸 콜린), 및 CD9, CD63 및 CD45 항원을 동정 하였다. 우리 구배 절차는 바이러스 입자의 자유로운 엑소 제제를 수득 하였다. 인간 혈장에서 엑소 좀의 효율적인 정제 혈장 유래 엑소 좀의 내용을 검사하고, 면역 조절 성 전위 및 기타 생물학적 기능을 조사 할 수있었습니다.

엑소 좀을 효율적으로 HIV-1 긍정적 인 인간 혈장에서 정제된다. 아세틸 콜린 (아세틸 콜린) 활동에 의해 식별 고립 된 엑소 좀을, HIV-1 항원 P24에 의해 확인 된 바이러스 입자 반면, iodixanol 그라디언트의 상단에 낮은 밀도 분획 1-3에서 분리 (하단, 10-12) 고밀도 분획으로 분리. 엑소 좀의 존재는 상기 마커 아세틸 콜린 엑소, CD9, CD45 및 CD63, 및 전자 현미경에 의해 (도 2)의 면역 인식에 의해 확인 하였다. 염증성 사이토 카인과 케모카인은과 관련된 크게 HIV-1 혈청 양성 개인의 엑소 좀에 상승하고 있습니다. 정제 된 엑소 좀과 미분 획 플라즈마에서 HIV-1 감염과 HIV-1 혈청 음성 개인이 멀티 플렉스 분석에 의해 21 사이토 카인 / 케모카인을 분석 하였다. 모든 21 사이토 카인 / 항암 치료kines는 HIV-1 긍정적 인 개인으로부터 격리 엑소 좀 검출되었다. HIV-1 혈청 음성 컨트롤 (표 1)에서 플라즈마와 비교하여 엑소 좀 또한 그 레벨이 크게 상승 하였다. CD38 발현은 HIV-1 혈청 양성 개체로부터 엑소 좀에 노출 된 세포의 표면 상에 증가 하였다. 감염되지 않은 인간 공여자로부터의 PBMCs를가 활성화 마커 CD38의 수준에 대한 HIV-1 혈청 양성 또는 혈청 음성 개체로부터 풀링 된 엑소 좀에 48 시간 동안 노출되고 평가되었다 CD4 + 및 유세포 통해 T CD8 + 세포. 우리는 관찰 48 시간 노출 후, CD4 + 및 CD8 + T 세포가 상당히 HIV 음성 엑소 처리 및 미처리 비교 HIV-1 양성 개체로부터 엑소 좀에 노출 된 T 세포에서 증가 하였다 나이브 및 중앙 메모리의 표면 상 CD38 발현에 의해 컨트롤 (그림 3). HIV-1 긍정적 인 인간 혈장에서 엑소 좀 분리의 도식 표현을 그림. (A)의 말초 혈액 10 ml를 HIV-1 및 seropositve 혈청 음성 개체로부터 수집 하였다. (B) EDTA 혈액 수집 튜브는 RT에서 20 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리 하였다. (C) 분리 플라즈마 1X PBS 및 (D)로 ½ 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 옮기고, 희석시키고 30 분 동안 10,000 XG을 원심 분리 하였다. (E) 상등액을 초 원심 분리기 튜브에 옮기고, (F)를 2 시간 동안 10,000 XG에서 원심 분리 하였다. (G, H) 상층 액을 버리고 엑소 좀 펠렛을 재 - 현탁하고, 1X PBS 1 ㎖로 세척 하였다. 원심 이하의 (I)는, 상등액을 버리고 펠릿 1X PBS 1 ㎖에 재 현탁하고 2 시간 동안 250,000 XG에서 원심 6~18% iodixanol 속도 구배 및 (J)에 오버레이. 원심 분리하기 (K), 구배의 위에서 아래로 1 ml의 분획을 TRA이었다1.5 ㎖의 튜브 nsferred 및 아세틸 콜린 함량 및 면역 블롯 분석을 위해 분석 하였다. (L) 분획 2 및 3보다 있었다 합하고 1X PBS 및 2 시간 동안 400,000 XG에서 원심 분리 (M)의 4 ㎖로 희석 하였다. (N)은 원심 분리 후, 상층 액을 버리고 펠릿 염증성 사이토 카인과 케모카인의 발현 분석을 위해 1X PBS 1 ㎖에 다시는 탁. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53495/53495fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53495/53495fig2.jpg" /> 그림 2. 엑소 좀을 효율적으로 인간 혈장에서 정제된다. HIV 양성자 또는 혈청 음성 개인의 개별 iodixanol 속도 구배의 분수를 (A) 아세틸 콜린 에스 테라 제에 대한 효소 분석 (아세틸 콜린), 및 exosomal 마커 CD9, CD의 (B) 웨스턴 블롯 분석을 실시 하였다45, CD63 및 바이러스 단백질 P24 하였다 (C) 항 CD63과 immunolabeled 정제하여 엑소 좀 (C)의 제조를 확인하는 전자 현미경으로 관찰하고. (허가에 의해 사용 Konadu 등의 알 2014 년 21에서 그림). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53495/53495fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53495/53495fig3.jpg" /> 면역 잠재적 그림 3. 분석에서. PBMC를 HIV-1 혈청 음성 개인은 HIV-1 혈청 양성의 플라즈마 (HIV + 출) 또는 혈청 음성에서 풀 엑소 좀 하나에 치료 (HIV-출) 개인이, 왼쪽에 노출, 또는 처리 한 5 μg의 / 양성 대조군으로 콘 카나 발린의 ㎖ (콘). 48 시간 노출 후, 나이브 (CD45RA + / CD62L +), 중앙 (TCM, CD45RA- / CD62L +)와 이펙터 (TEM; CD45RA- / CD62L-) 메모리 CD4 +와 CD8 + T 세포는 유동 세포 계측법에 의해 CD38 발현에 대해 분석 하였다. 엑소 농도로 총 단백질 및 1 μg의 규격화 / ㎖로 첨가 하였다. 오차 막대는 +/- 평균 나타내는 여섯 독립적 인 기증자의 SEM. 그룹 간의 차이는 편도 분산 분석 시험에 의해 통계적 유의성에 대해 시험 하였다. * P &lt;0.05, ** P &lt;0.01, *** P &lt;0.001, **** P &lt;0.0001. (허가에 의해 사용 Konadu 등의 알에서 그림 2014 21). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53495/53495fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/53495/53495table1.jpg" /> 염증성 사이토 카인과 케모카인의 발현에 대한 정제 엑소 좀과 HIV-1 혈청 양성에서 전체 혈장과 혈청 음성 개인 표 1. 분석. </strong&gt; HIV-1 혈청 양성 또는 혈청 음성 개체로부터 정제 엑소 좀은 염증성 사이토 카인 및 케모카인의 발현을 분석 하였다. 측정 된 모든 21 염증성 사이토 카인과 케모카인은과 관련이 상당히 혈청 음성 컨트롤에 비해 HIV-1 혈청 양성 개인의 엑소 좀에 상승했다. 또한, IL-1A는 IFNa2 및 CXCL10 크게 혈청 음성 대조군과 비교하여 HIV-1 개인의 혈청 양성 혈장 분획에서 증가 하였다. 그룹 간의 차이는 맨 - 휘트니 U 시험에 의해 통계적 유의성에 대해 시험 하였다. * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001, *** p &lt;0.0001. (허가에 의해 사용 Konadu 등의 알 2014 년 21에서 그림). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53495/53495table1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1 양성 개인의 플라즈마에서 엑소 좀의 분리

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

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17.2K 조회수.  Morehouse School of Medicine. Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

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Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' surface envelope glycoprotein. We previously proposed that the crown of the V3 loop, although dynamic and sequence variable, is constrained throughout the population of HIV-1 viruses to an immunologically relevant &beta;-hairpin tertiary structure. Importantly, there are thousands of different V3 loop crown sequences in circulating HIV-1 viruses, making 3D structural characterization of trends across the diversity of viruses difficult or impossible by crystallography or NMR. Our previous successful studies with folding of the V3 crown1, 2 used the ab initio algorithm 3 accessible in the ICM-Pro molecular modeling software package (Molsoft LLC, La Jolla, CA) and suggested that the crown of the V3 loop, specifically from positions 10 to 22, benefits sufficiently from the flexibility and length of its flanking stems to behave to a large degree as if it were an unconstrained peptide freely folding in solution. As such, rapid ab initio folding of just this portion of the V3 loop of any individual strain of the 60,000+ circulating HIV-1 strains can be informative. Here, we folded the V3 loop of the R2 strain to gain insight into the structural basis of its unique properties. R2 bears a rare V3 loop sequence thought to be responsible for the exquisite sensitivity of this strain to neutralization by patient sera and monoclonal antibodies4, 5. The strain mediates CD4-independent infection and appears to elicit broadly neutralizing antibodies. We demonstrate how evaluation of the results of the folding can be informative for associating observed structures in the folding with the immunological activities observed for R2.

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The crown region of different V3 loop sequences of the surface envelope glycoprotein (gp120) of HIV-1 can be structurally characterized in many cases by in silico folding of positions 10 to 22 of the loop using a state-of-the-art ab initio folding algorithm. Here we demonstrate the folding and evaluation of this region of the V3 loop from the R2 strain of HIV-1, a uniquely neutralization sensitive strain with puzzling functional properties.

하여 HIV - 1 V3 루프 크라운 R2 시퀀스 Immunologically 관련 동적 차 구조 기능의 평가 순이 론적 접는

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' ...

연구

면역학 및 감염병학

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, the LTR is also responsive to cellular activation states and to the local chromatin activity where the integration has occurred. This can result in high HIV-independent activity, and has restricted the usefulness of LTR-based reporter to mark HIV positive cells 1,2,3. Here, we constructed an expression lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, numerous HIV DNA sequences that include the Rev-response element and HIV splicing sites 4,5,6. The vector was incorporated into a lentiviral reporter virus, permitting highly specific detection of replicating HIV in living cell populations. The activity of the vector was measured by expression of the green fluorescence protein (GFP). The application of this vector as reported here offers a novel alternative approach to existing methods, such as in situ PCR or HIV antigen staining, to identify HIV-positive cells. The vector can also express therapeutic genes for basic or clinical experimentation to target HIV-positive cells.

We have developed a lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, the Rev-response element (RRE) that can regulate reporter gene expression in an HIV-1 Tat- and Rev-dependent fashion. The vector permits the specific detection of replicating HIV in living cells via the expression of GFP.

그린 형광 단백질을 표현 레브 종속 Lentiviral 벡터를 사용하여 HIV - 1 양성 세포의 특정 마킹

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

표준 임상 Assays에 의해 탐지의 한도 이하 바이러스성로드와 HIV 감염된 개인의 확장 및 HIV - 1 RNA를 Quantifying

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV - 1 코어의 시험 관내 Uncoating에서

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

새로운 도구는 HIV-1에 감염된 개인으로부터 규제 T 세포를 확장하려면

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

셀 기반의 ELISA 분석을 사용하여 HIV-1 삼량 봉투 당 단백질의 구조적 평가

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

뉴 클레오 캡시드 소둔 매개 전기 영동 (NAME) 분석은 HIV-1 뉴 클레오 캡시드 억제제의 신속한 식별을 할 수 있습니다

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

거대한 단일 층 소포 (GUV) 막 바인딩 HIV-1 개그의 시각화

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...