This work was supported by the NRF grant HUJ-CREATE - Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.

마우스는 euthanization까지 제도적 지침 (기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인 싱가포르 국립 대학과 실험 동물 연구를위한 국가 자문위원회 (NACLAR) 지침)을 준수 무균 상태에서 보관 하였다. 1. 마우스 <ol><li> 해당 유전 적 배경 중 하나 마우스를 주문하십시오. 이 프로토콜은 하나의 C57BL / 6 마​​우스 유래의 조직에 기초한다. </li></ol> 완전 배지 2. 준비 <ol><li> 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 50 μM 2- 머 캅토 에탄올, 100 μM 아스파라긴, 2 mM의 글루타민, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액 로즈웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 1640 배지에하기 성분을 첨가함으로써 완전 배지를 준비한다. </li></ol> 효소 솔루션 3. 준비 <ol><li> 15 ML 원뿔 바닥 튜브 콜라게나 D 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 콜라게나 디 디의 10 mg의 무게4 용액에 ssolve 콜라게나 D 완전한 매체. </li></ol></li><li> 1.7 ml의 microcentrifuge 관에서 프로 나아 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 프로 나제​​ 10 mg의 무게. </li><li> 1 M 트리스 완충액 (pH 8.0)의 5 μl를 추가합니다. 의 0.5 M EDTA (pH 8.0) 1 μl를 추가합니다. </li><li> 멸균 물 494 μL와 최고. </li><li> 30 분 동안 수욕에서 37 ℃에서 프로 나제​​ 용액을 부화. </li></ol></li></ol> 콜라게나 D-프로 나제​​ 믹스 (≤2 꼬리) 4. 준비 참고 : 무균 세포 배양 후드에서 다음 단계를 수행합니다. <ol><li> 콜라게나 D 솔루션의 4 ml의 프로 나제​​ 솔루션의 250 μl를 추가합니다. </li><li> 멸균 15ml의 원뿔형 바닥 튜브에 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 콜라게나 D-프로 나제​​ 혼합물을 전달한다. </li></ol> 귀와 꼬리 조직에서 섬유 아세포의 5 추출 <ol><li> 해당 기관의 지침에 따라 쥐를 안락사.</li><li> 세포 배양 후드에서 멸균 수술기구 (가위와 집게를) 놓습니다. </li><li> 두 10cm 세포 배양 접시에 각각 10 ml의에게 완전한 매체를 추가합니다. </li><li> 귀 (~ 1cm 반경)와 가위와 마우스 (꼬리의 끝에서) 꼬리 5cm를 잘라 멸균 50 ML 원뿔 바닥 튜브에 40 ml의 70 % 에탄올에 5 분 동안 품어. </li><li> 5 분 동안 후드에서 개방 10cm 세포 배양 접시에 배치하여 공기 건조 귀와 꼬리. 일단 단계 5.3에 설명 된대로 전송 귀 두 개의 배양 접시에 꼬리 조각은 &quot;귀&quot;를 10 ml의에게 완전한 매체를 포함하는 &quot;꼬리&quot;를 표시, 건조. </li><li> 귀와 꼬리 사용하여 가위로 머리를 제거합니다. </li><li> 가위를 사용하여 크기가 3mm보다 작은 조각으로 귀와 꼬리를 잘라. </li><li> &quot;귀&quot;와 &quot;꼬리&quot;라고 표시된 1.8 ml의 cryotube 튜브로 절단 된 조직을 전송하고 유리 병에 1.8 ml의 마크에 도달하기 위해 볼륨에 대한 충분한 콜라게나 D-프로 나제​​ 솔루션을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 피쉐이커에 수평으로 cryotube 튜브를 레이스와 37 ℃에서 90 분 동안 200 rpm으로 샘플을 흔들. </li><li> 90 분 부화 후, 진탕 기에서 cryotube 튜브를 제거하고 후드에 튜브를 배치합니다. </li><li> 두 10cm 세포 배양 접시, 표시 &quot;귀&quot;와 &quot;꼬리&quot;각에 10 ml의에게 완전한 매체를 추가하고 각 접시에 70 μm의 셀 스트레이너를 넣어. </li><li> &gt; 5 분 10 ML의 주사기 플런저를 사용하여 조직을 분쇄 강제 단계 5.11에서 제조 된 따라 표시된 요리에 70 μm의 셀 스트레이너의 소화 귀와 꼬리 조직을 놓고. 셀 스트레이너에서 세포를 씻어 매체에 가끔 셀 스트레이너를 흔들어. </li><li> &quot;귀&quot;와 &quot;꼬리&quot;라는 레이블이 붙은 두 개의 15 ML 원뿔 바닥 튜브에 각각의 접시에서 세포 현탁액을 피펫. 추가로 10 ml의 완전한 매체와 요리와 스트레이너를 세척하고 해당 15 ML 원뿔 바닥 튜브에 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 세포를 스핀 다운~ 580 XG에 7 분 및 냉장 세포 원심 분리기를 사용하여 4 ° C의 서스펜션. </li><li> 상등액을 제거 15ml의 원뿔형 바닥 튜브에 세포 펠렛을 10 ㎖를 완전 배지를 추가하고 세포를 재현 탁. </li><li> 단계를 반복 5.14 및 5.15. </li></ol> 세포 혼합물 6. 배양 <ol><li> 상층 액을 제거합니다. 세포 펠렛은 그대로 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 10ml에 세포 전체 매체를 다시 일시 중지하고 &quot;귀&quot;와 &quot;꼬리&quot;라는 레이블이 10cm 세포 배양 접시에 각각의 혼합물을 추가합니다. </li><li> 문화 : 10 μL 암포 테리 신 B 용액 (250 μg의 / ㎖ 원액)를 추가합니다. </li><li> 가습 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 배양한다. </li><li> 셋째 날, 10 ml의 신선한 완전한 파편 제거 암포 테리 신 B의 10 μl를 포함하는 매체 (그림 1, 2)와 매체를 교체합니다. </li></ol> 섬유 아세포의 7 하위 문화 <ol><li> 갔지N 문화는 약 70 % 컨 플루 (일 문화의 3 ~ 4) 매체를 제거하고 5 ml의 멸균 1X 인산 완충 식염수 (PBS)로 세포를 씻어 도달한다. </li><li> PBS를 제거하고 세포에 2 ㎖의 멸균 1X 트립신 EDTA 솔루션을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 가습 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 5 분 동안 세포를 배양한다. </li><li> 5 분 후, 부드럽게 배양 접시를 누르고 세포에 6 ml의에게 완전한 매체를 추가합니다. </li><li> 15ml의 원뿔형 바닥 튜브에 세포 현탁액을 옮기고 냉장 세포 원심 분리기를 사용하여 450 ~ XG, 4 ° C에서 5 분 동안 튜브를 스핀. </li><li> 상층 액을 제거하고 부드럽게 5 ml의 완전 배지에서 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 10cm 세포 배양 접시에 시드 2 × 105 세포 및 7.6 단계 7.1을 반복하기 전의 3-4일위한 가습 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 배양한다. </li></ol> 출하를위한 귀 8. 준비 참고 : T를 수행그는 무균 세포 배양 후드에서 다음 단계. <ol><li> 해당 기관의 지침에 따라 쥐를 안락사. </li><li> 세포 배양 후드로 멸균 가위와 집게를 놓습니다. </li><li> 50 ML 원뿔 바닥 튜브에 50 ㎖를 완전 배지를 추가합니다. </li><li> 가위와 마우스의 귀 (~ 1 센티미터 반경)를 잘라. </li><li> 사용 집게 (3 단계에서 제조 된) 50 ML 원뿔 바닥 튜브에 귀를 전송합니다. </li><li> 해당 상자에 실온에서 출하하기 전에 파라 필름으로 50 ML 원뿔 바닥 튜브를 밀봉합니다. </li></ol>

<ol>
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The authors declare no conflict of financial interests.

여기에서 우리는 귀를 쥐의 꼬리에서 차 섬유 아세포 문화를 확립하기, 간단한 저렴하고 빠른 실험 절차를 제공합니다. 추출은 조직 3 일 후 격리 내에 부착하고 신속하게 분할하는 섬유 아 세포에서 발생한다. 일차 전지의 중요한 한계는 노화, 영구 성장 정지 15이다. 섬유 아세포는 노화되기 전에 프로토콜을 사용하여, 섬유 아세포 배양 크기 (2-3 배 증가) 및 확장 오류 증가, 세포의 평탄화에 의해 지시, 5 ~ 6 회 계대 될 수있다. 섬유 아 세포의 분리를 수행 할 때주의가 섬유 아세포의 낮은 복구가 발생합니다 불충분 절단 또는 소화로, 조직의 중단시 지불해야합니다. 이 섬유 아세포의 수를 증가 귀와 꼬리 섬유 아세포를 풀 수있다. 복막과 동일한 방식으로 처리 된 폐 조직을 포함하여 추가의 조직 (T)을 향상시키기 위하여 적당히 첨가 할 수있다섬유 아세포의 그는 수. 파편은 섬유 아 세포 추출 다음 문화에 존재하지만, 그것은 섬유 아세포는 세포 배양 접시에 부착하는 데 시간이 걸릴 만 사흘 후 매체를 변경하는 것이 좋습니다. 프로토콜의 전위 한계는 비 멸균 조직과 관련된 미생물 오염의 가능성을 사용하는 것이다. 오염의 위험을 줄이기 위해, 귀와 꼬리는 섬유 아세포를 수확하기 전에 70 % 에탄올에서 인큐베이션. 또한, 항진균제는 암포 테리 신 B 섬유 아세포 배양을 설정할 때 효모 및 곰팡이의 생장, 일반적인 문제를 방지하기 위해 주 배양에 첨가된다. 매체는 또한 페니실린과 세균 오염을 방지하기 위해 스트렙토 마이신이 포함되어 있습니다. 이주의 사항을 사용하여, 오염이 거의 몇 일 동안 실온에서 보관 한 귀와 꼬리에서 섬유 아세포를 설정하는 경우에도 관찰되지 않습니다. 이 프로토콜의 중요한 장점 중 하나 인 ABIL성만은 섬유 아세포를 분리하기 전에 10 일 동안 실온에서 매체에 저장된 귀에서 섬유 아 세포를 생성합니다. 우리는 저장 (70-80 %의 포화 상태 갓 격리 조직 3-4 일에 비해 5~6일 이내에 도달 할 때) 10 일 후 귀 섬유 아세포 문화를 확립 소폭 감소 효율을 관찰했다. 특급 배송을 권장하지만, 따라서, 마우스의 귀는, 표준 선박을 이용하여 연구자들에 의해 교환 할 수 있습니다. 경험상, 사용의 용이성 및 귀 조직 실험 절차는 거의 사용되지 않는다는 사실을 얻기 위해 종종 시간 소모 그렇지 수득 될 수도 유전자 변형 마우스의 조직에 접근 할 수있다. 꼬리를 들어 저장 후 복구하는 섬유 아 세포의 효율이 매우 다양 할 수 있고 귀는 선적을 사용할 수없는 경우 꼬리에만 사용되어야한다. 조직의 수확이 마우스의 처리에 최소한의 전문 지식과 훈련이 필요 마지막으로, 대부분의 사람들은, 프로토콜을 수행 할 수 있어야합니다. 프로토콜은 마우스의 조직을 사용하여 테스트되었습니다,하지만 이론 프로토콜이 추가​​ 최적화를해야 할 수도 있지만, 다른 종의 조직을 사용하여 섬유 아세포 문화의 생성을 허용해야합니다.

차 세포는 시험관 조건에서 조직 배양 생활에서 파생됩니다. 그것은 일반적으로 일차 전지가 더 밀접하게 생리 학적 상태와 그들이 불멸 또는 종양 세포 라인 1보다 시작된 조직의 유전 적 배경을 닮은 것으로 가정한다. 그 때문에, 일차 세포는 생물학적 질문 2,3-을 연구하는데 유용한 모델을 나타낸다. 그러나 무한정 성장 설립 세포 라인과는 달리, 일차 전지는 결국 문화의 노화를 받아야 자주 다시 설정해야합니다. 일반적으로 사용되는 세포는 일차 섬유 아세포, 상피 세포, 내피 세포, T 세포, B 세포, 골수 유래 대 식세포 (BMDM) 골수 유래의 수상 세포 (BMDC)를 포함한다. 섬유 아세포는 종종 일차 세포 배양 모델로서 이용된다. 그들은 다른 일차 전지를 통해 주요 장점을 제공합니다. 세포 배양은 쉽게 쉽게 유지, 설립 및 더의 purifica을 필요로하지 않습니다문화 이전에 세포의 기. 그들은 빠른 초기 확산 및 전문 매체 또는 정품 인증 프로토콜에 대한 요구 사항이 있습니다. 섬유 아세포를 효율적으로 생물학적, 화학적, 물리적 프로토콜을 사용하여 형질 4,5- 수있다. 세포 배양을 확립하기 전에 실온에서 최대 10 일 동안 귀를 저장하는 가능성이있다. 섬유 아세포 문화는 세포질 프로세스의 시각화에 도움과 유도 만능 줄기 (IPS) 세포를 6으로 재 프로그래밍에 적합하다. 섬유 아세포는 콜라겐 단백질과 세포 외 기질 (7)을 분비 결합 조직의 중요한 세포이다. 그들은 여러 조직 8 구조적 틀을 제공하고 상처 치유 및 조직 수선에 9,10- 필수적인 역할을한다. 여기, 우리는 섬유 아세포 귀에서 문화와 마우스 (11)의 꼬리를 확립하기 간단하고 빠른 (&lt;4 시간) 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 최소한의 마우스가 필요합니다경험 (12,13 다른 프로토콜과 대조적으로) 조직을 수확하는 최대 10 일 동안 실온에서 저장 매체에 귀에서 배양을 확립하는데 사용될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:140px;">HyClone</td>
			<td style="width:119px;">SH30027.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:140px;">HyClone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Asparagine</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamine</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:140px;">HyClone</td>
			<td style="width:119px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:140px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">107017</td>
			<td>Absolute for analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:140px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">11088866001</td>
			<td>From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pronase protease</td>
			<td style="width:140px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">53702</td>
			<td>From Streptomyces griseus&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris buffer (pH 8)</td>
			<td style="width:140px;">1st BASE</td>
			<td style="width:119px;">1415</td>
			<td>Ultra pure grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5M EDTA (pH 8)</td>
			<td style="width:140px;">1st BASE</td>
			<td style="width:119px;">BUF-1053</td>
			<td>Biotechnology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:140px;">1st BASE</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2040-10X4L</td>
			<td>Ultra pure grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA solution 10X</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">59418C-100ML</td>
			<td>0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2492-20ml</td>
			<td>250 &#956;g/ml in deionized water, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scissors</td>
			<td style="width:140px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcep</td>
			<td style="width:140px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">AE-BD312R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2 &#956;M syringe filter</td>
			<td style="width:140px;">Sartorius Stedim</td>
			<td style="width:119px;">16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70 &#956;M cell strainer</td>
			<td style="width:140px;">SPL</td>
			<td style="width:119px;">93070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe plunger</td>
			<td style="width:140px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">SS+10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cryovial tube</td>
			<td style="width:140px;">NUNC</td>
			<td style="width:119px;">368362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.7 ml microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:140px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 cm cell culture dish</td>
			<td style="width:140px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">664160</td>
			<td>Cell culture treated dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml conical bottom tube</td>
			<td style="width:140px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 ml conical bottom tube</td>
			<td style="width:140px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Water bath</td>
			<td style="width:140px;">GFL</td>
			<td style="width:119px;">1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubation shaker</td>
			<td style="width:140px;">Sartorius Stedim</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Certomat-BS1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axiovert 25 light microscope</td>
			<td style="width:140px;">Carl Zeiss AG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues

차 세포는 조직에서 직접 파생 된 설립 세포주에 비해 생체 내에서 세포의 생리 학적 상태를보다 잘 나타내는 것으로 생각된다. 그러나, 일차 세포 배양 물은 일반적으로 제한된 수명을 가지며 빈번하게 재 확립 될 필요가있다. 섬유 아세포는 일차 전지의 쉽게 접근 할 수있는 소스입니다. 여기, 우리가 귀 마우스의 꼬리에서 차 섬유 아세포 문화를 확립하기 간단하고 빠른 실험 절차에 대해 설명합니다. 프로토콜은 최대 10 일 동안 실온에서 저장 귀에서 일차 섬유 아세포 배양을 확립하는데 사용될 수있다. 프로토콜에 따라 신중하게되면 오염은 일부 경우에 장시간 저장된 비 멸균 조직의 사용에도 불구하고 발생하기 어렵다. 섬유 아세포 문화에 빠르​​게 증식과 복제 성 노화가 진행되기 전에 상당한 숫자로 확장 할 수 있습니다.

조직 파편의 상당한 양의 조직 결과에서 섬유 아세포의 추출 (도 1). 조직 파편과는 대조적으로, 섬유 아세포는 1 일, 문화의 3 사이의 조직 배양 플라스틱 표면에 부착. 섬유 아세포 배양 매체는 안전하게 크게 문화 (그림 2)에서 파편 현재의 수준을 감소해야 문화의 3 일에 변경 될 수 있습니다. 섬유 아세포는 가늘고 긴 형태와 명확하게 볼 세포질 (그림 1과 2)를 표시합니다. 유사 분열 세포는 이후 문화의 3 일에서 존재해야하고 세포 배양 3 ~ 4 일 이내에 세포 자랄 때 70 ~ 80 %에 도달해야한다. 10cm 배양 접시에 귀와 꼬리 조직에서 수율은 4 5 10 × 5 (귀), 문화의 3 일에서 5 5 10 × 6 전지 (꼬리) 범위. 섬유 아세포의 분리에 이어 세 번째 날, 세포를 계대 배양 할 수 있고, 10cm 배양 접시 당 2 × 105 세포로 시딩. 십일 동안 실온에서 저장 귀에서 섬유 아 세포의 추출 문화의 5~6일 내 70-80% 세포 포화 상태 (그림 3)가 발생한다. 5 일 후 10cm의 배양 접시 당 2 × 10 5 세포에서 세포를 심는 것은 또한 문화 3 ~ 4 일 이내에 약 1 × 10 6 세포를 야기한다. 장기 보관이 우리의 경험에서 노화 섬유 아세포를 입력하는데 걸리는 시간에 영향을 미치지 않는다 (데이터는 도시하지 않음). 멘틴 염색 (그림 4)로 표시된 바와 같이 배양 3 일 후 세포의 신원을 확인하기 위해, 세포가 위의 프로토콜을 사용하여 섬유 아 세포 마커 멘틴 (14)에 대해 표시 할 수 있습니다, 우리는 정기적으로 순수한 섬유 아세포 배양을 구하십시오. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53565/53565fig1.jpg" /> 앞서 3 일 후 추출 그림 1. 섬유 아세포 문화 매체의 변경합니다.세포 파편의 대표 시야 이미지 (흰색 화살표) 문화의 날 3에 존재. 이미지는 광학 현미경을 이용하여 100 × 배율로 촬영되었다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53565/53565fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53565/53565fig2.jpg" /> 새로운 매체의 첨가 한 후 3 일 후 추출에 그림 2. 섬유 아세포 문화. 문화의 3 일에 섬유 아 세포의 대표 시야 이미지. 이미지는 광학 현미경을 이용하여 100 × 320 × 배율로 촬영되었다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53565/53565fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 3. 십일 동안 실온에서 보관 귀 조직에서 3 일 후 추출에 섬유 아세포 문화. 문화의 3 일에서 섬유 아세포의 대표 시야 이미지. 이미지는 광학 현미경을 이용하여 100 × 320 × 배율로 촬영되었다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53565/53565fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53565/53565fig4.jpg" /> 멘틴에 대한 섬유 아세포 배양의 그림 4. 라벨링. 문화의 3 일에 귀와 꼬리 섬유 아세포의 대표 공 촛점 이미지. 조직에서 추출한 섬유 아세포는 멘틴 (적색) 및 DAPI (파란색) 표지 하였다. 형광 이미지는 공 초점 마이크로 인수했다부. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53565/53565fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

우리는 귀 및 쥐의 꼬리에서 일차 섬유 아세포를 생성하기위한 간단하고 신속한 실험 절차를 설명한다. 절차는 특별한 동물 훈련을 필요로하지 않고, 최대 10 일 동안 실온에서 저장 귀에서 배양 섬유 아세포의 생성을 위해 사용될 수있다.

마우스 귀와 꼬리 조직에서 생성 차 섬유 아세포 배양

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

generating-primary-fibroblast-cultures-from-mouse-ear-and-tail-tissues

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

33.6K 조회수.  Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore.  우리는 귀 및 쥐의 꼬리에서 일차 섬유 아세포를 생성하기위한 간단하고 신속한 실험 절차를 설명한다. 절차는 특별한 동물 훈련을 필요로하지 않고, 최대 10 일 동안 실온에서 저장 귀에서 배양 섬유 아세포의 생성을 위해 사용될 수있다. 

비디오: Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are restricted to two specific neurogenic niches: the subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampus and the ventricular-subventricular zone (V-SVZ; also called subependymal zone or SEZ) in the walls of the lateral ventricles. The development of in vivo gene transfer strategies for adult stem cell populations (i.e. those of the mammalian brain) resulting in long-term expression of desired transgenes in the stem cells and their derived progeny is a crucial tool in current biomedical and biotechnological research. Here, a direct in vivo method is presented for the stable genetic modification of adult mouse V-SVZ cells that takes advantage of the cell cycle-independent infection by LVs and the highly specialized cytoarchitecture of the V-SVZ niche. Specifically, the current protocol involves the injection of empty LVs (control) or LVs encoding specific transgene expression cassettes into either the V-SVZ itself, for the in vivo targeting of all types of cells in the niche, or into the lateral ventricle lumen, for the targeting of ependymal cells only. Expression cassettes are then integrated into the genome of the transduced cells and fluorescent proteins, also encoded by the LVs, allow the detection of the transduced cells for the analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects in the labeled cells and their progeny.

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

연구

발생학

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast physiology and pathology underlie a spectrum of clinical entities, including fibroses in multiple organs, hypertrophic scarring following burns, loss of cardiac function following ischemia, and the formation of cancer stroma. However, fibroblasts remain a poorly characterized type of cell, largely due to their inherent heterogeneity. Existing methods for the isolation of fibroblasts require time in cell culture that profoundly influences cell phenotype and behavior. Consequently, many studies investigating fibroblast biology rely upon in vitro manipulation and do not accurately capture fibroblast behavior in vivo. To overcome this problem, we developed a FACS-based protocol for the isolation of fibroblasts from the dorsal skin of adult mice that does not require cell culture, thereby preserving the physiologic transcriptional and proteomic profile of each cell. Our strategy allows for exclusion of non-mesenchymal lineages via a lineage negative gate (Lin-) rather than a positive selection strategy to avoid pre-selection or enrichment of a subpopulation of fibroblasts expressing specific surface markers and be as inclusive as possible across this heterogeneous cell type.

Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.

FACS에 의해 쥐 피부 섬유 아세포 격리

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and promotion of the tumor microenvironment. While there are currently many techniques for the isolation of MFs from gastrointestinal (GI) tissues, this protocol introduces a novel element of isolation of these stromal cells from frozen tissue. Freezing GI tissue specimens not only allows the researcher to acquire samples from worldwide collaborators, biobanks, and commercial vendors, it also permits the delayed processing of fresh samples. The described protocol will consistently yield characteristic spindle-shaped cells with the MF phenotype that express the markers CD90, &#945;-SMA and vimentin. As these cells are derived from patient samples, the use of primary cells also confers the benefit of closely mimicking MFs from disease states-namely cancer and inflammatory bowel diseases. This technique has been validated in gastric, small bowel, and colonic MF primary culture generation. Primary MF cultures can be used in a vast array of experiments over a number of passage and their purity assessed by both immunocytochemistry and flow cytometry analysis.

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

인간의 냉동 위장 표본에서 CD 90+ 섬유 아세포 / 근섬유 아세포의 분리


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

돼지 피하 지방이 조직에서 분리 및 지방이 유래 줄기 세포의 분화

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

The primary cilium is fundamentally important in neural progenitor cell proliferation, neuronal differentiation, and adult neuronal function. Here, we describe a method to study ciliogenesis and the trafficking of signaling proteins to cilia in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons using primary neurosphere cultures.

차 섬모를 연구에 차 Neurosphere 문화를 사용하여

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

마우스 두개안면 조직 및 분해되지 않은 뼈의 조직 준비 및 면역 염색

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

신경 문장 세포 박리 및 이동의 연구를 위한 마우스에서 1 차적인 두개골 신경 문장 세포의 해부, 문화 및 분석

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

마우스 골격 근 이식에서 기본 근구의 격리 및 분화

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...