This work was supported by the NRF grant HUJ-CREATE - Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.

Die Mäuse wurden in pathogenfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts bis Euthanasie (The Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Richtlinien an der National University of Singapore und der National Advisory Committee für Labortierforschung (NACLAR) Richtlinien) untergebracht ist. 1. Mäuse <ol><li> Bestellen Sie eine Maus der entsprechenden genetischen Hintergrund. Dieses Protokoll basiert auf Gewebe von einer C57BL / 6-Mäusen abgeleitet wurden. </li></ol> 2. Herstellung von Komplettmedium <ol><li> Vorbereitung Komplettmedium durch Zugabe der folgenden Komponenten zu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium, 10% fötales Kälberserum (FCS), 50 uM 2-Mercaptoethanol, 100 uM Asparagin, 2 mM Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung. </li></ol> 3. Vorbereitung der Enzymlösungen <ol><li> Bereiten Kollagenase D-Lösung in einem 15 ml konischen Bodenrohr. <ol><li> Man wiegt 10 mg Kollagenase D. Dissolve Kollagenase D in 4 ml Vollmedium. </li></ol></li><li> Bereiten Pronase-Lösung in einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. <ol><li> Man wiegt 10 mg Pronase. </li><li> Plus 5 ul 1 M Tris-Puffer (pH 8,0). 1 ul 0,5 M EDTA (pH 8,0). </li><li> Füllen Sie mit 494 &amp; mgr; l sterilem Wasser. </li><li> Inkubieren Pronaselösung bei 37 ° C in einem Wasserbad für 30 min. </li></ol></li></ol> 4. Herstellung von Collagenase D-Pronase Mix (≤2 Tails) Hinweis: Führen Sie die nachfolgenden Schritte in einem sterilen Zellkultur Kapuze. <ol><li> Add 250 ul Pronase Lösung auf 4 ml Kollagenase D-Lösung. </li><li> Übergeben Sie die Collagenase D-Pronase Mischung durch einen 0,2 um Spritzenfilter in ein steriles 15 ml konischen Bodenrohr. </li></ol> 5. Gewinnung von Fibroblasten von Ohr und Schwanz Tissues <ol><li> Euthanize Mäusen nach den entsprechenden Richtlinien des Instituts.</li><li> Zeigen autoklaviert chirurgische Instrumente (Schere und Pinzette) in der Zellkultur Kapuze. </li><li> 10 ml Komplettmedium in zwei 10 cm Zellkulturschalen je. </li><li> Geschnitten Ohren (~ 1 cm Radius) und 5 cm des Schwanzes (von der Spitze des Schwanzes) einer Maus mit Schere und Inkubation für 5 min in 40 ml 70% igem Ethanol in einem sterilen 50 ml konischen Unterrohr. </li><li> Luft trocknen Ohren und Schwanz, indem sie in einer offenen 10 cm Zellkulturschale in der Haube für 5 min. Einmal getrocknet, Transfer Ohr und Schwanzstücke, zwei Kulturschalen mit &quot;Ohren&quot; und &quot;Schwanz&quot;, die 10 ml Vollmedium wie in Schritt 5.3 beschrieben. </li><li> Entfernen Sie Haare aus den Ohren und Schwanz mit einer Schere. </li><li> Schneiden Ohren und Schwanz in Stücke kleiner als 3 mm in der Größe mit einer Schere. </li><li> Übertragen Sie die geschnittenen Gewebe in 1,8 ml Kryoröhrchen Fläschchen mit &quot;Ohren&quot; und &quot;Schwanz&quot; und fügen Sie eine ausreichende Kollagenase D-Pronaselösung für das Volumen, um das 1,8-ml-Markierung auf der Flasche zu erreichen. </li><li> Pschnüren die Kryoröhrchen Fläschchen horizontal auf einem Shaker und schütteln Sie die Proben bei 200 Upm für 90 min bei 37 ° C. </li><li> Nach 90 min Inkubation, entfernen Sie die Kryoröhrchen Vials aus dem Schüttler und legen Sie die Durchstechflaschen in der Kapuze. </li><li> 10 ml Komplettmedium in zwei 10 cm Zellkulturschalen, die mit &quot;Ohren&quot; und &quot;Schwanz&quot; jeder, und legte eine 70 &amp; mgr; m Zellsieb in jedem Gericht. </li><li> Legen Sie die verdaut Ohr und Schwanz Gewebe in der 70 &amp; mgr; m Zellsieb in den entsprechend gekennzeichnet Gerichte in Schritt 5.11 vorbereitet und kraftvoll mahlen das Gewebe mit einer 10 ml Spritzenkolben für&gt; 5 min. Schütteln Sie die Zellsieb gelegentlich in dem Medium, um Zellen aus der Zelle Sieb waschen. </li><li> Pipettieren Sie die Zellsuspension aus jeder Schale in zwei 15 ml konischen Boden Rohre mit &quot;Ohren&quot; und &quot;Schwanz&quot;. Waschen Sie die Teller und Sieb mit zusätzlichen 10 ml Komplettmedium und fügen Sie das Medium in die entsprechenden 15 ml konischen Boden Rohre. </li><li> Spin down die ZelleSuspension 7 min bei ~ 580 × g und 4 ° C unter Verwendung einer Kühlzelle Zentrifuge. </li><li> Überstand entfernen, 10 ml Komplettmedium auf das Zellpellet in 15 ml konischen Boden Rohr und die Zellen resuspendieren. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.14 und 5.15. </li></ol> 6. Die Kultivierung des Zellgemisches <ol><li> Überstand entfernen. Stellen Sie sicher, dass das Zellpellet ungestört bleibt. </li><li> Re-suspend-Zellen in 10 ml Vollmedium und fügen Sie die entsprechende Mischung auf zwei 10 cm Zellkulturschalen mit &quot;Ohren&quot; und &quot;Schwanz&quot;. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l Amphotericin B-Lösung (Stammlösung: 250 &amp; mgr; g / ml) zu der Kultur. </li><li> Zellen bei 37 ° C inkubieren in einem befeuchteten 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Am dritten Tag, ersetzen Sie das Medium, das mit 10 ml frisches vollständiges Medium, das 10 &amp; mgr; l von Amphotericin B, um Ablagerungen zu entfernen (Abbildung 1 und 2). </li></ol> 7. Sub-Kultur von Fibroblasten <ol><li> When Kultur erreicht etwa 70% Konfluenz (Tag 3-4 Kultur) Entfernen des Mediums und Waschen der Zellen mit 5 ml sterile 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Entfernen PBS und 2 ml sterile 1x Trypsin-EDTA-Lösung zu den Zellen. </li><li> Die Zellen 5 min bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Nach 5 min, klopfen Sie leicht das Kulturschale und 6 ml Vollmedium zu den Zellen. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml konischen Boden Rohr und drehen Sie das Rohr für 5 min bei ~ 450 xg und 4 ° C unter Verwendung eines Kühlzelle Zentrifuge. </li><li> Überstand abnehmen und vorsichtig resuspendieren das Zellpellet in 5 ml Vollmedium. </li><li> Samen 2 x 10 5 Zellen in einer 10 cm Zellkulturschale und Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2 Inkubator für 3-4 Tage vor der Wiederholung der Schritte 7.1 bis 7.6. </li></ol> 8. Herstellung von Ohren für den Versand Hinweis: Führen Sie ter nachfolgende Schritte in einer sterilen Zellkultur Kapuze. <ol><li> Euthanize Mäusen nach den entsprechenden Richtlinien des Instituts. </li><li> Zeigen autoklaviert Schere und Pinzette in die Zellkultur Kapuze. </li><li> 50 ml vollständigem Medium in einem 50 ml konischen Unterrohr. </li><li> Schneiden Sie die Ohren (~ 1 cm Radius) einer Maus mit einer Schere. </li><li> Übertragen Sie die Ohren in die 50 ml konischen Bodenrohr mit einer Pinzette (wie in Schritt 3 hergestellt). </li><li> Verschließen Sie die 50 ml konischen Bodenrohr mit Parafilm vor dem Versand bei RT in einer entsprechenden Box. </li></ol>

<ol>
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The authors declare no conflict of financial interests.

Hier stellen wir eine einfache, kostengünstige und schnelle experimentelle Verfahren zur primären Fibroblastenkulturen aus den Ohren und Schwänze der Mäuse zu etablieren. Die Extraktion sollte in haftende und sich schnell teilenden Fibroblasten innerhalb von 3 Tagen nach der Trennung des Gewebes führen. Eine wichtige Einschränkung von Primärzellen ist Seneszenz, eine dauerhafte Wachstumsstillstand 15. Verwendung des Protokolls kann Fibroblastenkulturen für 5-6 mal passagiert werden, bevor Fibroblasten werden seneszenten, durch die Abflachung der Zellen angegeben, werden größer (2-3 mal Erhöhung) und Versagen zu erweitern. Bei der Durchführung der Isolierung der Fibroblasten, muss die Aufmerksamkeit während der Unterbrechung der Gewebe zu bezahlen, als nicht ausreichend, Schneiden oder Verdauung werden in geringen Rückgewinnung von Fibroblasten zur Folge haben. Es ist möglich, das Ohr und Schwanz Fibroblasten zu bündeln, um die Anzahl der Fibroblasten erhöhen. Zusätzlichen Tissue einschließlich Peritonealdialyse und in der gleichen Weise verarbeitet Lungengewebe hinzugefügt werden, um t zu erhöhenEr Anzahl von Fibroblasten. Obwohl Trümmer in der Kultur folgenden Fibroblasten Extraktion vorhanden ist, wird es empfohlen, das Medium erst nach dem dritten Tag ändern Fibroblasten die Zeit nehmen, um die Zellkulturschalen haftet. Eine potentielle Beschränkung des Protokolls ist die Verwendung von nicht-sterilen Gewebe und damit verbundenen Möglichkeit einer mikrobiellen Kontamination. Um das Risiko der Kontamination zu reduzieren, werden die Ohren und Schwanz in 70% Äthanol vor dem Ernten der Fibroblasten inkubiert. Weiterhin wird die antimykotische Amphotericin B auf der Primärkultur zugegeben, um den Auswuchs von Hefe und Pilzen, ein gemeinsames Problem zu vermeiden, wenn zur Festlegung Fibroblastenkulturen. Das Medium enthält auch Penicillin und Streptomycin, um bakterielle Kontamination zu verhindern. Mit diesen Vorkehrungen sind Kontaminationen selten beobachtet, auch bei der Festlegung von Fibroblasten von Ohren und Schwanz, die bei Raumtemperatur für mehrere Tage aufbewahrt wurden. Einer der wichtigsten Vorteile dieses Protokolls liegt in dem abilkeit auf Fibroblasten von Ohren, die in Medium bei Raumtemperatur für bis zu 10 Tage vor Fibroblasten Isolierung gespeichert wurden, zu generieren. Wir beobachteten eine geringfügig verminderte Effizienz bei der Festlegung Ohr Fibroblastenkultur nach 10 Tagen Lagerung (70-80% Konfluenz wird innerhalb von 5-6 Tagen im Vergleich zu 3-4 Tage frisch isoliertem Gewebe erreicht). Daher kann die Ohren von Mäusen, die von den Forschern mit Standard-Versand ausgetauscht werden, wenn auch Express-Sendungen wird empfohlen. Nach unserer Erfahrung, die Benutzerfreundlichkeit, um die Ohren und die Tatsache, dass das Gewebe wird selten für experimentelle Verfahren verwendet erhalten können oft Zugang zu Gewebe von genetisch veränderten Mäusen, die zeitraubende, anders zu erhalten sein könnten. Für Schwänzen die Effizienz der Rückgewinnung von Fibroblasten nach der Lagerung kann stark variieren und Schwänzen sollten nur verwendet werden, wenn die Ohren sind nicht für den Versand zur Verfügung. Schließlich sollten die meisten Menschen in der Lage, um das Protokoll auszuführen, da die Ernte von Gewebe erfordert minimale Erfahrung und Ausbildung im Umgang mit Mäusen. Das Protokoll nur mit Mausgewebe getestet, sollte aber in der Theorie ermöglicht die Erzeugung von Fibroblastenkulturen unter Verwendung von Gewebe anderer Spezies, obwohl das Protokoll kann eine weitere Optimierung benötigen.

Primärzellen werden von lebendem Gewebe und kultiviert unter in vitro Bedingungen abgeleitet sind. Es wird allgemein angenommen, dass primäre Zellen, die den physiologischen Zustand und der genetische Hintergrund des Gewebes, aus dem sie stammen, als immortalisierte oder Tumorzelllinien 1 stärker ähneln. Aus diesem Grund Primärzellen sind ein nützliches Modell für die Untersuchung biologischer Fragestellungen 2,3. Doch im Gegensatz zu etablierten Zelllinien, die auf unbestimmte Zeit zu wachsen, Primärzellen schließlich unterziehen Seneszenz in Kultur und häufig wiedereingeführt werden müssen. Üblicherweise verwendete primäre Zellen umfassen Fibroblasten, Epithelzellen, Endothelzellen, T-Zellen, B-Zellen, Knochenmark-Makrophagen (BMDM) und Knochenmark stammenden dendritischen Zellen (BMDC). Fibroblasten werden oft als primäre Zellkultur-Modell genutzt. Sie bieten entscheidende Vorteile gegenüber anderen Primärzellen. Die Zellkulturen werden leicht hergestellt, leicht aufrechterhalten und erfordern keine Purification der Zellen vor der Kultur. Sie haben schnellen anfänglichen Proliferation und keine Voraussetzung für die Fachmedium oder Aktivierungsprotokolle. Fibroblasten lassen sich effizient mit biologischen, chemischen und physikalischen Protokollen 4,5 transfiziert werden. Gibt es eine Möglichkeit, um die Ohren für bis zu 10 Tage bei RT vor der Etablierung von Zellkulturen zu speichern. Fibroblastenkulturen sind förderlich für die Visualisierung von zytoplasmatischen Prozesse und für die Neuprogrammierung in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) 6. Fibroblasten sind wichtige Zellen des Bindegewebes, die Kollagen-Proteine ​​der extrazellulären Matrix 7 sekretieren. Sie stellen den strukturellen Rahmen in vielen Geweben 8 und spielen eine wesentliche Rolle bei der Wundheilung und Gewebereparatur 9,10. Hier beschreiben wir eine einfache und schnelle (&lt;4 h) Protokoll, um Fibroblastenkulturen aus den Ohren und Schwänze der Mäuse 11 zu etablieren. Das Protokoll erfordert nur minimale MausErfahrung, um das Gewebe (im Gegensatz zu anderen Protokollen 12,13) ​​zu ernten und kann verwendet werden, um Kulturen von Ohren in Medium bei RT für bis zu 10 Tage gelagert zu etablieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:140px;">HyClone</td>
			<td style="width:119px;">SH30027.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:140px;">HyClone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Asparagine</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamine</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:140px;">HyClone</td>
			<td style="width:119px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:140px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">107017</td>
			<td>Absolute for analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:140px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">11088866001</td>
			<td>From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pronase protease</td>
			<td style="width:140px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">53702</td>
			<td>From Streptomyces griseus&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris buffer (pH 8)</td>
			<td style="width:140px;">1st BASE</td>
			<td style="width:119px;">1415</td>
			<td>Ultra pure grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5M EDTA (pH 8)</td>
			<td style="width:140px;">1st BASE</td>
			<td style="width:119px;">BUF-1053</td>
			<td>Biotechnology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:140px;">1st BASE</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2040-10X4L</td>
			<td>Ultra pure grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA solution 10X</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">59418C-100ML</td>
			<td>0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2492-20ml</td>
			<td>250 &#956;g/ml in deionized water, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scissors</td>
			<td style="width:140px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcep</td>
			<td style="width:140px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">AE-BD312R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2 &#956;M syringe filter</td>
			<td style="width:140px;">Sartorius Stedim</td>
			<td style="width:119px;">16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70 &#956;M cell strainer</td>
			<td style="width:140px;">SPL</td>
			<td style="width:119px;">93070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe plunger</td>
			<td style="width:140px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">SS+10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cryovial tube</td>
			<td style="width:140px;">NUNC</td>
			<td style="width:119px;">368362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.7 ml microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:140px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 cm cell culture dish</td>
			<td style="width:140px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">664160</td>
			<td>Cell culture treated dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml conical bottom tube</td>
			<td style="width:140px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 ml conical bottom tube</td>
			<td style="width:140px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Water bath</td>
			<td style="width:140px;">GFL</td>
			<td style="width:119px;">1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubation shaker</td>
			<td style="width:140px;">Sartorius Stedim</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Certomat-BS1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axiovert 25 light microscope</td>
			<td style="width:140px;">Carl Zeiss AG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues

Primärzellen werden direkt aus Gewebe gewonnen und sind gedacht, um mehr repräsentativ für den physiologischen Zustand der Zellen, die in vivo als etablierte Zelllinien sein. Jedoch weisen primäre Zellkulturen in der Regel eine begrenzte Lebensdauer und häufig wiedereingeführt werden müssen. Fibroblasten sind eine leicht zugängliche Quelle von Primärzellen. Hier diskutieren wir eine einfache und schnelle Versuchsdurchführung zu primären Fibroblastenkulturen von Ohren und Schwanz von Mäusen zu etablieren. Das Protokoll kann die primäre Fibroblastenkulturen von den Ohren bei RT für bis zu 10 Tage gelagert werden, zu etablieren. Wenn das Protokoll genau befolgt, sind Verunreinigungen unwahrscheinlich, trotz der Verwendung für längere Zeit in einigen Fällen nicht gespeichert unsterilen Gewebe auftreten. Fibroblasten vermehren sich rasch in Kultur und kann zu einer beträchtlichen Zahl vor einer replikativen Seneszenz erweitert werden.

Extraktion von Fibroblasten, die aus Gewebe in einer signifikanten Menge an Gewebetrümmer (Abbildung 1). Im Gegensatz zu Gewebetrümmer, Fibroblasten haften an Gewebekulturkunststoffoberflächen zwischen Tag 1 und 3 der Kultur. Das Medium der Fibroblastenkulturen kann sicher an Tag 3 der Kultur, die die Pegel der vorliegenden Trümmer in der Kultur (2) signifikant verringern sollte verändert werden. Fibroblasten zeigen eine längliche Morphologie und eine deutlich sichtbare Zytoplasma (1 und 2). Mitotischen Zellen von Tag 3 der Kultur weiter vorhanden sein sollten und Zellen sollten 70-80% der Zellkonfluenz innerhalb von 3-4 Tagen der Kultur zu erreichen. Die Ausbeute von Ohr und Schwanz Geweben in einer 10 cm Kulturschale im Bereich von 4 bis 5 x 10 5 (ears) und 5 bis 6 x 10 5 Zellen (Schwanz) am Tag 3 der Kultur. Nach dem dritten Tag der Fibroblasten Isolation können die Zellen passagiert und ausgesät, auf 2 x 10 5 Zellen pro 10 cm-Kulturschale. Extraktion von Fibroblasten, die aus den Ohren bei RT für 10 Tage gelagert werden, sollten in 70-80% Zellkonfluenz innerhalb 5-6 Tagen Kultur (Figur 3) führen. Aussäen der Zellen bei 2 × 10 5 Zellen pro 10 cm-Kulturschale für Tag 5 sollten ebenfalls auf ca. 1 x 10 6 Zellen in 3-4 Tagen Kultur. Langzeitlagerung hat keinen Einfluss auf die Zeit, die für Fibroblasten Seneszenz in unserer Erfahrung ein (Daten nicht gezeigt). Um die Identität der Zellen nach 3 Tagen Kultur zu überprüfen, können Zellen, die für die Fibroblasten-Marker Vimentin 14. Unter Verwendung des obigen Protokolls markiert werden, wir routinemßig reinen Fibroblastenkulturen erhalten, wie von Vimentin Anfärbung (Figur 4) angedeutet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53565/53565fig1.jpg" /> Abbildung 1. Fibroblastenkultur am Tag 3 nach der Extraktion vor der mittel ändern.Repräsentative Hellfeld Bilder von Zelltrümmern (weiße Pfeile) an Tag 3 der Kultur präsent. Bilder wurden bei 100-facher Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop erfasst. Der Maßstab entspricht 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53565/53565fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53565/53565fig2.jpg" /> Abbildung 2. Fibroblastenkultur am Tag 3 nach der Extraktion nach der Zugabe des neuen Mediums. Repräsentative Hellfeld Bilder von Fibroblasten am Tag 3 in der Kultur. Die Bilder wurden bei 100-facher und 320-facher Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop erfasst. Der Maßstab entspricht 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53565/53565fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 3. Fibroblastenkultur am Tag 3 nach der Extraktion aus bei RT für 10 Tage gespeichert Ohrgewebe. Repräsentative Hellfeld Bilder von Fibroblasten am Tag 3 in der Kultur. Die Bilder wurden bei 100-facher und 320-facher Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop erfasst. Der Maßstab entspricht 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53565/53565fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53565/53565fig4.jpg" /> Abbildung 4. Kennzeichnung von Fibroblastenkulturen für Vimentin. Repräsentative konfokales Bild von Ohr und Schwanz Fibroblasten an Tag 3 der Kultur. Fibroblasten, die aus den Geweben extrahiert wurden Vimentin (rot) und DAPI (blau) markiert. Die Fluoreszenzbilder wurden durch konfokale micros erworbenKopie. Der Maßstab entspricht 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53565/53565fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Beschreiben wir eine einfache und schnelle experimentelle Verfahren zur Erzeugung von primären Fibroblasten, die aus den Ohren und Schwänze von Mäusen. Das Verfahren erfordert keine spezielle Tiertrainings erfordern und für die Erzeugung von Fibroblastenkulturen von den Ohren bei RT für bis zu 10 Tage gelagert werden.

Erzeugenden Primärfibroblastenkulturen von Maus-Ohr und Schwanz Tissues

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

generating-primary-fibroblast-cultures-from-mouse-ear-and-tail-tissues

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

33.6K Aufrufe.  Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore.  Beschreiben wir eine einfache und schnelle experimentelle Verfahren zur Erzeugung von primären Fibroblasten, die aus den Ohren und Schwänze von Mäusen. Das Verfahren erfordert keine spezielle Tiertrainings erfordern und für die Erzeugung von Fibroblastenkulturen von den Ohren bei RT für bis zu 10 Tage gelagert werden. 

Serie: Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are restricted to two specific neurogenic niches: the subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampus and the ventricular-subventricular zone (V-SVZ; also called subependymal zone or SEZ) in the walls of the lateral ventricles. The development of in vivo gene transfer strategies for adult stem cell populations (i.e. those of the mammalian brain) resulting in long-term expression of desired transgenes in the stem cells and their derived progeny is a crucial tool in current biomedical and biotechnological research. Here, a direct in vivo method is presented for the stable genetic modification of adult mouse V-SVZ cells that takes advantage of the cell cycle-independent infection by LVs and the highly specialized cytoarchitecture of the V-SVZ niche. Specifically, the current protocol involves the injection of empty LVs (control) or LVs encoding specific transgene expression cassettes into either the V-SVZ itself, for the in vivo targeting of all types of cells in the niche, or into the lateral ventricle lumen, for the targeting of ependymal cells only. Expression cassettes are then integrated into the genome of the transduced cells and fluorescent proteins, also encoded by the LVs, allow the detection of the transduced cells for the analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects in the labeled cells and their progeny.

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast physiology and pathology underlie a spectrum of clinical entities, including fibroses in multiple organs, hypertrophic scarring following burns, loss of cardiac function following ischemia, and the formation of cancer stroma. However, fibroblasts remain a poorly characterized type of cell, largely due to their inherent heterogeneity. Existing methods for the isolation of fibroblasts require time in cell culture that profoundly influences cell phenotype and behavior. Consequently, many studies investigating fibroblast biology rely upon in vitro manipulation and do not accurately capture fibroblast behavior in vivo. To overcome this problem, we developed a FACS-based protocol for the isolation of fibroblasts from the dorsal skin of adult mice that does not require cell culture, thereby preserving the physiologic transcriptional and proteomic profile of each cell. Our strategy allows for exclusion of non-mesenchymal lineages via a lineage negative gate (Lin-) rather than a positive selection strategy to avoid pre-selection or enrichment of a subpopulation of fibroblasts expressing specific surface markers and be as inclusive as possible across this heterogeneous cell type.

Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.

Murine Hautfibroblasten-Isolation durch FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and promotion of the tumor microenvironment. While there are currently many techniques for the isolation of MFs from gastrointestinal (GI) tissues, this protocol introduces a novel element of isolation of these stromal cells from frozen tissue. Freezing GI tissue specimens not only allows the researcher to acquire samples from worldwide collaborators, biobanks, and commercial vendors, it also permits the delayed processing of fresh samples. The described protocol will consistently yield characteristic spindle-shaped cells with the MF phenotype that express the markers CD90, &#945;-SMA and vimentin. As these cells are derived from patient samples, the use of primary cells also confers the benefit of closely mimicking MFs from disease states-namely cancer and inflammatory bowel diseases. This technique has been validated in gastric, small bowel, and colonic MF primary culture generation. Primary MF cultures can be used in a vast array of experiments over a number of passage and their purity assessed by both immunocytochemistry and flow cytometry analysis.

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

Isolierung von CD 90+ Fibroblasten / Myofibroblasten von Human Gefrorene Magen-Darm-Proben


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

Isolierung und Differenzierung von Fettgewebe gewonnenen Stammzellen aus Porcine Subkutan Fettgewebes

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

The primary cilium is fundamentally important in neural progenitor cell proliferation, neuronal differentiation, and adult neuronal function. Here, we describe a method to study ciliogenesis and the trafficking of signaling proteins to cilia in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons using primary neurosphere cultures.

Mit dem Hauptneurosphäre Kulturen Primäre Cilia zu studieren

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

Generation und Kultivierung der primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

Direkte Linie Reprogrammierung von adulten Maus-Fibroblasten zu erythroiden Vorläuferzellen

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

Gewebevorbereitung und Immunostainierung von Craniofacial Tissues und unkalkulierten Knochen

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

Isolierung und Differenzierung von primären Myoblasten von Mausskelettmuskelexplants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...