This work was supported by the NRF grant HUJ-CREATE - Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.

I topi sono stati alloggiati in condizioni di assenza di patogeni in conformità con le linee guida istituzionali fino euthanization (La cura istituzionale degli animali e del Comitato uso (IACUC) le linee guida presso l&#39;Università Nazionale di Singapore e del Comitato consultivo nazionale per Research Laboratory Animal (NACLAR) le linee guida). 1. Topi <ol><li> Ordinare un mouse del background genetico appropriato. Questo protocollo è basato sul tessuto derivato da uno C57BL / 6 del mouse. </li></ol> 2. Preparazione del terreno completo <ol><li> Preparare terreno completo aggiungendo le seguenti componenti al Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640: siero fetale bovino al 10% (FCS), 50 mM 2-mercaptoetanolo, 100 micron asparagina, glutammina 2 mM, soluzione di penicillina-streptomicina 1%. </li></ol> 3. Preparazione di enzima Solutions <ol><li> Preparare la soluzione collagenasi D in un tubo da 15 ml fondo conico. <ol><li> Pesare 10 mg di collagenasi D. Dissolve collagenasi D in 4 ml di terreno completo. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione pronasi in una provetta 1,7 ml microcentrifuga. <ol><li> Pesare 10 mg di Pronasi. </li><li> Aggiungere 5 ml di 1 M tampone Tris (pH 8,0). Aggiungere 1 ml di 0,5 M EDTA (pH 8,0). </li><li> Rabboccare con 494 ml di acqua sterile. </li><li> Incubare la soluzione pronase a 37 ° C a bagnomaria per 30 minuti. </li></ol></li></ol> 4. Preparazione di Collagenasi D-pronasi Mix (≤2 Tails) Nota: Eseguire le fasi successive in una cappa sterile coltura cellulare. <ol><li> Aggiungere 250 microlitri di soluzione pronase a 4 ml di soluzione di collagenasi D. </li><li> Passare il composto collagenasi D-pronasi attraverso un filtro siringa da 0,2 micron in una sterile 15 ml tubo fondo conico. </li></ol> 5. Estrazione di fibroblasti da tessuti dell&#39;orecchio e coda <ol><li> Euthanize topi secondo le linee guida istituzionali appropriate.</li><li> Mettere in autoclave chirurgici strumenti (forbici e pinze) nel cofano coltura cellulare. </li><li> Aggiungere 10 ml di terreno completo in due 10 cm piatti di coltura di cellule ciascuno. </li><li> Tagliare orecchie (~ 1 cm raggio) e 5 cm di coda (dalla punta della coda) di un topo con le forbici e incubare per 5 minuti in 40 ml di etanolo 70% in una provetta sterile da 50 ml a fondo conico. </li><li> Orecchie con aria secca e la coda di collocarli in un 10 centimetri piatto di coltura cellulare aperta nel cappuccio per 5 min. Una volta essiccati, trasferimento orecchio e pezzi di coda a due piatti della cultura etichettati &quot;orecchie&quot; e &quot;coda&quot; che contiene 10 ml di terreno completo come descritto al punto 5.3. </li><li> Eliminare i peli dalle orecchie e forbici coda utilizzando. </li><li> Tagliare orecchie e la coda in pezzi più piccoli di 3 mm di dimensioni con le forbici. </li><li> Trasferire i tessuti tagliati in 1,8 ml fiale cryotube etichettate &quot;orecchie&quot; e &quot;coda&quot; e aggiungere collagenasi sufficiente soluzione D-pronasi per il volume di raggiungere i 1,8 ml sul flacone. </li><li> Pallacciare le fiale cryotube orizzontalmente su un ed agitare i campioni a 200 rpm per 90 min a 37 ° C. </li><li> Dopo 90 minuti di incubazione, rimuovere le fiale cryotube dal shaker e posizionare le fiale nella cappa. </li><li> Aggiungere 10 ml di terreno completo in due 10 cm di colture cellulari piatti, con l&#39;etichetta &quot;orecchie&quot; e &quot;coda&quot; ciascuno, e mettere un filtro 70 micron cella in ogni piatto. </li><li> Posizionare le orecchie e coda tessuti digeriti nel colino 70 micron cella nei piatti di conseguenza etichettati previste al punto 5.11 e con forza macinare i tessuti con una siringa da 10 ml stantuffo per&gt; 5 min. Agitare il filtro cellule occasionalmente nel mezzo per lavare le cellule fuori del filtro cella. </li><li> Pipetta la sospensione cellulare da ogni piatto in provette fondo due 15 ml coniche etichettati &quot;orecchie&quot; e &quot;coda&quot;. Lavare il piatto e il filtro con l&#39;aggiunta di 10 ml di terreno completo e aggiungere il supporto per le appropriate da 15 ml provette fondo conico. </li><li> Spin giù la cellasospensione per 7 minuti a 580 xg ~ e 4 ° C utilizzando una centrifuga cella frigorifera. </li><li> Rimuovere il surnatante, aggiungere 10 ml di mezzo completo per il pellet cellulare in 15 ml tubo fondo conico e risospendere le cellule. </li><li> Ripetere il passaggio 5.14 e 5.15. </li></ol> 6. Coltura di miscela cellulare <ol><li> Rimuovere il surnatante. Assicurarsi che il pellet di cellule rimane indisturbato. </li><li> Risospendere le cellule in 10 ml di terreno completo e aggiungere il relativo composto per due 10 cm piatti di coltura di cellule etichettate &quot;orecchie&quot; e &quot;coda&quot;. </li><li> Aggiungere 10 ml soluzione amfotericina B (soluzione madre: 250 mg / ml) per la cultura. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore. </li><li> Al terzo giorno, sostituire il mezzo con terreno completo contenente 10 ml fresco 10 ml di amfotericina B per rimuovere detriti (figure 1 e 2). </li></ol> 7. Sotto-cultura della fibroblasti <ol><li> Whecultura n raggiunge circa il 70% di confluenza (giorno 3-4 della cultura) rimuovere il supporto e lavare le cellule con 5 ml sterile 1x tampone fosfato salino (PBS). </li><li> Rimuovere PBS e aggiungere 2 ml di soluzione sterile 1x tripsina-EDTA per le cellule. </li><li> Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore. </li><li> Dopo 5 minuti, delicatamente toccare il piatto cultura e aggiungere 6 ml di terreno completo alle cellule. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml conica fondo e girare il tubo per 5 minuti a 450 xg ~ e 4 ° C utilizzando una centrifuga cella frigorifera. </li><li> Rimuovere il surnatante, e delicatamente risospendere il pellet cellulare in 5 ml di mezzo completo. </li><li> Seed 2 x 10 5 cellule in un piatto di coltura cellulare 10 cm e incubare le cellule a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore per 3-4 giorni prima di ripetere passaggi da 7.1 a 7.6. </li></ol> 8. Preparazione di orecchie per la spedizione Nota: eseguire tegli fasi successive in una cappa sterile coltura cellulare. <ol><li> Euthanize topi secondo le linee guida istituzionali appropriate. </li><li> Posizionare forbici e pinze in autoclave nel cofano coltura cellulare. </li><li> Aggiungere 50 ml di terreno completo in un tubo da 50 ml fondo conico. </li><li> Tagliare le orecchie (~ 1 cm di raggio) di un mouse con le forbici. </li><li> Trasferire le orecchie nel tubo da 50 ml a fondo conico (come preparato al punto 3) con pinze. </li><li> Sigillare il tubo da 50 ml fondo conico con parafilm prima della spedizione a temperatura ambiente in una scatola appropriata. </li></ol>

<ol>
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(1031), 65-70 (2013).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+pluripotent+stem+cells+from+NOD+mouse+tail-tip+fibroblasts.">Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts.</a> Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).</li></ol>

The authors declare no conflict of financial interests.

Qui forniamo una procedura semplice, economico e veloce sperimentale di stabilire colture di fibroblasti primari da orecchie e le code di topi. L&#39;estrazione dovrebbe risultare in fibroblasti divisorie aderenti e rapidamente entro 3 giorni post-isolamento del tessuto. Un importante limite di pile è senescenza, una crescita arresto permanente 15. Utilizzando il protocollo, colture di fibroblasti possono essere diversi passaggi da 5 a 6 volte prima fibroblasti diventano senescente, indicato dalla appiattimento delle cellule, aumentare di dimensioni (2-3 volte aumento) e la mancata espansione. Quando si esegue isolamento dei fibroblasti, occorre prestare attenzione durante la rottura dei tessuti, come il taglio insufficiente o digestione si tradurrà in basso recupero dei fibroblasti. È possibile raggruppare le orecchio e coda fibroblasti di aumentare il numero dei fibroblasti. Tessuto supplementare compresi peritoneale e tessuto polmonare trattati nello stesso modo può essere aggiunto per aumentare tha il numero di fibroblasti. Sebbene detriti è presente nella coltura dopo estrazione fibroblasti, si raccomanda di cambiare il mezzo solo dopo il terzo giorno fibroblasti prendono tempo per aderire ai piatti di coltura cellulare. Un potenziale limitazione del protocollo è l&#39;uso di tessuti non sterili e possibilità di contaminazione microbica associata. Per ridurre il rischio di contaminazione, orecchie e coda sono incubate in 70% di etanolo prima della raccolta dei fibroblasti. Inoltre, l&#39;amfotericina B antimicotico viene aggiunto alla coltura primaria per impedire la conseguenza di lieviti e funghi, un problema comune quando stabilire colture di fibroblasti. Il terreno contiene anche la penicillina e streptomicina per prevenire la contaminazione batterica. Utilizzando queste precauzioni, contaminazioni sono raramente osservati anche quando si stabilisce fibroblasti da orecchie e code che sono stati tenuti a temperatura ambiente per diversi giorni. Uno dei vantaggi principali di questo protocollo è la Abillità per generare fibroblasti da orecchie che sono stati memorizzati in mezzo a temperatura ambiente per un massimo di 10 giorni prima fibroblasti isolamento. Abbiamo osservato una efficienza modesta diminuzione nella creazione di cultura di fibroblasti orecchio dopo 10 giorni di conservazione (70-80% di confluenza è raggiunto entro 5-6 giorni rispetto ai 3-4 giorni per il tessuto fresco isolato). Quindi, le orecchie di topi possono essere scambiati dai ricercatori che utilizzano il trasporto standard, anche se si consiglia di spedizione espressa. Nella nostra esperienza, la facilità d&#39;uso per ottenere orecchie e il fatto che il tessuto è raramente utilizzato per le procedure sperimentali spesso consente l&#39;accesso ai tessuti di topi geneticamente modificati che potrebbe essere di ottenere altrimenti richiede tempo. Per informazioni dettagliate l&#39;efficienza dei fibroblasti recupero dopo lo stoccaggio può variare ampiamente e code deve essere utilizzato solo se le orecchie non sono disponibili per la spedizione. Infine, la maggior parte delle persone dovrebbero essere in grado di eseguire il protocollo, come la raccolta di tessuto richiede competenze minime e la formazione nella gestione dei topi. Il protocollo è stato testato solo utilizzando tessuti mouse, ma dovrebbe in teoria permettere la generazione di colture di fibroblasti utilizzando tessuti di altre specie sebbene il protocollo possa essere successivamente ottimizzata.

Cellule primarie sono derivati ​​da tessuti e coltivate che vivono in condizioni in vitro. Si ritiene generalmente che le cellule primarie avvicinano maggiormente lo stato fisiologico e background genetico del tessuto da cui sono derivati ​​di linee cellulari immortalizzate o tumorali 1. Per questo motivo, cellule primarie rappresentano un modello utile per studiare le domande biologica 2,3. Tuttavia, a differenza di linee cellulari stabilizzate che crescono indefinitamente, pile infine subiscono senescenza nella cultura e devono essere frequentemente ristabilita. Pile comunemente usati includono fibroblasti, cellule epiteliali, cellule endoteliali, cellule T, cellule B, i macrofagi del midollo osseo (BMDM) e le cellule dendritiche derivate dal midollo osseo (BMDC). I fibroblasti sono spesso utilizzati come cellula primaria modello di coltura. Essi offrono vantaggi chiave rispetto ad altre cellule primarie. Le colture cellulari sono facilmente stabiliti, prontamente mantenuto e non richiedono purificazione di cellule precedenti alla cultura. Hanno rapida proliferazione iniziale e nessun requisito per i protocolli di media o di attivazione specializzate. I fibroblasti possono essere efficacemente trasfettate utilizzando protocolli fisici 4,5 biologici, chimici, e. C&#39;è la possibilità di memorizzare le orecchie fino a 10 giorni a temperatura ambiente, prima di stabilire colture cellulari. Colture di fibroblasti sono favorevoli alla visualizzazione dei processi citoplasmatici e adatto per la riprogrammazione in staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule 6. I fibroblasti sono importanti cellule del tessuto connettivo che secernono proteine ​​collagene e della matrice extracellulare 7. Essi costituiscono il quadro strutturale in molti tessuti 8 e svolgono un ruolo fondamentale nella guarigione delle ferite e la riparazione dei tessuti 9,10. Qui, descriviamo un protocollo (4 ore &lt;) semplice e veloce per creare colture di fibroblasti da orecchie e le code di topo 11. Il protocollo richiede una minima del mouseesperienza per raccogliere i tessuti (a differenza di altri protocolli 12,13) ​​e può essere utilizzato per stabilire culture di orecchie memorizzati nel mezzo a temperatura ambiente per 10 giorni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:140px;">HyClone</td>
			<td style="width:119px;">SH30027.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:140px;">HyClone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Asparagine</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamine</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:140px;">HyClone</td>
			<td style="width:119px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:140px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">107017</td>
			<td>Absolute for analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:140px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">11088866001</td>
			<td>From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pronase protease</td>
			<td style="width:140px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">53702</td>
			<td>From Streptomyces griseus&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris buffer (pH 8)</td>
			<td style="width:140px;">1st BASE</td>
			<td style="width:119px;">1415</td>
			<td>Ultra pure grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5M EDTA (pH 8)</td>
			<td style="width:140px;">1st BASE</td>
			<td style="width:119px;">BUF-1053</td>
			<td>Biotechnology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:140px;">1st BASE</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2040-10X4L</td>
			<td>Ultra pure grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA solution 10X</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">59418C-100ML</td>
			<td>0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2492-20ml</td>
			<td>250 &#956;g/ml in deionized water, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scissors</td>
			<td style="width:140px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcep</td>
			<td style="width:140px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">AE-BD312R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2 &#956;M syringe filter</td>
			<td style="width:140px;">Sartorius Stedim</td>
			<td style="width:119px;">16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70 &#956;M cell strainer</td>
			<td style="width:140px;">SPL</td>
			<td style="width:119px;">93070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe plunger</td>
			<td style="width:140px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">SS+10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cryovial tube</td>
			<td style="width:140px;">NUNC</td>
			<td style="width:119px;">368362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.7 ml microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:140px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 cm cell culture dish</td>
			<td style="width:140px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">664160</td>
			<td>Cell culture treated dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml conical bottom tube</td>
			<td style="width:140px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 ml conical bottom tube</td>
			<td style="width:140px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Water bath</td>
			<td style="width:140px;">GFL</td>
			<td style="width:119px;">1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubation shaker</td>
			<td style="width:140px;">Sartorius Stedim</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Certomat-BS1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axiovert 25 light microscope</td>
			<td style="width:140px;">Carl Zeiss AG</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues

Cellule primarie derivano direttamente dal tessuto e si pensa di essere più rappresentativo dello stato fisiologico delle cellule in vivo di linee cellulari stabilizzate. Tuttavia, colture cellulari primarie di solito hanno una durata di vita limitata e devono essere frequentemente ristabilita. I fibroblasti sono una fonte facilmente accessibile di cellule primarie. Qui, si discute una procedura semplice e rapida sperimentale di stabilire colture di fibroblasti primari da orecchie e le code di topi. Il protocollo può essere utilizzato per stabilire colture primarie di fibroblasti da spighe conservati a temperatura ambiente per 10 giorni. Quando il protocollo è attentamente seguita, contaminazioni sono improbabili nonostante l&#39;uso di tessuti non sterile immagazzinato per tempo prolungato in alcuni casi. I fibroblasti proliferano rapidamente in coltura e possono essere espanse per un numero considerevole prima di subire la senescenza replicativa.

Estrazione di fibroblasti da risultati tessuto in una notevole quantità di frammenti di tessuto (Figura 1). In contrasto con i residui di tessuto, fibroblasti aderire a superfici di plastica coltura dei tessuti tra il giorno 1 e 3 della cultura. Il mezzo di colture di fibroblasti può essere modificato in modo sicuro il giorno 3 di coltura, che dovrebbe ridurre significativamente i livelli di detriti presenti nella cultura (Figura 2). I fibroblasti mostrano una morfologia allungata e un citoplasma chiaramente visibile (figure 1 e 2). Cellule mitotiche dovrebbero essere presenti fin dal primo giorno 3 della cultura in poi e cellule devono raggiungere il 70-80% di confluenza delle cellule entro 3-4 giorni di coltura. La resa di orecchio e coda tessuti in un piatto di coltura 10 cm varia da 4 a 5 x 10 5 (orecchie) e da 5 a 6 x 10 5 cellule (coda) il giorno 3 di coltura. Dopo il terzo giorno di isolamento fibroblasti, le cellule possono essere diversi passaggi e seminate a 2 x 10 5 cellule per 10 cm piatto di coltura. Estrazione di fibroblasti da orecchie conservati a temperatura ambiente per 10 giorni dovrebbe comportare 70-80% di confluenza cella entro 5 a 6 giorni di coltura (Figura 3). Semina le cellule a 2 x 10 5 cellule per 10 centimetri piatto di coltura dopo giorno 5 dovrebbe anche dare origine a circa 1 x 10 6 cellule entro 3-4 giorni di coltura. Stoccaggio a lungo termine non influenza il tempo necessario per i fibroblasti di entrare nella nostra esperienza senescenza (dati non mostrati). Per verificare l&#39;identità delle cellule dopo 3 giorni di coltura, le cellule possono essere etichettati per il marcatore fibroblasti vimentina 14. Utilizzando il protocollo sopra, routine ottenere colture di fibroblasti puri come indicato da vimentina colorazione (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53565/53565fig1.jpg" /> Figura cultura 1. Fibroblast il giorno 3 dopo l&#39;estrazione prima di cambiare di media.Immagini rappresentative in campo chiaro di detriti cellulari (frecce bianche) presenti il ​​giorno 3 di cultura. Le immagini sono state catturate a 100 × ingrandimenti utilizzando un microscopio ottico. La barra della scala rappresenta il 100 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53565/53565fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53565/53565fig2.jpg" /> Figura cultura 2. Fibroblast il 3 ° giorno dopo l&#39;estrazione dopo l&#39;aggiunta del nuovo mezzo. Immagini in campo chiaro rappresentativi di fibroblasti il giorno 3 di cultura. Le immagini sono state catturate a 100 × 320 × ingrandimento e utilizzando un microscopio ottico. La barra della scala rappresenta il 100 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53565/53565fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 3. cultura Fibroblast il giorno 3 dopo l&#39;estrazione dai tessuti dell&#39;orecchio conservati a temperatura ambiente per 10 giorni. Le immagini in campo chiaro rappresentativi di fibroblasti a giorno 3 di cultura. Le immagini sono state catturate a 100 × 320 × ingrandimento e utilizzando un microscopio ottico. La barra della scala rappresenta il 100 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53565/53565fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53565/53565fig4.jpg" /> Figura 4. L&#39;etichettatura di colture di fibroblasti per vimentina. Immagine confocale rappresentante di orecchio e coda fibroblasti il giorno 3 di cultura. I fibroblasti estratti dai tessuti sono stati etichettati per vimentina (rosso) e DAPI (blu). Le immagini fluorescenti sono stati acquisiti da micros confocalecopia. La barra della scala rappresenta 10 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53565/53565fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Descriviamo una procedura sperimentale semplice e rapido per la generazione di fibroblasti primari dalle orecchie e le code di topi. La procedura non richiede addestramento speciale animali e può essere utilizzato per la generazione di colture di fibroblasti da spighe conservati a temperatura ambiente per 10 giorni.

Generazione di primaria fibroblasti culture da orecchio e coda tessuti di topo

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

generating-primary-fibroblast-cultures-from-mouse-ear-and-tail-tissues

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

33.6K Views.  Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore.  Descriviamo una procedura sperimentale semplice e rapido per la generazione di fibroblasti primari dalle orecchie e le code di topi. La procedura non richiede addestramento speciale animali e può essere utilizzato per la generazione di colture di fibroblasti da spighe conservati a temperatura ambiente per 10 giorni. 

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Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are restricted to two specific neurogenic niches: the subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampus and the ventricular-subventricular zone (V-SVZ; also called subependymal zone or SEZ) in the walls of the lateral ventricles. The development of in vivo gene transfer strategies for adult stem cell populations (i.e. those of the mammalian brain) resulting in long-term expression of desired transgenes in the stem cells and their derived progeny is a crucial tool in current biomedical and biotechnological research. Here, a direct in vivo method is presented for the stable genetic modification of adult mouse V-SVZ cells that takes advantage of the cell cycle-independent infection by LVs and the highly specialized cytoarchitecture of the V-SVZ niche. Specifically, the current protocol involves the injection of empty LVs (control) or LVs encoding specific transgene expression cassettes into either the V-SVZ itself, for the in vivo targeting of all types of cells in the niche, or into the lateral ventricle lumen, for the targeting of ependymal cells only. Expression cassettes are then integrated into the genome of the transduced cells and fluorescent proteins, also encoded by the LVs, allow the detection of the transduced cells for the analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects in the labeled cells and their progeny.

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

Stabile ed efficiente Modificazione genetica di cellule nel topo adulto V-SVZ per l&#39;analisi di cellule staminali neurali autonoma ed effetti non autonomi

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast physiology and pathology underlie a spectrum of clinical entities, including fibroses in multiple organs, hypertrophic scarring following burns, loss of cardiac function following ischemia, and the formation of cancer stroma. However, fibroblasts remain a poorly characterized type of cell, largely due to their inherent heterogeneity. Existing methods for the isolation of fibroblasts require time in cell culture that profoundly influences cell phenotype and behavior. Consequently, many studies investigating fibroblast biology rely upon in vitro manipulation and do not accurately capture fibroblast behavior in vivo. To overcome this problem, we developed a FACS-based protocol for the isolation of fibroblasts from the dorsal skin of adult mice that does not require cell culture, thereby preserving the physiologic transcriptional and proteomic profile of each cell. Our strategy allows for exclusion of non-mesenchymal lineages via a lineage negative gate (Lin-) rather than a positive selection strategy to avoid pre-selection or enrichment of a subpopulation of fibroblasts expressing specific surface markers and be as inclusive as possible across this heterogeneous cell type.

Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.

Murino Dermal fibroblasti Isolation di FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and promotion of the tumor microenvironment. While there are currently many techniques for the isolation of MFs from gastrointestinal (GI) tissues, this protocol introduces a novel element of isolation of these stromal cells from frozen tissue. Freezing GI tissue specimens not only allows the researcher to acquire samples from worldwide collaborators, biobanks, and commercial vendors, it also permits the delayed processing of fresh samples. The described protocol will consistently yield characteristic spindle-shaped cells with the MF phenotype that express the markers CD90, &#945;-SMA and vimentin. As these cells are derived from patient samples, the use of primary cells also confers the benefit of closely mimicking MFs from disease states-namely cancer and inflammatory bowel diseases. This technique has been validated in gastric, small bowel, and colonic MF primary culture generation. Primary MF cultures can be used in a vast array of experiments over a number of passage and their purity assessed by both immunocytochemistry and flow cytometry analysis.

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

Isolamento di CD 90+ fibroblasti / miofibroblasti da umani congelati gastrointestinali campioni


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

Isolamento e differenziazione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo sottocutaneo da Suini tessuti adiposi

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

The primary cilium is fundamentally important in neural progenitor cell proliferation, neuronal differentiation, and adult neuronal function. Here, we describe a method to study ciliogenesis and the trafficking of signaling proteins to cilia in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons using primary neurosphere cultures.

Utilizzando colture di neurosfere primarie al primario dello studio Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

Generazione e la coltura dei Keratinocytes umani primari da pelle adulta

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

Diretto lignaggio riprogrammazione di fibroblasti di topo adulto ai progenitori eritroidi

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

Preparazione dei tessuti e immunostaining dei tessuti craniofacciali del topo e dell'osso non decalcolato

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

Dissezione, cultura e analisi delle cellule staminali primarie dal mouse per lo studio della delaminazione e della migrazione delle cellule creste neurali

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

Isolamento e differenziazione dei mioblasti primari dagli esopanti muscolari scheletrici del topo

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...