내피 세포 반응을 연구하기 위해 기질 강성과 흐름을 통합하는 시험관 내 모델

우리는 관련 혈관 흐름 조건에서 혈관 내피 세포(EC)를 배양하기 위해 조정 가능한 젤라틴 기반 기질을 합성하고 특성화했습니다. 이 생체 모방 표면은 생리학적 및 병리학적 조건을 모두 복제하여 EC 행동에 대한 기계적 힘을 연구하고 혈관 건강 및 질병 메커니즘에 대한 이해를 증진합니다.

우리는 혈관 건강과 죽상 동맥 경화증과 같은 질병의 발병을 이해하는 데 중요한 내피 세포(EC) 기능에 대한 조직 강성과 전단 응력의 결합된 효과를 조사하는 것을 목표로 하는 혁신적인 시험관 내 모델을 제시합니다. 전통적으로 연구는 전단 응력과 기판 강성이 EC에 미치는 영향을 독립적으로 탐구해 왔습니다. 그러나 이 통합 시스템은 이러한 요소를 결합하여 혈관 구조의 기계적 환경에 대한 보다 정확한 시뮬레이션을 제공합니다. 목표는 인간 EC를 사용하여 다양한 조직 강성 수준 및 흐름 조건에 걸쳐 EC 기계형질도입을 검사하는 것입니다. 우리는 조정 가능한 강성을 가진 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA) 하이드로겔을 합성하고 밀도를 달성하기 위해 EC로 파종하기 위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 또한, 전산 유체 역학 시뮬레이션으로 보완된 비용 효율적인 유동 챔버의 설계 및 조립에 대해 설명하여 층류 및 적절한 전단 응력 수준을 특징으로 하는 생리학적 유동 조건을 생성합니다. 이 프로토콜은 또한 컨포칼 현미경 검사를 위한 형광 라벨링을 통합하여 조직 규정 준수 및 흐름 조건 모두에 대한 EC 반응을 평가할 수 있습니다. 이 모델은 배양된 EC를 여러 통합된 기계적 자극에 노출시킴으로써 고혈압 및 노화와 같은 요인이 EC 기능 및 EC 매개 혈관 질환에 어떤 영향을 미칠 수 있는지에 대한 포괄적인 조사를 가능하게 합니다. 이러한 연구에서 얻은 통찰력은 혈관 질환의 기저를 밝히고 효과적인 치료 전략을 개발하는 데 중요한 역할을 할 것입니다.

혈관 내부 표면을 감싸고 있는 내피는 혈관 건강을 유지하는 데 중추적인 역할을 합니다. 내피 세포(EC)는 혈관 긴장도 조절, 선택적 투과성, 지혈 및 기계적 전달을 포함한 다양한 심혈관 기능을 조절하는 데 핵심적인 역할을 합니다 ^1,2. 연구는 EC 기능 장애를 죽상 동맥 경화증 발병의 주요 역할과 확고하게 연결했습니다. 특히, EC는 혈류 및 기저 혈관 조직과 상호 작용하는 계면에서 다양한 기계적 힘을 만납니다 ^3,4. 여러 연구에서 EC 기능 장애를 혈류 및 조직 강성으로 인한 유체 전단 응력과 같은 혈관 환경 내 기계적 요인의 비정상적인 변화와 연관시켰다 ^5,6,7.

그러나 선행 연구는 조직 강성과 전단 응력이 EC 기능에 미치는 복합적인 영향을 이해하는 데 제한적인 관심을 받았습니다. 연구 결과를 죽상동맥경화증 및 기타 심혈관 질환에 대한 효과적인 치료법으로 전환하는 능력을 향상시키기 위해서는 해당 분야에서 사용되는 세포 모델을 개선하는 것이 필수적입니다. 인간 EC를 사용하고 다양한 강성 수준 ^8,9,10을 가진 전단 응력 또는 기판에 적용함으로써 세포 모델을 인간화하는 데 상당한 진전이 이루어졌습니다. 그러나 동적 유동 환경을 조정 가능한 강성 특성을 가진 EC 기판과 통합하는 셀룰러 모델의 채택 및 개선은 천천히 진행되었습니다. 문제는 유로 내 유동 매개변수의 변경을 방지하는 동시에 온전하고 잘 접착된 EC 단층의 배양을 용이하게 하기 위해 팽창하지 않는 EC 기판을 고안하는 것입니다. 이러한 장애물을 극복할 수 있는 체외 모델은 고혈압, 노화 및 흐름 조건이 EC 기계전달, 혈관 건강, 그리고 궁극적으로 죽상동맥경화증의 발병에 어떻게 협력적으로 영향을 미치는지에 대한 보다 효과적인 연구를 촉진할 수 있습니다. 기판 강성을 제어하면서 셀에 전단 응력을 가하기 위해 회전판 및 미세유체 장치를 포함한 다양한 방법이 개발되었습니다. 회전판 방법에서는 셀이 두 판 사이에 배치되고 판의 회전 운동을 통해 전단 응력이 가해집니다. 이 방법은 덜 복잡하고 빠른 모델을 제공합니다. 그러나 공간 전단 응력 변동이 발생하며, 중심에서 전단 응력이 0이고 주변부(¹¹)에서 최대 전단 응력이 있습니다.

반면에, 미세유체 장치는 기판 강성과 흐름 조건을 제어할 수 있는 기능을 갖춘 차세대 공구를 대표합니다. 이 시스템은 층류 조건에서 미세혈관을 모방하는 데 적합합니다. 그러나, 이러한 장치로 죽상동맥경화증을 연구하는 것은 비실용적인데, 그 이유는 죽상동맥경화증이 흐름이 방해받은 큰 혈관에서 발생하기 때문이다¹¹. 이 논문은 다양한 유동 조건에서 EC 기판의 다양한 강성 수준의 영향을 조사할 수 있는 비용 효율적인 시스템을 제시함으로써 EC 연구의 중요한 연구 영역에 기여하는 것을 목표로 합니다. 이 시스템은 병리학적 및 생리학적 혈관을 모방하기 위해 다양한 강성을 가진 기판을 통합합니다. 이 프로토콜은 각각 생리학적 및 병리학적 강성을 나타내는 5kPa 및 10kPa의 팽창 및 강성 수준으로 젤라틴 기반 하이드로겔을 만드는 방법을 설명합니다. 또한, 이러한 기판을 통합할 수 있는 parallel-plate flow chamber의 구성이 상세합니다. 전산 유체 역학(CFD)을 사용하여 전단 응력과 유동 조건을 평가했습니다. EC 배양을 위한 하이드로겔 준비 및 6시간 흐름 실험 실행에 대해 설명한 후 실험 후 면역염색에 대해 논의합니다.

1. GelMA의 합성

1. 무수 탄산나트륨 0.2M 용액과 중탄산나트륨 0.2M 용액을 준비합니다.
2. 중탄산나트륨 용액 46mL와 탄산나트륨 용액 15mL를 섞고 탈이온수 139mL를 추가합니다. 필요한 경우 0.1M NaOH 및 HCl을 사용하여 pH를 9.5로 조정합니다.
3. 돼지 껍질에서 추출한 A형 300-블룸 젤라틴 10g을 100mL의 탄산염-중탄산염 완충액에 10% w/v 농도로 추가합니다.
4. 자기 교반기를 사용하여 700rpm에서 용액을 저어주면서 55°C 수조를 사용하여 젤라틴을 용해시킵니다. 완전히 용해되면 0.1M NaOH를 사용하여 젤라틴 용액의 pH를 9.5로 조정합니다.
5. 메타크릴화를 시작하려면 938μL의 무수메타크릴산(MAH)을 용액에 적가합니다. 젤라틴 용액에서 MAH의 초기 분포를 개선하여 중심에서 다양한 깊이와 반경 방향 거리를 포함한 다양한 위치에 주입합니다.
6. 빛에 노출되지 않도록 반응 용기를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 온도를 55°C로 유지하고 용액을 500rpm에서 1시간 동안 교반하여 반응을 완료합니다(그림 1A)¹².
   참고: 반응은 pH 7.4 미만에서 멈춥니다.
7. 1.8L의 아세톤이 들어있는 2L 비커 1개와 0.3L의 아세톤이 들어있는 0.6L 비커 1개를 준비합니다.
8. 생성된 GelMA 용액을 200RPM으로 교반하면서 2L 비커에 적가하여 침전¹³을 유도합니다. 침전된 생성물의 수집을 최대화하려면 스테인리스강 막대 또는 주걱을 핵 형성 부위로 배치하여 더 쉽게 전달할 수 있습니다.
9. 큰 비커에서 작은 비커로 제품을 옮기고 건조 단계를 진행하기 전에 10분 동안 그대로 두십시오. 침전된 GelMA는 흰색 섬유로 나타나야 합니다.
10. 흡수지에 제품을 모아 실온(RT)의 진공 오븐에서 건조시킨 후 -20°C에서 보관하여 나중에 사용하십시오.
    참고: 양성자 핵 자기 공명(¹H NMR)을 통한 생성물의 화학적 특성화에 대한 추가 세부 사항은 이전에 발표된 연구⁸에서 찾을 수 있습니다.

2. 유리 염류화

참고: 하이드로겔을 유리 슬라이드에 부착하면 평평하고 균일한 표면이 제공되어 취급이 용이하고 유동 유래 전단 응력에서 안정성이 보장됩니다. 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트로 유리를 기능화하는 것은 표면 특성을 향상시키고 중합 과정에서 하이드로겔의 공유 결합을 가능하게 하는 데 필요합니다.

1. 유리 절단기를 사용하여 일반 현미경 슬라이드(1mm 두께)를 최종 하이드로겔 치수와 유사한 조각으로 정밀하게 자릅니다. 절단된 슬라이드를 비누로 세척하여 유리 표면의 처리를 방해할 수 있는 표면 오염 물질과 부스러기를 제거합니다.
   알림: 필요한 경우 유리 슬라이드를 에탄올에서 5분 동안 초음파 처리한 다음 자연 건조합니다.
2. 절대 에탄올에 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트의 0.5% 용액을 준비합니다. 탈이온수에 10% 빙초산 용액을 준비합니다. 용액을 혼합하여 3% 빙초산의 최종 농도를 얻습니다.
   참고: 빙초산 용액은 대량으로 준비하고 저장할 수 있습니다.
3. 유리 표면이 막히지 않도록 유리 용기에 유리 슬라이드를 정리합니다. 생성된 용액을 유리 슬라이드 위에 붓고 반응이 완료될 때까지 5rpm의 로커에서 약 80분 동안 유지합니다. 갇힌 기포를 제거하여 유리 슬라이드의 양쪽이 수정되었는지 확인합니다.
4. 반응이 완료된 후 용액을 흡인하고 유리 슬라이드를 에탄올 2배로 세척합니다. 슬라이드를 자연 건조하고 RT의 어두운 곳에 보관하십시오.
   알림: 유리 슬라이드는 이러한 조건에서 1개월 동안 수정 사항을 유지합니다.

3. 하이드로겔 제조

1. 산화 환원 유도 자유 라디칼 중합 방법을 사용하여 하이드로겔을 제작합니다.
   1. 적절한 깊이와 10mm2의 개방 창을 가진 2피스 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 금형을 조립하여 최종 기판을 형성합니다. 설계 과정에서 중합 후 하이드로겔 높이의 25% 수축을 설명합니다. 누출을 방지하기 위해 금형이 평평하고 하단과 상단 플레이트에 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오.
      알림: 설계된 금형 치수는 의도적으로 의도한 하이드로겔 크기보다 10% 더 큽니다. 이 설계는 금형 분리 시 측면의 손상을 방지하고, 불순물이나 기포를 측면으로 밀어내어 하이드로겔의 표면 균일성을 향상시키고, 고도로 가교된 하이드로겔이 평형 후 물을 밀어내어 수축을 일으키는 시너렉시스 효과로 인해 평형 후 예상되는 25% 수축을 보상하는 등 다양한 용도로 사용됩니다. 수축량은 프로토콜 8에 명시되어^있습니다.
   2. 하이드로겔이 균일한 표면과 일정한 높이를 갖도록 하려면 금형의 상판에서 수정된 유리 슬라이드를 매달아 폴리머 용액을 주입하기 위한 좁은 개구부를 허용합니다. 커버 유리를 사용하여 수정된 유리 슬라이드를 매달아 놓습니다(그림 1B).
   3. 커버 유리를 만들려면 금형보다 20% 더 큰 일반 현미경 유리를 절단합니다. 짧은 면에 두 개의 스페이서를 부착합니다. 다음과 같이 스페이서 두께를 계산합니다.
      스페이서 두께 = 1.33 x 최종 겔 두께 + 1(개질 유리의 두께) - 금형 깊이
   4. 스페이서가 부착된 동일한 면에 커버 유리의 긴 면에 셀 호환 밀봉 그리스를 얇게 바릅니다.
   5. 수정된 유리 슬라이드를 두 스페이서 사이의 커버 유리에 부착합니다.
   6. 스페이서가 금형에 놓이고 수정된 유리가 금형 안으로 확장되도록 덮개 유리를 금형에 놓습니다. 이 설정은 개질된 유리와 금형 바닥 사이의 최종 하이드로겔 높이의 1.33의 간격을 제공합니다.
   7. 5kPa 및 10kPa 하이드로겔에 대해 각각 4% 및 10% w/v의 DI 물에 GelMA를 용해시키고 45°C 수조에 넣습니다.
      참고: GelMA는 감열성 폴리머이며 용액 온도를 45°C로 유지하면 중합 전 응고를 방지하고 플랫 하이드로겔 제조에 중요한 용액 점도를 줄일 수 있습니다.
   8. TEMED(5kPA 하이드로겔의 경우 24mM, 10kPa 하이드로겔의 경우 6.25mM)를 폴리머 용액에 넣고 잘 섞습니다.
      알림: TEMED 단독으로는 중합이 시작되지 않으므로 진행하기 전에 금형, 피펫 및 용액이 준비되었는지 확인하십시오.
   9. APS(5kPA 하이드로겔의 경우 24mM, 10kPa 하이드로겔의 경우 24.5mM)를 GelMA 용액에 넣고 잘 섞습니다.
      알림: APS를 추가하면 중합이 시작되고 하이드로겔이 빠르게 형성될 수 있으므로 결함이 있는 하이드로겔을 방지하기 위해 즉각적인 조치가 필요합니다. 강성 측정에 대한 자세한 내용은 이전에 발표된 연구^{자료 8}에서 확인할 수 있다.
   10. 생성된 용액을 매달린 유리 슬라이드와 RT의 금형 사이의 개구부에 조심스럽게 피펫팅하고 가교할 수 있도록 합니다. 모세관력은 폴리머 용액을 금형으로 밀어 넣습니다. 겔에 기포를 추가하지 말고 피펫 팁에 소량의 용액이 남아 있으면 피펫팅을 중지하십시오.
       참고: 중합 중에 GelMA의 메타크릴레이트 그룹은 변형된 유리 슬라이드에서 메타크릴레이트 잔기와 반응하여 하이드로겔이 유리에 화학적으로 부착됩니다.
   11. 15분 후 반응이 완료됩니다. 바늘과 같은 날카로운 물체를 사용하여 금형에서 기판을 분리하고 기판을 커버 유리에서 밀어서 분리합니다.
   12. 플라스틱 필름으로 밀봉된 100mm 페트리 접시에서 하이드로겔을 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 옮기고 37°C에서 평형을 이루어 남아 있는 반응물과 부산물을 제거합니다.
   13. 하이드로겔이 최종 치수보다 약간 크기 때문에 플로우 챔버 창에 필요한 치수와 일치하도록 측면의 여분의 겔을 트리밍합니다.
   14. 플로우 챔버를 사용하여 하이드로겔 치수를 확인합니다. 하이드로겔이 하이드로겔과 금형 사이의 틈이나 흐름 패턴에 영향을 줄 수 있는 결함 없이 흐름 챔버에 제대로 맞는지 확인하십시오. 플로우 챔버의 흐름 패턴에 영향을 줄 수 있는 불규칙한 모양이 있어 세포 거동에 불리한 영향을 미칠 수 있는 경우, 정적 조건을 위해 하이드로겔을 절약하십시오.
   15. 멸균을 위해 4개의 하이드로겔을 1x PBS가 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다.
2. 70% 에탄올을 사용하여 아래 설명과 같이 하이드로겔을 멸균합니다.
   1. 점진적인 하이드로겔 탈수를 위해 25%, 50% 및 70% 알코올 용액을 준비합니다.
      알림: 점진적인 탈수를 수행하지 않으면 더 뻣뻣한 하이드로겔이 수축되어 부서질 수 있으며 더 부드러운 하이드로겔 표면에 주름이 생길 수 있습니다.
   2. 하이드로겔이 포함된 페트리 접시에서 1x PBS 용액을 흡입합니다. 각 페트리 접시에 25% 에탄올 용액을 추가하여 5kPa 및 10kPa 하이드로겔을 15분 동안 담그십시오.
   3. 25% 알코올 용액을 흡입합니다. 각 페트리 접시에 50% 알코올 용액을 추가하여 5kPa 및 10kPa 하이드로겔을 15분 동안 담그십시오.
   4. 50% 알코올 용액을 흡인합니다. 각 페트리 접시에 70% 알코올 용액을 추가하고 5kPa 및 10kPa 하이드로겔을 5분 동안 담그십시오. 페트리 접시를 100rpm의 셰이커에 놓습니다.
   5. 5kPa 하이드로겔을 40분 동안 담가두고 10kPa 하이드로겔을 20분 동안 물에 담근 둡니다.
      참고: 5kPa 하이드로겔은 10kPa 하이드로겔에 비해 오염에 더 취약한 것으로 관찰되었습니다.
   6. 샘플을 생물 안전 캐비닛의 6-웰 플레이트로 옮기고 멸균 PBS를 사용하여 하이드로겔을 2x-3x 세척합니다.

4. 하이드로겔 코팅

1. 60mL의 멸균 PBS 50mL(마그네슘 및 칼슘 염 1x)에 젤라틴 3mg을 용해시켜 젤라틴 용액을 준비합니다. 용액을 37°C의 수조에서 30분 동안 또는 모든 젤라틴이 완전히 용해될 때까지 가열합니다.
2. 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 코팅 용액을 멸균 여과합니다. 각 웰 플레이트에서 1x PBS 용액을 흡입하고 각 웰에 젤라틴 용액을 추가하여 각 하이드로겔이 완전히 커버되도록 합니다. 오염 위험을 최소화하려면 코팅 용액에 페니실린 40단위/mL와 스트렙토마이신 10μg/mL를 첨가합니다.
3. 각 웰 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 45분 동안 배양합니다. 1x PBS 용액으로 하이드로겔을 세척합니다.
4. PBS를 흡입하고 세포 배양 배지를 추가합니다.
5. 하이드로겔을 세포 배양 배지에 2일 이상 보관하지 않고 세포 파종까지 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 배양합니다.
   참고: 피브로넥틴의 우수한 세포 부착 특성에도 불구하고, EC가 죽상동맥경화성 상태에서 내인성 피브로넥틴을 침착시키기 때문에 사용에 대한 우려가 있습니다. 이는 전염증 반응을 유발할 수 있습니다. 화학적으로 자극된 세포 반응을 피하기 위해 피브로넥틴의 사용을 자제합니다. 또한, Orr et al.은 피브로넥틴 코팅이 콜라겐 I 코팅에 비해 죽상생성 유전자를 상향 조절한다는 것을 입증했습니다. 구체적으로, 그들은 세포간 접착 분자 1(ICAM-1), 혈관 세포 접착 분자 1(VCAM-1) 및 핵 인자-κB(NF-κB)¹⁴의 발현 수준이 증가하는 것을 관찰했습니다.

5. 기판에 세포 파종

1. 사용 가능한 분리 프로토콜에 따라 세포 현탁액을 준비하고 혈구계⁸을 사용하여 세포를 계수합니다.
2. 하이드로겔에서 매체를 완전히 흡인합니다. 각 샘플에 50,000 cells/cm2를 추가합니다. 세포 넘침을 방지하기 위해 각 샘플에 적절한 양의 세포 현탁액을 추가합니다.
   참고: 더 뻣뻣한 기판은 더 소수성입니다. 따라서 기판 표면의 습윤성과 세포 현탁액 분산을 개선하기 위해 단계 사이의 시간을 최소화하십시오.
3. 세포 씨를 뿌린 하이드로겔을 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 2시간 동안 배양합니다. 세포가 겔에 부착되면 샘플에 세포 배양 배지를 추가합니다.

6. 플로우 챔버 제작

참고: 플로우 챔버를 설계하는 접근 방식은 비용 효율적이며 제조 및 활용을 위한 최소한의 전문 지식이 필요합니다.

1. 챔버 제작에 폴리(메틸 메타크릴레이트)를 사용하여 유동 품질, 전단 응력 하에서의 하이드로겔 무결성 및 유동 실험 중 잠재적인 실시간 바이오마커 연구를 시각적으로 평가할 수 있습니다. 챔버 설계는 CAD(Computer-Aided Design) 소프트웨어를 사용하여 생성되었습니다. 유동 챔버는 특허를 출원하고 있으며, 이 장치에 대한 자세한 내용은 본 프로토콜에서 공개할 수 없습니다.
2. flow chamber의 흐름 조건에 대한 전산 평가
   1. 설계된 플로우 챔버(flow chamber)의 개별 구성 요소를 조립합니다(. SLDPRT 파일)을 사용하여 최종 챔버 설정을 만들 수 있습니다.
   2. 하이드로겔 표면에 접하는 유동의 중심선을 따라 선을 그려 전단 응력을 분석합니다. 입구와 출구 개구부를 닫아 닫힌 제어 볼륨을 정의합니다.
   3. CAD 소프트웨어의 애드인(Add-Ins) 탭에서 Flow Simulation을 엽니다. Flow Simulation 탭에서 마법사 기능을 열어 속성을 입력합니다. 단위계를 지정하고 압력과 응력 단위를 dyne/cm²로 조정합니다.
   4. 물리적 특징에서 유체 흐름 과 중력 을 확인합니다. Z 구성 요소에서 중력을 -9.8로 설정합니다. X 및 Y 구성 요소는 0이어야 합니다.
   5. 형상 처리(Geometry Handling)에서 해석 유형으로 내부(Internal )를 선택합니다. 물을 기본 유체로 선택합니다.
      참고: 매체가 물처럼 동작한다고 가정합니다.
   6. 흐름 유형으로 Laminar(층류)와 Turbulent(터뷸런스 )를 선택합니다. 벽을 단열 벽으로 정의하고 벽 조건(Wall Condition)에 표면 거칠기를 입력합니다.
   7. 초기 조건에서 온도를 37.5°C(310.65K)로 설정합니다. Flow Simulation 프로젝트에서 계산 도메인을 정의하여 전체 제어 볼륨을 포함하도록 합니다.
   8. 유체와 접하는 모든 벽을 선택하여 유체 하위 도메인을 정의합니다. 경계 조건(Boundary Condition)에서 입구 덮개의 내부 표면을 입구 체적 흐름(Inlet Volume Flow)으로 지정하고 유속(Q) 및 균일 흐름을 지정합니다. 그런 다음 출구 덮개 밀봉의 내부 표면을 정압으로 지정합니다.
   9. 사용 가능한 계산 리소스를 기반으로 Global Mesh Size를 결정합니다. 실행 을 눌러 시뮬레이션을 시작합니다.
   10. 완료되면 전단 응력 플롯 및 유동 시뮬레이션을 포함하여 원하는 결과를 검토합니다.
   11. 다양한 유량으로 6.2.8-6.2.10단계를 반복하여 다양한 유량으로 적용된 전단 응력을 계산합니다. 회귀 분석을 사용하여 유속-전단 응력 관계를 설정합니다.
   12. 하이드로겔 치수의 변동에 대한 시스템의 허용 오차를 평가하여 시뮬레이션의 사실성을 향상시킵니다.

7. 균일 한 층류를 실행하십시오.

1. 5kPa 및 10kPa 하이드로겔에서 세포를 배양한 후 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 세포 단층이 합류하는지 확인합니다. 각 하이드로겔에 세포의 단층을 달성해야 합니다.
2. 평행판 흐름 챔버 시스템의 오토클레이브 가능한 구성 요소(스테인리스강 나사, 주걱, 집게, 개스킷 및 미디어 저장소)를 30분 중력 오토클레이브 주기로 멸균합니다. 다른 부품(아크릴 구성 요소 및 저장소 밀봉기/dampers)을 UV 광선 노출로 사용합니다.
3. 플로우 챔버 장치를 생물 안전 캐비닛에 조립합니다. 하이드로겔 샘플을 장치에 고정하여 균일성을 보장합니다. 흐름에 사용할 수 있는 샘플 수가 충분하지 않은 경우 하이드로겔과 동일한 크기의 충전기를 사용하십시오.
4. 챔버의 내부 표면과 하이드로겔 표면을 미리 적셔 기포 형성을 최소화하고 조립 중 셀 건조를 방지합니다.
5. 입구 저장소에 충분한 미디어를 추가하여 조립 시 미디어의 20%-30%가 출구 저장소로 흐르도록 합니다. d를 사용하여 입구 저장소를 밀폐하십시오.amp어/실러.
   알림: 입구 저장소의 압력 상승은 흐름을 주도하고 공기 누출은 유량을 변경합니다. 외부 튜브에 기포가 형성되면 씰러 결함이 있는지 확인하십시오.
6. 출구 d를 설정amper을 대기압으로 설정하여 압력 차이를 설정합니다. 장치와 저장소를 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣습니다. 장치 튜브를 인큐베이터 외부에 배치된 연동 펌프에 연결합니다(그림 1C).
7. 펌프를 켜서 3.6 dyne/cm²를 적용하기 시작합니다. 약 8 dyne/cm²를 적용할 때까지 유속을 2mL/분 단위로 점차적으로 증가시킵니다(예: 10분 후 65mL/분에서 85mL/분에 도달).
8. 전단 응력의 12 dyne/cm² 에 도달할 때까지 유속을 2.5mL/분 단위로 더 증가시킵니다.
   알림: 빠른 유속 증가는 세포를 분리하고 단층을 손상시킬 수 있으므로 세포가 동적 조건에 적응할 시간을 허용하십시오.
9. 6시간 후 흐름을 중지하고 인큐베이터에서 장치를 제거한 다음 흐름 챔버를 분해합니다. 그 후, 하이드로겔 샘플을 6웰 플레이트로 옮깁니다.
10. 얼음처럼 차가운 PBS로 샘플을 세척하고 면역염색을 위해 세포를 고정하거나 단백질 분리를 위해 용해합니다.

8. 고배율 공초점 현미경 검사를 위한 면역염색 설정

참고: 연구 효율성을 높이기 위해 하이드로겔의 소량을 면역염색하는 방법이 개발되어 단일 샘플에서 여러 생물학적 표적을 검사할 수 있습니다.

1. 직경이 3mm 또는 4mm인 생검 펀치 또는 선호하는 절삭 공구를 준비합니다.
2. 피펫 팁 상자를 염색 챔버로 사용하십시오. 장시간 배양 중에 염색 용액 증발을 제어하기 위해 챔버를 가습하여 피펫 팁 상자 바닥에 젖은 종이 타월을 놓습니다.
3. 개별 샘플에 대한 작은 용액 풀을 만들어 항체 소비를 줄입니다. 팁 박스 랙을 투명 필름으로 덮고 손가락 끝으로 필름을 랙 구멍에 대고 부드럽게 눌러 보조개를 만듭니다. 딤플에 70μL의 PBS를 채웁니다.
4. 개별 하이드로겔을 빈 페트리 접시에 옮기고 생검 펀치 또는 선호하는 절단 도구를 사용하여 절단합니다. 현미경을 사용하여 대표적인 샘플 영역을 절단합니다. 컨포칼 현미경 문제를 피하기 위해 전체 겔 실린더를 절단합니다.
5. 절단된 하이드로겔 샘플을 8.3단계에서 생성된 딤플에 넣습니다. 표준 프로토콜¹⁵에 따라 염색을 수행합니다. 최종 염색 세척 후 하이드로겔 두께에 맞는 실리콘 고무 시트를 얻습니다.
   알림: 가급적이면 밀봉 향상을 위해 한쪽 끈적한 면이 있는 시트를 사용하십시오. 이 연구에서는 1:20으로 희석하여 Phalloidin에 접합된 형광 2차 항체를 사용하여 액틴 섬유를 염색했습니다.
6. 고무 시트를 15mm x 15mm 정사각형으로 자릅니다. 생검 펀치 또는 선호하는 절단 도구를 사용하여 6mm 구멍을 뚫습니다.
7. 현미경 커버슬립(no. 1.5)에 고무를 부착하여 샘플 용기를 만듭니다. 샘플이 아직 존재하는 동안 10μL의 습식 장착 매체를 딤플에 추가하고 10-15분 동안 어두운 곳에서 배양합니다.
   참고: 이 연구를 위해 장착 매체에는 염색 프로토콜을 줄이기 위해 0.9μg/mL의 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)이 포함되었습니다.
8. 염색 챔버에서 샘플을 제거하고 8.7단계에서 만든 용기에 넣습니다. 시료 위에 1-2 μL의 장착 매체를 도포합니다.
   참고: 마운팅 미디어의 양은 고배율에서 이미지 품질에 영향을 미칩니다. 과도하거나 불충분한 장착 미디어는 이미지 선명도를 손상시킬 수 있습니다.
9. 다른 커버슬립을 위에 놓고 샘플이 유리에 닿도록 부드럽게 누릅니다. 현미경 이미징을 할 때까지 샘플을 4 °C의 어두운 곳에 보관하십시오.

그림 1 은 메타크릴화 반응을 통한 GelMA 합성 과정을 개략적으로 보여주는 실험 설정을 보여줍니다. 그런 다음 생성된 생성물을 사용하여 하이드로겔 기판을 제조하고 그 위에 EC를 파종했습니다. 그 후, 세포를 12 dyne/^cm2에서 6시간 흐름 실험을 위해 흐름 챔버에 도입했습니다.

¹ 개H NMR 분광법을 사용하여 메타크릴레이화 반응의 성공을 평가했습니다(그림 2A). GelMA에서 1.9ppm의 메틸기와 5.4-5.6ppm 사이의 비닐 피크의 존재는 성공적인 메타크릴화를 확인했습니다. 또한, GelMA에서 3ppm에서 라이신 피크의 감소는 라이신 잔기의 소비를 나타내며, 이는 메타크릴레이트 잔기 12,13,16으로 대체됩니다. GelMA 하이드로겔의 강성은 압축 테스트를 사용하여 평가되었으며, 그 결과 GelMA 농도에 따라 압축 계수가 증가하는 것으로 나타났습니다(그림 2B). 4% 및 8%(w/v) GelMA로 구성된 하이드로겔을 사용하여 각각 생리학적(5kPa) 및 병리학적(10kPa) 매트릭스 강성을 모방했습니다⁸.

플로우 챔버는 UV 저항성이 있는 아크릴 폴리머를 사용하여 비용 효율적이고 쉽게 멸균할 수 있도록 설계되었습니다. 이러한 투명성은 실험 중 하이드로겔 및 흐름 조건의 실시간 모니터링을 용이하게 합니다. 3개의 별개의 층으로 설계된 챔버는 적재 또는 하역 중 하이드로겔 손상 위험을 최소화합니다: 하단 플레이트는 견고한 베이스를 제공하고, 중간 레이어는 하이드로겔을 측면 지지하며, 개스킷을 따라 상단 플레이트는 유체 흐름에 필요한 여유 공간을 생성합니다(그림 3A). 챔버 내의 유동 조건과 전단 응력을 평가하기 위해 CFD를 사용하여 컴퓨터 시뮬레이션을 수행했습니다. 다음 방정식(전단 응력 = 0.0558 x 유량)은 유량을 입력으로 기반으로 셀에 적용된 전단 응력을 계산했습니다(그림 3B). 주목할 만한 점은 강성과 같은 재료 특성의 변화는 시뮬레이션에서 전단 응력을 변경하지 않았다는 것입니다. 최종 실험 설정에서 하이드로겔 크기의 차이를 계산하기 위해 계산 모델에서 하이드로겔의 크기를 의도적으로 약간 작게 조정했습니다. 하이드로겔의 한쪽 면과 챔버의 중간 플레이트 벽 사이에 흐름 방향에 수직인 0.5mm의 간격이 생성되었습니다. 이 구성을 통해 이러한 갭에서 전단 응력 효과를 해석할 수 있었습니다. 전단 응력의 불규칙성은 갭 위치에서 관찰되었지만(그림 3B), 그 영향은 갭에 인접한 작은 영역에 국한되었으며 나머지 하이드로겔 표면은 균일한 전단 응력을 경험했습니다(그림 3C). 이러한 통찰력은 난류 영역의 잠재적 영향을 최소화하기 위해 하이드로겔의 가장자리에서 세포를 버리는 것을 제안합니다. 최대 15 dyne/cm²의 더 높은 전단 응력이 장치에 누출 없이 5kPa 및 10kPa 하이드로겔에 파종된 EC에 실험적으로 적용되었다는 점을 언급할 가치가 있습니다(데이터는 포함되지 않음). 그러나 전단 응력을 더 증가시키면 세포 분리 및 하이드로겔 실패가 발생할 수 있으므로 실험 조건의 신중한 최적화가 필요합니다.

파종 세포가 단층을 형성하려면 기존 배양보다 더 높은 세포 밀도를 사용하는 것이 중요합니다. 낮은 파종 밀도는 더 부드러운 하이드로겔에서 단층 형성을 방해하는 것으로 나타났습니다⁸. 또한 세포 파종 전에 하이드로겔을 젤라틴으로 사전 코팅하면 초기 세포 부착과 부드러운 하이드로겔에서의 확산이 향상됩니다. 그러나 이 코팅의 유익한 효과는 주로 셀과 기판 간의 초기 상호 작용을 촉진하기 때문에 일시적이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

그림 4는 강성과 전단 응력이 액틴 섬유의 형성에 어떤 영향을 미치는지 보여줍니다. 전단 응력 하에서 더 두꺼운 응력 섬유가 형성되어 표면에 더 강하게 부착되었음을 시사합니다. 더 부드러운 샘플에서는 생리적 상태의 지표인 말초 액틴 섬유가 더 많았습니다. 그러나, 더 단단한 기판 위의 EC에서, 더 강한 응력 섬유와 더 적은 수의 주변 섬유의 존재는 잠재적으로 EC 기능 장애를 유발할 수 있다¹⁷. 이 데이터는 EC 동작을 조절하는 데 제시된 시스템의 효과를 확인합니다.

그림 1: 현재 연구의 개요. (A) GelMA 합성. 젤라틴은 55°C에서 젤라틴과 무수메타크릴산(MAH) 사이의 반응을 통해 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA)로 화학적으로 변형되었습니다. 그런 다음 제품을 아세톤에 침전시키고 진공 상태에서 건조시켰다. (B) 하이드로겔 제조. 커버 유리는 스페이서를 부착하여 준비했습니다. 그런 다음, 개질된 유리를 커버 유리에 부착하였다. 커버 유리를 금형에 놓고 스페이서를 사용하여 수정된 유리와 금형 바닥 사이에 원하는 간격을 제공했습니다. 개시제를 함유한 GelMA 용액을 개질된 유리와 금형 사이의 개구부에 첨가하여 중합하여 개질된 유리에 공유 결합된 하이드로겔을 형성했습니다. (C) 흐름 실험. 생성된 하이드로겔을 사용하여 EC를 파종했습니다. 단층을 형성한 후 셀은 12dyne/cm²의 전단 응력에서 6시간 흐름 실험을 거쳤습니다. 이 그림은 BioRender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 젤라틴 및 GelMA 사전 중합을 위한 1개의 H-NMR 스펙트럼. (A) 관련 피크에 대한 점선 상자를 참조하십시오. 메타크릴로일 피크(즉, 비닐 및 메틸기)는 젤라틴의 화학적 변형 후에 나타났으며, 라이신기는 화학 반응 후 치환 정도를 정량화하는 데 사용되었습니다¹⁸. (B) 하이드로겔의 영률(Young's modulus)을 압축 시험으로 측정하고, 4%(w/v) GelMA 하이드로겔을 생리학적 기질로 간주하고, 10%(w/v)를 병리학적 기질(n=4, 평균 ± SEM)로 간주하였다. 이 수치는⁸에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 평행 플레이트 흐름 챔버 설계 및 컴퓨터 시뮬레이션. (A) 적재 또는 하역 중 하이드로겔이 손상될 가능성을 줄이기 위해 3개의 개별 플레이트가 사용되었습니다. 바닥판이 지지면을 제공하는 경우, 중간면은 하이드로겔을 위한 측면 지지대를 제공하고, 상판과 개스킷은 유체가 흐를 수 있는 공간을 형성했습니다. (B) 유동 챔버는 컴퓨터 시뮬레이션을 거쳤습니다¹¹. 유속이 215mL/min일 때 그려진 선을 따른 전단 응력은 약 12 dyne/cm² 이며 이는 생리적 전단 응력을 나타냅니다. (C) 0.5mm 간격의 영향은 간격에 인접한 작은 영역에 국한됩니다. 하이드로겔의 나머지 표면은 균일한 전단 응력을 경험합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 전단 응력과 뻣뻣한 하이드로겔은 응력 섬유 형성을 증가시킵니다. 더 많은 주변 액틴 섬유가 흐름 중인 5kPa 샘플의 EC에서 형성됩니다. 세포가 10kPa 하이드로겔의 전단 응력에 노출되었을 때 더 강한 응력 섬유가 형성되어 EC의 거동에 대한 모델의 효과를 보여주었습니다. 화살표는 주변 액틴을 나타내고 별표는 스트레스를 받는 섬유를 나타냅니다. 척도 막대 = 10 μm (파란색: DAPI, 빨간색: Actin Fibers). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

혈관계는 다양한 힘이 세포 행동에 큰 영향을 미치는 역동적인 환경입니다. 이러한 힘을 고려하지 않고 심혈관 질환의 생물학적 현상을 연구하는 것은 부정확합니다. 따라서 혈관의 기계적 환경을 모방할 수 있는 세포 모델이 중요합니다. 연구자들은 이미 이러한 힘이 세포 행동에 미치는 영향을 강조하는 데 상당한 진전을 이루었습니다¹¹. 그러나 인체의 병리학적 및 생리학적 조건 모두에서 세포의 행동을 이해하려면 혈관의 환경과 더 유사한 보다 정확한 모델을 개발하는 것이 필수적입니다. 따라서 우리는 접근 용이성과 사용자 친화성을 유지하면서 혈관 환경을 보다 정확하게 복제하는 시스템을 개발하는 것을 목표로 했습니다.

이 모델은 다양한 강성 수준을 가진 기판의 인간 세포에 제어된 유동 유래 전단 응력을 적용하여 기존 모델에 비해 생리학적 현실에 더 가까운 조건을 생성할 수 있습니다. GelMA는 1) 조정 가능한 기계적 특성, 2) 비팽창 거동, 3) 세포 적합성 및 접착력, 4) 혈관을 보다 정확하게 모델링하기 위한 혈관 세포를 매립하는 능력이라는 기준을 충족하기 위해 이 모델에서 합성 및 활용되었습니다. 기계적 특성의 조정 가능성은 생리학적 및 병리학적 조건을 모방하기 위해 생체 고분자 농도(⁸)를 변화시킴으로써 달성되었다. 두 번째 기준은 붓지 않는 행동이었습니다. 일관된 플로우 챔버 크기, 관련 플로우 조건 및 셀에 대한 전단 응력을 유지하기 위해 팽창하지 않는 기판을 갖는 것이 중요합니다. 높은 수준의 메타크릴레이화를 가진 GelMA는 실험 내내 하이드로겔의 모양과 표면의 평활도를 보존하는 비팽창 특성을 보여주었습니다⁸. 중요한 것은 농도와 강성이 팽윤 거동에 영향을 미치지 않았다는 것인데, 이는 각 실험 그룹에 대해 별도의 조정이 필요하지 않도록 하여 모델을 단순화했습니다. 세 번째 기준은 세포 접착이었는데, 세포 분리를 방지하고 단층 무결성을 보존하기 위해 적절한 부착이 필요하기 때문입니다. GelMA는 세포 접착력을 제공하여 많은 생체 고분자에 필수적인 세포 접착 분자를 기판에 접합하기 위한 추가 단계의 필요성을 줄였습니다. 또한, GelMA의 세포 캡슐화 능력이 고려되었지만, 이 연구에서 직접 테스트되지는 않았습니다. 세포 캡슐화 잠재력은 3D 세포 배양을 지원하고 혈관 평활근 세포 또는 주위 세포와 같은 세포 층을 통합하여 모델의 정확도를 향상시키는 적응증을 가지고 있습니다¹⁹. 또한 GelMA의 합성은 비용 효율적이고 최소한의 장비가 필요하므로 기판 제조를 위한 생체 재료로 탁월한 후보입니다^20,21,22.

평행판 플로우 챔버는 일반적으로 셀에 전단 응력을 가하는 데 사용되지만 전통적으로 유리 커버슬립 또는 단단한 재료에만 사용되었습니다. 그러나 이러한 물질은 생리학적 타당성이 부족하다²³. 대조적으로, microfluidic 장치는 중합체 기반 재료를 활용하여 더 많은 기하학적 복잡성과 더 부드러운 기판을 도입했습니다. 그러나 이러한 장치는 종종 흐름 체제를 정확하게 제어할 수 없으며 크기가 작기 때문에 적은 수의 세포만 연구할 수 있어 실험 결과가 제한됩니다¹¹. 제안된 장치는 내피 세포 단층 시드 하이드로겔을 정밀하게 제어된 전단 응력을 적용하는 유동 챔버와 통합하여 두 시스템의 이점을 결합합니다.

이 장치는 흐름 유래 및 고체 유래 기계적 힘을 모두 통합할 수 있는 능력을 입증했습니다. 12 dyne / cm²의 전단 응력이 6 시간 동안 적용되었을 때, 세포질 응력 섬유의 형성이 관찰되었으며, 이는 더 부드러운 기판 그룹에서 주변 액틴의 우세와 대조되었습니다. 이는 EC가 더 부드러운 표면⁽24,25,26,27)에서 배양 될 때 형성되는 응력 섬유가 적다는 많은 보고서와 일치합니다. 반면에, 층류는 눈에 띄는 응력 섬유 형성을 초래할 수 있습니다. 유동 조건에 대한 세포골격 반응은 유동에 노출된 후 1시간 이내에 시작되지만 재구성을 완료하는 데 현저히 더 긴 시간이 필요하다는 것이 밝혀졌습니다 28,29,30. 말초 액틴 네트워크는 세포-세포 접착 및 장벽 기능을 포함한 다양한 EC 기능에 필수적이다¹⁷. 광범위한 스트레스 섬유를 가진 병리학적 그룹과 비교하여 건강한 실험 그룹에서 이 네트워크를 상향 조절하면 건강한 상태와 질병에 걸린 상태에 대한 장치의 성공적인 모델링을 승인합니다.

이 장치의 한 가지 단점은 하이드로겔이 손상되어 흐름을 방해하고 실험 성공률을 감소시킬 수 있다는 것입니다. 이 문제는 주로 하이드로겔의 초기 결함으로 인해 발생하며, 전단 응력 하에서 악화되어 시료의 분리와 부분적인 흐름 방해로 이어질 수 있습니다. 따라서 중합, 평형 및 절단을 포함한 시료 전처리 단계는 시료에 대한 추가 손상을 방지하기 위해 신중하게 수행해야 합니다. 이 시스템의 또 다른 과제는 단층의 무결성을 달성하고 유지하는 것입니다. 하이드로겔을 젤라틴으로 코팅하면 초기 세포 부착을 개선할 수 있지만, 이전 연구에서는 이 코팅이 세포 증식에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다⁸. 따라서, 단층 형성을 향상시키기 위해, 특히 세포 증식이 더 부드러운 하이드로겔⁽³¹)에서 더 느리다는 점을 고려하면, 파종 밀도를 증가시키는 것이 유익하다. 또한 유체 흐름에 의해 유도된 전단 응력으로 인해 셀이 분리될 수 있습니다. 따라서 셀이 새로운 환경 조건에 적응할 수 있는 충분한 시간을 허용하여 유속을 점진적으로 증가시키는 것이 중요합니다.

결론적으로, 이 장치는 유체 유래 및 고체 유래 기계적 힘을 동시에 시뮬레이션할 수 있는 능력으로 인해 혈관 환경을 보다 정확하게 시뮬레이션하는 데 있어 상당한 발전을 나타냅니다. 다양한 생리학적 및 병리학적 조건에서 EC 행동을 연구하기 위한 포괄적인 플랫폼을 제공합니다. 이러한 다양성은 혈관 생물학 및 질병 진행에 대한 이해를 발전시키는 데 유용한 도구입니다. 이 모델은 기계생물학, 죽상동맥경화증, 암 전이 발달, 혈관 조직 공학 및 혈관신생, 약물 전달 및 스크리닝을 포함한 다양한 연구에 기여할 수 있습니다.

저자는 임시 특허 출원(No. 63/634,853)이 Flow Chamber with a Mechanically Tunable Substrate라는 제목으로 제출되었으며 다른 경쟁 이익이 존재하지 않는다고 선언합니다.

저자들은 유동 챔버 제작에 도움을 준 Robert Egan에게 감사를 표합니다. 저자는 실험 중 도움을 준 Lucas McCauley에게 감사를 표합니다. 또한 컨포칼 현미경에 대한 접근을 허용한 Northeastern University의 CILS(Institute for Chemical Imaging of Living Systems) 핵심 시설에 감사드립니다. 저자는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, NIH 1R01EB027705은 SB에 수여)과 국립과학재단(National Science Foundation, NSF CAREER Awards: DMR은 1847843 SB에, CMMI 1846962는 EE에 수여)이 제공하는 자금 지원을 인정한다.