מודל In Vitro המשלב קשיחות מצע וזרימה לחקר תגובות תאי אנדותל

סינתזנו ואפיינו מצע מבוסס ג'לטין לגידול תאי אנדותל וסקולריים (ECs) בתנאי זרימת כלי דם רלוונטיים. משטח ביומימטי זה משכפל מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד, ומאפשר לחקור כוחות מכניים על התנהגות EC ולקדם את הבנתנו של בריאות כלי הדם ומנגנוני מחלות.

אנו מציגים מודל חדשני במבחנה שמטרתו לחקור את ההשפעות המשולבות של קשיחות רקמות ולחץ גזירה על תפקוד תאי האנדותל (EC), שהן חיוניות להבנת בריאות כלי הדם והופעת מחלות כגון טרשת עורקים. באופן מסורתי, מחקרים בחנו את ההשפעות של לחץ גזירה ונוקשות המצע על ECs, באופן עצמאי. עם זאת, מערכת משולבת זו משלבת גורמים אלה כדי לספק סימולציה מדויקת יותר של הסביבה המכנית של כלי הדם. המטרה היא לבחון EC mechanotransduction על פני רמות שונות של קשיחות רקמות ותנאי זרימה באמצעות ECs אנושיים. אנו מפרטים את הפרוטוקול לסינתזה של הידרוג'לים ג'לטין מתקרילט (GelMA) עם קשיחות מתכווננת וזריעה שלהם עם ECs כדי להשיג מפגש. בנוסף, אנו מתארים תכנון והרכבה של תא זרימה חסכוני, בתוספת סימולציות חישוביות של דינמיקת זורמים, ליצירת תנאי זרימה פיזיולוגיים המאופיינים בזרימה למינרית וברמות מתח גזירה מתאימות. הפרוטוקול משלב גם תיוג פלואורסצנטי למיקרוסקופ קונפוקלי, המאפשר להעריך את תגובות EC הן לתאימות רקמות והן לתנאי זרימה. על ידי חשיפת ECs בתרבית לגירויים מכניים משולבים מרובים, מודל זה מאפשר חקירות מקיפות כיצד גורמים כגון יתר לחץ דם והזדקנות עשויים להשפיע על תפקוד EC ומחלות כלי דם בתיווך EC. התובנות שיתקבלו מחקירות אלה יסייעו בהבהרת המנגנונים העומדים בבסיס מחלות כלי דם ובפיתוח אסטרטגיות טיפול יעילות.

אנדותליום, המצפה את פני השטח הפנימיים של כלי הדם, ממלא תפקיד מרכזי בשמירה על בריאות כלי הדם. תאי אנדותל (ECs) הם מרכזיים בוויסות תפקודים קרדיווסקולריים שונים, כולל בקרת טונוס כלי דם, חדירות סלקטיבית, המוסטאזיס ומכנוטרנסדוקציה ^1,2. מחקרים קשרו קשר הדוק בין תפקוד לקוי של EC לתפקיד עיקרי בהתפתחות טרשת עורקים. יש לציין כי ECs נתקלים בכוחות מכניים מגוונים בממשקים שבהם הם מתקשרים עם זרימת הדם ורקמות כלי הדם הבסיסיים ^3,4. מספר מחקרים קשרו תפקוד לקוי של EC עם שינויים חריגים בגורמים מכניים בסביבת כלי הדם, כגון לחץ גזירת נוזלים מזרימת הדם ונוקשות רקמות ^5,6,7.

עם זאת, מחקרים קודמים קיבלו תשומת לב מוגבלת בהבנת ההשפעות המשולבות של קשיחות רקמות ולחץ גזירה על תפקוד EC. כדי לשפר את היכולת לתרגם תוצאות מחקר לטיפולים יעילים לטרשת עורקים ומחלות לב וכלי דם אחרות, חיוני לשפר את המודלים התאיים המשמשים בתחום. התקדמות משמעותית הושגה בהאנשת מודלים תאיים על ידי שימוש ב- ECs אנושיים וחשיפתם ללחץ גזירה או מצעים עם רמות קשיחות משתנות ^8,9,10. עם זאת, האימוץ והשכלול של מודלים תאיים המשלבים סביבות זרימה דינמיות עם מצעי EC בעלי תכונות קשיחות מתכווננות התקדם באיטיות. האתגר טמון בתכנון מצעי EC שאינם מתנפחים כדי למנוע שינויים בפרמטרי הזרימה בתוך ערוץ הזרימה תוך הקלה על טיפוח חד-שכבות EC שלמות ומודבקות היטב. מודל במבחנה המסוגל להתגבר על מכשולים אלה יכול להקל על חקירות יעילות יותר כיצד יתר לחץ דם, הזדקנות ותנאי זרימה משפיעים בשיתוף פעולה על מכנוטרנסדוקציה EC, בריאות כלי הדם, ובסופו של דבר, התפתחות טרשת עורקים. פותחו שיטות שונות להפעלת לחץ גזירה על תאים תוך שליטה בנוקשות המצע, כולל לוחות מסתובבים והתקנים מיקרופלואידים. בשיטת הלוחות המסתובבים, התאים ממוקמים בין שני לוחות ומתח הגזירה מופעל באמצעות התנועה הסיבובית של הלוחות. שיטה זו פחות מסובכת ומספקת מודל מהיר; עם זאת, הוא סובל משונות מתח גזירה מרחבית, עם אפס לחץ גזירה במרכז ולחץ גזירה מרבי בפריפריה¹¹.

מצד שני, התקנים microfluidic מייצגים את הדור החדש של כלים עם היכולת לשלוט קשיחות המצע ותנאי זרימה. מערכות אלה מתאימות לחיקוי כלי דם זעירים בתנאי זרימה למינרית. עם זאת, לימוד טרשת עורקים עם מכשירים כאלה אינו מעשי, כמו טרשת עורקים מתרחשת בכלי גדול עם זרימה מופרעת¹¹. מאמר זה נועד לתרום לתחום המחקר הקריטי של מחקרי EC על ידי הצגת מערכת חסכונית המסוגלת לבחון את ההשפעות של רמות קשיחות משתנות במצעי EC בתנאי זרימה שונים. המערכת משלבת מצעים עם קשיחות שונה כדי לחקות כלי דם פתולוגיים ופיזיולוגיים. פרוטוקול זה מתאר את השיטה ליצירת הידרוג'לים מבוססי ג'לטין ללא רמות נפיחות ונוקשות של 5 kPa ו- 10 kPa, המייצגים נוקשות פיזיולוגית ופתולוגית, בהתאמה. בנוסף, מפורטת בניית תא זרימה מקבילי המסוגל לשלב מצעים אלה. דינמיקת נוזלים חישובית (CFD) שימשה להערכת לחץ גזירה ותנאי זרימה. הכנת הידרוג'לים לתרבית EC וביצוע ניסוי זרימה של 6 שעות מתוארים, ואחריו דיון על אימונוסטיין לאחר הניסוי.

1. סינתזה של GelMA

1. הכן פתרון 0.2 M של נתרן פחמתי נטול מים ותמיסה 0.2 M של סודיום ביקרבונט.
2. ערבבו 46 מ"ל של תמיסת סודיום ביקרבונט עם 15 מ"ל של תמיסת נתרן פחמתי והוסיפו 139 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה (DI). כוונן את רמת החומציות ל-9.5 באמצעות 0.1 M NaOH ו-HCl במידת הצורך.
3. הוסף 10 גרם של ג'לטין מסוג A, 300-bloom מעור חזירי ל 100 מ"ל של חיץ קרבונט-ביקרבונט בריכוז של 10% w/v.
4. יש להמיס את הג'לטין באמצעות אמבט מים בטמפרטורה של 55°C תוך ערבוב התמיסה במהירות 700 סל"ד באמצעות מערבל מגנטי. לאחר המסה מלאה, התאם את ה- pH של תמיסת הג'לטין ל- 9.5 באמצעות 0.1 M NaOH.
5. כדי להתחיל מתקרילציה, הוסף 938 μL של אנהידריד מתאקרילי (MAH) טיפתית לתמיסה. שפר את הפיזור הראשוני של MAH בתמיסת הג'לטין על ידי הזרקתו במקומות שונים, כולל עומקים שונים ומרחקים רדיאליים מהמרכז.
6. עטפו את כלי התגובה ברדיד אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור. שמרו על הטמפרטורה ב-55°C וערבבו את התמיסה ב-500 סל"ד במשך שעה אחת כדי להשלים את התגובה (איור 1A)¹².
   הערה: התגובה נעצרת ב-pH מתחת ל-7.4.
7. הכינו אחת של 2 ליטר המכילה 1.8 ליטר אצטון וכוס אחת של 0.6 ליטר המכילה 0.3 ליטר אצטון.
8. הוסף את תמיסת GelMA המתקבלת טיפה לכוס 2 ליטר תוך ערבוב ב 200 סל"ד כדי לגרום משקעים¹³. כדי למקסם את איסוף המוצר המואץ, מקם מוט נירוסטה או מרית כאתר גרעין להעברה קלה יותר.
9. מעבירים את המוצר מהכוס הגדולה יותר לקטנה יותר ומניחים לו לשבת 10 דקות לפני שממשיכים לשלב הייבוש. הג'ל המואץ צריך להופיע כסיבים לבנים.
10. יש לאסוף את המוצר על נייר סופג, לייבש אותו בתנור ואקום בטמפרטורת החדר (RT), ולאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש נוסף.
    הערה: פרטים נוספים על האפיון הכימי של המוצר באמצעות תהודה מגנטית גרעינית של פרוטון (¹H NMR) ניתן^{למצוא בעבודה 8} שפורסמה בעבר.

2. המלחת זכוכית

הערה: חיבור הידרוג'לים למגלשות זכוכית מספק משטח שטוח ואחיד, מקל על הטיפול ומבטיח יציבות תחת לחץ גזירה שמקורו בזרימה. פונקציונליזציה של הזכוכית עם 3-(trimethoxysilyl)פרופיל methacrylate נחוצה כדי לשפר את תכונות פני השטח ולאפשר חיבור קוולנטי של הידרוג'לים במהלך תהליך פילמור.

1. חתכו במדויק שקופיות מיקרוסקופ פשוטות (עובי 1 מ"מ) לחתיכות הדומות למידות ההידרוג'ל הסופיות באמצעות חותך זכוכית. שטפו את המגלשות החתוכות בסבון כדי להסיר מזהמים ופסולת שעלולים להפריע לטיפול במשטח הזכוכית.
   הערה: במידת הצורך, יש לסובב את מגלשות הזכוכית למשך 5 דקות באתנול, ולאחר מכן לייבש באוויר.
2. הכינו תמיסה של 0.5% של 3-(trimethoxysilyl)פרופיל מתקרילט באתנול מוחלט. הכינו תמיסת חומצה אצטית קרחונית 10% במי DI. ערבבו את התמיסות כדי להשיג ריכוז סופי של 3% חומצה אצטית קרחונית.
   הערה: ניתן להכין את תמיסת החומצה האצטית הקרחונית בכמויות גדולות ולאחסן.
3. ארגנו את מגלשות הזכוכית במיכל זכוכית כדי להבטיח שמשטחי הזכוכית לא ייחסמו. יוצקים את התמיסה המתקבלת על מגלשות הזכוכית ושומרים אותן כ-5 דקות על נדנדה ב-80 סל"ד להשלמת התגובה. ודא ששני הצדדים של מגלשות הזכוכית משתנים על ידי הסרת בועות אוויר לכודות.
4. לאחר השלמת התגובה, לשאוף את הפתרון ולשטוף את שקופיות זכוכית עם אתנול 2x. יבשו את המגלשות באוויר ואחסנו אותן בחושך ב-RT.
   הערה: שקופיות הזכוכית שומרות על השינוי שלהן למשך חודש בתנאים אלה.

3. הכנת הידרוג'ל

1. לייצר הידרוג'לים באמצעות שיטת פילמור רדיקלים חופשיים המושרה על ידי חמצון-חיזור.
   1. הרכיבו תבניות פוליטטרה-פלואוראתילן (PTFE) בעלות עומק מתאים וחלונות פתיחה של 10 מ"מ² לעיצוב המצע הסופי. הסבר להתכווצות של 25% בגובה ההידרוג'ל לאחר פילמור במהלך תהליך התכנון. ודאו שהתבניות שטוחות ומהודקות היטב בפלטות התחתונות והעליונות כדי למנוע דליפה.
      הערה: מידות התבנית המעוצבות גדולות בכוונה ב-10% מגודל ההידרוג'ל המיועד. עיצוב זה משרת מספר מטרות: הוא מונע נזק לצדדים בעת הפרדת עובש, משפר את אחידות פני השטח של ההידרוג'ל על ידי דחיפת זיהומים או בועות לצדדים, ומפצה על התכווצות צפויה של 25% לאחר שיווי משקל עקב אפקט הסינרזיס, שבו הידרוג'לים מוצלבים מאוד דוחים מים לאחר שיווי משקל, וגורמים להתכווצות. סכום ההתכווצות מצוין בפרוטוקול⁸.
   2. כדי להבטיח שלהידרוג'לים יש משטח אחיד וגובה קבוע, השהו שקופיות זכוכית שהשתנו מהצלחת העליונה של התבנית, מה שמאפשר פתח צר להזרקת תמיסת הפולימר. השתמשו בזכוכית כיסוי כדי להשעות את שקופיות הזכוכית ששונו (איור 1B).
   3. כדי ליצור את זכוכית הכיסוי, חתכו זכוכית מיקרוסקופית רגילה הגדולה ב-20% מהתבנית. חברו שני ספייסרים לצדדים הקצרים יותר. חשב את עובי המרווח באופן הבא:
      עובי ספייסר = 1.33 x עובי ג'ל סופי + 1 (עובי הזכוכית ששונה) - עומק התבנית
   4. יש למרוח שכבה דקה של שומן איטום תואם תאים על הצדדים הארוכים יותר של זכוכית הכיסוי, על אותו משטח אליו מחוברים הספייסרים.
   5. חבר את שקופית הזכוכית ששונתה לזכוכית הכיסוי בין שני הספייסרים.
   6. הניחו את זכוכית הכיסוי על התבנית כך שהספייסרים ישבו על התבנית והזכוכית המותאמת תימשך לתוך התבנית. מערך זה מספק מרווח של 1.33 מגובה ההידרוג'ל הסופי בין הזכוכית ששונתה לתחתית התבנית.
   7. יש להמיס את הג'ל במי DI בטמפרטורה של 4% ו-10% w/v עבור הידרוג'לים של 5 kPa ו-10 kPa, בהתאמה, ולהניח אותו באמבט מים של 45°C.
      הערה: GelMA הוא פולימר רגיש לחום ושמירה על טמפרטורת התמיסה ב-45°C מונעת התמצקות לפני פילמור ומפחיתה את צמיגות התמיסה, שהיא חיונית לייצור הידרוג'לים שטוחים.
   8. הוסף TEMED (24 mM עבור 5 kPA הידרוג'ל, 6.25 mM עבור 10 kPa הידרוג'ל) לתמיסת הפולימר וערבב היטב.
      הערה: TEMED לבדה אינה יוזמת פילמור, לכן יש לוודא שמכינים תבניות, פיפטות ותמיסות לפני שתמשיך.
   9. הוסף APS (24 mM עבור 5 kPA הידרוג'ל, 24.5 mM עבור 10 kPa הידרוג'ל) לתמיסת GelMA וערבב היטב.
      הערה: הוספת APS מתחילה את הפילמור, והידרוג'לים עשויים להיווצר במהירות, מה שדורש פעולה מהירה למניעת הידרוג'לים פגומים. פרטים נוספים על מדידות הנוקשות ניתן^{למצוא בעבודה 8} שפורסמה בעבר.
   10. בזהירות פיפטה את הפתרון שנוצר לפתח בין מגלשת הזכוכית התלויה לבין התבנית ב RT ולאפשר לה לחצות. כוח נימי מניע את תמיסת הפולימר לתוך התבנית. הימנעו מהוספת בועות לג'לים והפסיקו את הפיפט כאשר נשארת כמות קטנה של תמיסה בקצה הפיפטה.
       הערה: במהלך פילמור, קבוצות מתקרילט של GelMA מגיבות עם שאריות מתקרילט על שקופיות הזכוכית שעברו שינוי, וכתוצאה מכך החיבור הכימי של ההידרוג'ל לזכוכית.
   11. לאחר 15 דקות, התגובה הושלמה. נתקו את המצע מהתבנית באמצעות חפץ חד, כגון מחט, והחליקו את המצע הרחק מזכוכית הכיסוי כדי להפריד אותו.
   12. מעבירים את ההידרוג'לים ל-1x מלח חוצץ פוספט (PBS) בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ אטומה בסרט פלסטיק ומאוזנים ב-37°C כדי להסיר את המגיבים ותוצרי הלוואי שנותרו.
   13. מכיוון שההידרוג'ל מעט גדול יותר מהמידות הסופיות, קצצו את עודפי הג'ל בצדדים כך שיתאימו למידות הדרושות לחלון תא הזרימה.
   14. השתמש בתא הזרימה כדי לאמת את מידות ההידרוג'ל. יש לוודא שההידרוג'ל מתאים כראוי לתא הזרימה ללא רווחים בין ההידרוג'ל לתבנית או פגמים שעלולים להשפיע על דפוסי הזרימה. אם יש חריגות צורה שעלולות להשפיע על דפוס הזרימה בתא הזרימה, מה שמוביל להתנהגות תאים שלילית, שמור את ההידרוג'ל לתנאים סטטיים.
   15. מעבירים ארבעה הידרוג'לים לצלחת פטרי המכילה 1x PBS לעיקור.
2. יש לעקר את ההידרוג'ל כמתואר להלן באמצעות 70% אתנול.
   1. הכינו תמיסות אלכוהול של 25%, 50% ו-70% להתייבשות הידרוג'ל הדרגתית.
      הערה: אם לא מתבצעת התייבשות הדרגתית, הידרוג'לים נוקשים יותר עלולים להתכווץ ולהישבר, בעוד שקמטים עלולים להיווצר על פני השטח של הידרוג'לים רכים יותר.
   2. שאפו את תמיסת PBS 1x מצלחת פטרי המכילה הידרוג'לים. הוסיפו תמיסת אתנול 25% לכל צלחת פטרי כדי לטבול את 5 kPa ו-10 kPa הידרוג'לים למשך 15 דקות.
   3. שאפו לתמיסת 25% אלכוהול. הוסיפו תמיסת 50% אלכוהול לכל צלחת פטרי כדי לטבול את 5 kPa ו-10 kPa הידרוג'לים למשך 15 דקות.
   4. שאפו לתמיסת 50% אלכוהול. הוסיפו תמיסת 70% אלכוהול לכל צלחת פטרי, והטביעו את 5 kPa ו-10 kPa הידרוג'לים למשך 5 דקות. מניחים את צלחת הפטרי על שייקר ב-100 סל"ד.
   5. השאירו את ההידרוג'לים של 5 kPa שקועים למשך 40 דקות ואת ההידרוג'לים של 10 kPa למשך 20 דקות.
      הערה: 5 הידרוג'לים kPa נצפו נוטים יותר לזיהום בהשוואה ל -10 הידרוג'לים kPa.
   6. העבירו את הדגימות לצלחת בעלת 6 בארות בארון בטיחות ביולוגית ושטפו את ההידרוג'לים 2x-3x באמצעות PBS סטרילי.

4. ציפוי הידרוג'לים

1. הכינו תמיסת ג'לטין 60 מק"ג/מ"ל על ידי המסת 3 מ"ג ג'לטין ב-50 מ"ל PBS סטרילי (1x עם מגנזיום ומלח סידן). מחממים את התמיסה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות או עד שכל הג'לטין מומס במלואו.
2. מסננים סטריליים את תמיסת הציפוי באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. שאפו את תמיסת PBS 1x מכל צלחת באר והוסיפו תמיסת ג'לטין לכל באר, תוך הבטחת כיסוי מלא של כל הידרוג'ל. כדי למזער את הסיכון לזיהום, הוסף 40 יחידות / מ"ל של פניצילין ו 10 מיקרוגרם / מ"ל של סטרפטומיצין לתמיסת הציפוי.
3. דוגרים על כל צלחת באר באינקובטור של 37°C, 5% CO₂ למשך 45 דקות. שטפו את ההידרוג'לים בתמיסת PBS אחת.
4. שאפו PBS והוסיפו מדיה של תרביות תאים.
5. במשך לא יותר מיומיים, שמרו את ההידרוג'לים במדיה של תרביות תאים ודגרו עליהם באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ עד לזריעת תאים.
   הערה: למרות תכונות החיבור המצוינות של פיברונקטין לתאים, קיים חשש לגבי השימוש בו עקב ECs המפקידים פיברונקטין אנדוגני בתנאים טרשת עורקים, מה שעלול להוביל לתגובה פרו-דלקתית. כדי להימנע מתגובות כימיות של התא, אנו נמנעים משימוש בפיברונקטין (fibronectin). בנוסף, אור ועמיתיו הדגימו כי ציפוי פיברונקטין בהשוואה לציפוי קולגן I, מעלה את רמת הגנים האתרוגניים. באופן ספציפי, הם הבחינו ברמות ביטוי מוגברות של מולקולת היצמדות בין-תאית 1 (ICAM-1), מולקולת היצמדות תאי כלי דם 1 (VCAM-1) וגורם גרעיני-κB (NF-κB)¹⁴.

5. זריעת תאים על המצע

1. הכינו את תרחיף התא בהתאם לפרוטוקולי הניתוק הזמינים וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר⁸.
2. ביסודיות לשאוף את התקשורת מן hydrogels. הוסף 50,000 תאים/סמ"ר לכל דגימה. הוסף נפח מתאים של תרחיף תאים לכל דגימה כדי למנוע הצפת תאים.
   הערה: מצעים נוקשים יותר הם הידרופוביים יותר; לכן, צמצם את הזמן בין השלבים כדי לשפר את יכולת ההרטבה ואת פיזור תרחיף התא על פני המצע.
3. לדגור הידרוג'ל זרעי תאים ב 37 ° C, 5% CO₂ אינקובטור במשך 2 שעות. הוסף מדיה של תרבית תאים לדגימות ברגע שהתאים מחוברים לג'לים.

6. ייצור תאי זרימה

הערה: הגישה לתכנון תא הזרימה היא חסכונית ודורשת מומחיות מינימלית לייצור וניצול.

1. השתמש בפולי(מתיל מתקרילט) לייצור תאים כדי להעריך חזותית את איכות הזרימה, שלמות הידרוג'ל תחת לחץ גזירה, ומחקרי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים בזמן אמת במהלך ניסויי זרימה. עיצוב התא נוצר באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD). תא הזרימה הוגש לפטנט, ולא ניתן לחשוף פרטים על מכשיר זה בפרוטוקול הנוכחי.
2. הערכה חישובית של תנאי הזרימה בתא הזרימה
   1. הרכיבו את הרכיבים הבודדים של תא הזרימה המתוכנן (. קובצי SLDPRT) ליצירת הגדרת התא הסופי.
   2. ציירו קו לאורך קו המרכז של הזרימה המשיק למשטח ההידרוג'ל כדי לנתח את לחץ הגזירה. סגור את פתחי הכניסה והשקע כדי להגדיר אמצעי אחסון לבקרה סגורה.
   3. פתח את Flow Simulation מהכרטיסייה Add-Ins בתוכנת CAD. בכרטיסיה סימולציית זרימה, פתח את התכונה אשף כדי להזין את המאפיינים. ציין את מערכת היחידות והתאם את הלחץ ואת יחידות הלחץ לדיין/ס"מ².
   4. בדוק את זרימת הנוזל ואת כוח הכבידה בתכונות הפיזיות. הגדר את כוח הכבידה ל- -9.8 ברכיב Z; רכיבי X ו- Y צריכים להיות אפס.
   5. בחר פנימי עבור סוג ניתוח תחת טיפול בגיאומטריה. בחר מים כנוזל ברירת המחדל.
      הערה: נניח שהתווך מתנהג כמו מים.
   6. בחר Laminar ו- Turbulent עבור סוג הזרימה. הגדירו את הקיר כקיר אדיאבטי וחספוס משטח קלט במצב קיר.
   7. הגדר את הטמפרטורה ל- 37.5 ° C (310.65 K) בתנאים התחלתיים. הגדר את התחום החישובי בפרויקטים של סימולציית זרימה, וודא שהוא מכסה את כל נפח הבקרה.
   8. בחר את כל הקירות המתממשקים עם הנוזל כדי להגדיר את תת-התחום של הנוזל. במצב גבול, הגדר את המשטח הפנימי של מכסה הכניסה כזרימת נפח כניסה וציין קצב זרימה (Q) וזרימה אחידה. לאחר מכן, הקצו את המשטח הפנימי של איטום מכסה היציאה כלחץ סטטי.
   9. קבע את גודל הרשת הכולל בהתבסס על משאבי חישוב זמינים. לחץ על Run כדי להתחיל את הסימולציה.
   10. בסיום, סקור את התוצאות הרצויות, כולל תרשימי מתח גזירה והדמיות זרימה.
   11. חזור על שלבים 6.2.8 עד 6.2.10 עם קצבי זרימה שונים כדי לחשב את לחץ הגזירה המופעל בקצבים שונים. השתמש בניתוח רגרסיה כדי לבסס את יחסי הלחץ בין קצב הזרימה לגזירה.
   12. להעריך את הסיבולת של המערכת לשינויים בממדי הידרוג'ל כדי לשפר את הריאליזם של הסימולציה.

7. הפעל זרימה למינרית אחידה

1. לאחר גידול תאים על הידרוג'לים 5 kPa ו 10 kPa, להבטיח מפגש של monolayer התא ב 37 ° C, 5% CO₂ אינקובטור. יש להשיג שכבה אחידה של תאים על כל הידרוג'ל.
2. עיקור רכיבים אוטוקלאביים של מערכת תאי זרימת הלוחות המקבילים (ברגי נירוסטה, מרית, מלקחיים, אטם ומאגר המדיה) עם מחזור כבידה של 30 דקות. יש לעקר חלקים אחרים (רכיבים אקריליים ואוטם/דמפרים למאגר) בחשיפה לאור UV.
3. הרכיבו את התקן תא הזרימה בארון בטיחות ביולוגית. דגימות הידרוג'ל מאובטחות במכשיר, תוך הבטחת אחידות. השתמש בחומר מילוי בגודל שווה להידרוג'לים אם אין מספיק דגימות זמינות לזרימה.
4. יש להרטיב מראש את המשטח הפנימי של התא ומשטחי ההידרוג'ל כדי למזער היווצרות בועות ולמנוע התייבשות תאים במהלך ההרכבה.
5. הוסף מספיק מדיה למאגר הכניסה, ואפשר ל-20%-30% מהמדיה לזרום למאגר היציאה בעת ההרכבה. אטמו את מאגר הכניסה אטום באמצעות בולם / איטום.
   הערה: הצטברות לחץ במאגר הכניסה מניעה את הזרימה, וכל דליפת אוויר משנה את קצב הזרימה. בדוק אם נוצרות פגמים בחומר האיטום אם נוצרות בועות בצנרת החיצונית.
6. הגדר את מנחת היציאה ללחץ אטמוספרי כדי לקבוע את הפרש הלחצים. מקם את המכשיר והמאגרים באינקובטור 37°C, 5% CO₂ . חברו את צינורות המכשיר למשאבה פריסטלטית הממוקמת מחוץ לאינקובטור (איור 1C).
7. הפעל את המשאבה כדי להתחיל למרוח 3.6 dyne/cm². הגדילו בהדרגה את קצב הזרימה במרווחים של 2 מ"ל/דקה (למשל, הגיעו ל-85 מ"ל/דקה מ-65 מ"ל/דקה לאחר 10 דקות) עד למריחת כ-8 דיין/ס"מ².
8. הגדל עוד יותר את קצב הזרימה במרווחים של 2.5 מ"ל/דקה עד שתגיע ל-12 דיין/ס"מ² של לחץ גזירה.
   הערה: הקדישו זמן לתאים להסתגל למצב הדינמי, מכיוון שעלייה מהירה בקצב הזרימה עלולה לנתק תאים ולפגוע בשכבה החד-שכבתית.
9. לאחר 6 שעות, לעצור את הזרימה, להסיר את המכשיר מן האינקובטור, ולפרק את תא הזרימה. לאחר מכן, להעביר דגימות הידרוג'ל צלחת שש בארות.
10. שטפו את הדגימות עם PBS קר כקרח וקבעו את התאים להצבעה חיסונית או ליזה אותם לבידוד חלבונים.

8. מערך אימונוסטיין למיקרוסקופ קונפוקלי בהגדלה גבוהה

הערה: כדי להגביר את יעילות המחקר, פותחה שיטה לצביעת חלקים קטנים של הידרוג'ל, המאפשרת בחינה של מטרות ביולוגיות מרובות בדגימה אחת.

1. הכינו אגרופי ביופסיה או כלי חיתוך מועדפים בקטרים של 3 או 4 מ"מ.
2. השתמשו בקופסת קצוות פיפטה כתא צביעה. יש לחלח את התא כדי לשלוט באידוי תמיסת הצביעה במהלך הדגירה הממושכת על ידי הנחת מגבת נייר רטובה בתחתית קופסת קצה הפיפטה.
3. הפחיתו את צריכת הנוגדנים על ידי יצירת מאגרי תמיסות קטנות עבור דגימות בודדות. כסו את מתלה קופסת הקצה בסרט שקוף, ולחצו בעדינות את הסרט על חורי המתלה עם קצה אצבע ליצירת גומות חן. מלא את גומות החן עם 70 μL של PBS.
4. מעבירים הידרוג'ל בודד לצלחת פטרי ריקה וחותכים אותה באמצעות ניקוב ביופסיה או כלי חיתוך מועדף. השתמש במיקרוסקופ כדי לחתוך אזור מדגם מייצג. חותכים גליל ג'ל מלא כדי למנוע בעיות במיקרוסקופ קונפוקלי.
5. הניחו את דגימות ההידרוג'ל החתוכות בגומות שנוצרו בשלב 8.3. ביצוע צביעה לפי פרוטוקול תקן¹⁵. לאחר שטיפת הצביעה הסופית, יש להצטייד ביריעת גומי סיליקון המתאימה לעובי ההידרוג'ל.
   הערה: רצוי להשתמש בסדין עם צד דביק אחד לשיפור האיטום. במחקר זה, סיבי אקטין הוכתמו באמצעות נוגדן משני פלואורסצנטי שהוצמד לפלואידין בדילול של 1:20.
6. חותכים את יריעת הגומי לריבועים בגודל 15 מ"מ x 15 מ"מ. ניקבו חור בקוטר 6 מ"מ באמצעות ניקוב ביופסיה או כלי חיתוך מועדף.
7. צור מיכל לדוגמה על ידי הצמדת הגומי לכיסוי מיקרוסקופיה (מס' 1.5). הוסיפו 10 μL של אמצעי הרכבה רטובים לגומות החן כאשר הדגימה עדיין קיימת ודגרו עליה בחושך למשך 10-15 דקות.
   הערה: במחקר זה, אמצעי ההרכבה הכיל 0.9 מיקרוגרם/מ"ל של 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כדי לקצר את פרוטוקול הצביעה.
8. הסר את הדגימה מתא הצביעה והנח אותה במיכל שנוצר בשלב 8.7. יש למרוח 1-2 μL של אמצעי הרכבה על גבי הדגימה.
   הערה: כמות חומרי ההדפסה המצטברים משפיעה על איכות התמונה בהגדלות גבוהות. הרכבה מוגזמת או לא מספקת עלולה לפגוע בבהירות התמונה.
9. הניחו מעל כיסוי נוסף ולחצו בעדינות כדי לוודא שהדגימה באה במגע עם הזכוכית. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 4°C בחושך עד להדמיית מיקרוסקופיה.

איור 1 מתאר את מערך הניסוי, ומתאר את התהליך של סינתזת GelMA באמצעות תגובת מטאקרילציה. המוצר שהתקבל שימש אז לייצור מצע ההידרוג'ל, שעליו נזרעו ECs. לאחר מכן, התאים הוכנסו לתא הזרימה לניסוי זרימה של 6 שעות במהירות של 12 דיין לסמ"ק².

¹ספקטרוסקופיית H NMR שימשה להערכת ההצלחה של תגובת המתאקרילציה (איור 2A). נוכחות של קבוצת מתיל ב 1.9 ppm ושיא ויניל בין 5.4-5.6 ppm ב GelMA אישרו מתקרילציה מוצלחת. בנוסף, הירידה בשיא הליזין ב-3 ppm ב-GelMA מצביעה על צריכת שאריות ליזין, המוחלפות בשאריות מתקרילט 12,13,16. הנוקשות של הידרוג'ל GelMA הוערכה באמצעות בדיקת דחיסה, אשר הראתה כי מודולי הדחיסה גדלו עם ריכוזי GelMA (איור 2B). הידרוג'לים המורכבים מ-4% ו-8% (w/v) GelMA שימשו לחיקוי קשיחות מטריצה פיזיולוגית (5 kPa) ופתולוגית (10 kPa), בהתאמה⁸.

תא הזרימה תוכנן להיות חסכוני ולעיקור קל, על ידי שימוש בפולימר אקרילי עמיד בפני UV. שקיפותו מאפשרת ניטור בזמן אמת של הידרוג'לים ותנאי זרימה במהלך ניסויים. התא, המעוצב עם שלוש שכבות נפרדות, ממזער את הסיכון לנזקי הידרוג'ל במהלך טעינה או פריקה: הלוח התחתון מספק בסיס יציב, השכבה האמצעית מציעה תמיכה רוחבית להידרוג'לים, והלוח העליון, לאורך האטם, יוצר את המרווח הדרוש לזרימת נוזלים (איור 3A). סימולציות חישוביות נערכו באמצעות CFD כדי להעריך את תנאי הזרימה ואת לחץ הגזירה בתוך התא. המשוואה הבאה - מתח גזירה = 0.0558 x קצב זרימה - חישבה את לחץ הגזירה המופעל על התאים בהתבסס על קצב הזרימה כקלט (איור 3B). יש לציין כי שינויים בתכונות החומר, כגון נוקשות, לא שינו את לחץ הגזירה בסימולציות. כדי לספור את ההבדלים בגודל ההידרוג'ל במערך הניסוי הסופי, גודל ההידרוג'ל היה בכוונה מעט קטן יותר במודל החישובי. נוצר רווח של 0.5 מ"מ בין צד אחד של ההידרוג'לים לבין דפנות הלוחות האמצעיים של החדר, בניצב לכיוון הזרימה. תצורה זו אפשרה ניתוח של השפעות לחץ גזירה בפערים אלה. בעוד שאי-סדירות בעקת הגזירה נצפתה במיקומים מרווחים (איור 3B), ההשפעה שלהם הייתה מוגבלת לאזור קטן הסמוך לפערים, כאשר משטח ההידרוג'ל הנותר חווה לחץ גזירה אחיד (איור 3C). תובנות אלה מציעות להשליך תאים משולי הידרוג'ל כדי למזער את ההשפעה הפוטנציאלית של אזורים סוערים. ראוי להזכיר כי מתח גזירה גבוה יותר, עד 15 דיין לסמ"ר, יושם באופן ניסיוני על ECs שנזרעו על הידרוג'לים 5 kPa ו 10 kPa ללא דליפה במכשיר (נתונים לא כלולים). עם זאת, הגברת לחץ הגזירה עלולה לגרום לניתוק תאים וכשל הידרוג'ל, תוך הדגשת הצורך באופטימיזציה זהירה של תנאי הניסוי.

כדי שתאי הזריעה ייצרו שכבה חד-שכבתית, חיוני להשתמש בצפיפות תאים גבוהה יותר מאשר בתרביות מסורתיות. צפיפות זריעה נמוכה הוכחה כמעכבת את היווצרות החד-שכבות על הידרוג'לים רכים^{יותר 8}. בנוסף, ציפוי מקדים של הידרוג'לים בג'לטין לפני זריעת תאים משפר את החיבור הראשוני של התאים ומתפשט על הידרוג'לים רכים יותר. עם זאת, חשוב לציין כי ההשפעה המיטיבה של ציפוי זה היא זמנית, שכן הוא בעיקר מקל על האינטראקציה הראשונית בין התאים לבין המצע.

איור 4 מדגים כיצד נוקשות ועקה של גזירה משפיעות על היווצרות סיבי אקטין (actin fibers). תחת לחץ גזירה נוצרו סיבי עקה עבים יותר, מה שמרמז על חיבור חזק יותר לפני השטח. בדגימות רכות יותר, היו יותר סיבי אקטין היקפיים, שהם אינדיקטורים לתנאים פיזיולוגיים. עם זאת, ב- ECs על מצעים קשיחים יותר, נוכחותם של סיבי לחץ חזקים יותר ופחות סיבים היקפיים עלולה להוביל לתפקוד לקוי של EC¹⁷. נתונים אלה מאשרים את האפקטיביות של המערכת המוצגת באפנון התנהגות EC.

איור 1: סקירה כללית של המחקר הנוכחי. (A) סינתזת GelMA. ג'לטין שונה כימית לג'לטין מתקרילט (GelMA) באמצעות תגובה בין ג'לטין לאנהידריד מתקרילי (MAH) בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס. לאחר מכן המוצר הוזרז באצטון והתייבש תחת ואקום. (B) ייצור הידרוג'ל. זכוכית הכיסוי הוכנה על ידי חיבור ספייסרים. לאחר מכן, הזכוכית ששונתה חוברה לזכוכית הכיסוי. זכוכית הכיסוי הונחה על התבנית, כאשר הספייסרים מספקים את המרווח הרצוי בין הזכוכית המעובדת לתחתית התבנית. תמיסת GelMA המכילה יוזמים נוספה לפתח שבין הזכוכית שעברה שינוי לבין התבנית, פילמור ליצירת הידרוג'ל הקשור באופן קוולנטי לזכוכית שעברה שינוי. (C) ניסוי זרימה. הידרוג'ל שהתקבל שימש זרע ECs. לאחר יצירת חד-שכבתיות, התאים עברו ניסוי זרימה של 6 שעות בלחץ גזירה של 12 דיין לסמ"ר. דמות זו נוצרה עם BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ספקטרום H-NMR 1 עבור קדם-פילמור של ג'לטין ו-GelMA. (A) עיין בתיבות מקווקו עבור פסגות רלוונטיות. פסגות מתקרילויל (כלומר, קבוצות ויניל ומתיל הופיעו לאחר השינוי הכימי של הג'לטין, בעוד שקבוצת הליזין שימשה לכימות מידת ההחלפה בעקבות התגובה הכימית¹⁸. (B) מודולוס ההידרוג'לים של יאנג נמדד בבדיקת דחיסה, ו-4% (w/v) הידרוג'לים GelMA נחשבו כמצעים פיזיולוגיים, ו-10% (w/v) נחשבו למצע פתולוגי (n=4, ממוצע ± SEM). נתון זה שונה^מ-8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תכנון תאי זרימה של לוחות מקבילים וסימולציה חישובית. (א) שלושה לוחות נפרדים שימשו לצמצום האפשרות לפגיעה בהידרוג'לים במהלך טעינה או פריקה; כאשר הלוח התחתון סיפק משטח גיבוי, המשטח האמצעי הציע תמיכה רוחבית להידרוג'לים, והלוח העליון ואטם יצרו את המרווח לזרימת הנוזל. (B) תא הזרימה עבר סימולציות חישוביות¹¹. כאשר קצב הזרימה הוא 215 מ"ל/דקה, לחץ הגזירה לאורך הקו המשורטט הוא כ-12 דיין/ס"מ^2, המייצג את לחץ הגזירה הפיזיולוגי. (ג) השפעת הפער של 0.5 מ"מ מוגבלת לשטח קטן הסמוך לפער. פני השטח הנותרים של ההידרוג'ל חווים לחץ גזירה אחיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: סטרס גזירה והידרוג'ל נוקשה מגבירים את היווצרות סיבי הסטרס. יותר סיבי אקטין היקפיים נוצרים ב- ECs על 5 דגימות kPa תחת זרימה. סיבי עקה חזקים יותר נוצרו כאשר התאים נחשפו ללחץ גזירה על הידרוג'לים של 10 kPa, מה שמראה את יעילות המודל על התנהגות EC. החצים מציינים אקטין היקפי, והכוכביות מציינות סיבים לחוצים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר (כחול: DAPI, אדום: סיבי אקטין ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מערכת כלי הדם היא סביבה דינמית שבה כוחות שונים משפיעים באופן משמעותי על ההתנהגות התאית. חקר אירועים ביולוגיים במחלות לב וכלי דם מבלי לקחת בחשבון כוחות אלה יהיה לא מדויק. לכן, מודלים תאיים המסוגלים לחקות את הסביבה המכנית של כלי הדם הם חיוניים. חוקרים כבר התקדמו משמעותית בהדגשת ההשפעה של כוחות אלה על ההתנהגות התאית¹¹. עם זאת, כדי להבין את התנהגות התא בתנאים פתולוגיים ופיזיולוגיים בגוף האדם, חיוני לפתח מודלים מדויקים יותר הדומים יותר לסביבה של כלי הדם. לכן, שאפנו לפתח מערכת שמשכפלת בצורה מדויקת יותר את סביבת כלי הדם תוך שמירה על נוחות גישה וידידותיות למשתמש.

המודל יכול להפעיל לחץ גזירה מבוקר שמקורו בזרימה על תאים אנושיים על מצעים בעלי רמות קשיחות משתנות, ולייצר תנאים קרובים יותר למציאות הפיזיולוגית בהשוואה למודלים קיימים. GelMA סונתז ונוצל במודל זה כדי לעמוד בקריטריונים הבאים: 1) תכונות מכניות מתכווננות, 2) התנהגות שאינה מתנפחת, 3) תאימות תאים והיצמדות, 4) היכולת של הטבעה של תאי כלי דם כדי למדל את כלי הדם בצורה מדויקת יותר. יכולת ההתאמה של תכונות מכניות הושגה על ידי שינוי ריכוז הביופולימר⁸ כדי לחקות תנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. הקריטריון השני היה התנהגות ללא נפיחות. חיוני שיהיה מצע שאינו מתנפח כדי לשמור על ממדי תאי זרימה עקביים, תנאי זרימה קשורים ולחץ גזירה על התאים. GelMA עם רמה גבוהה של מתקרילציה הדגימה תכונות שאינן מתנפחות, תוך שמירה על צורת ההידרוג'ל ועל חלקות פני השטח לאורך כל הניסוי⁸. חשוב לציין, הריכוז והנוקשות לא השפיעו על התנהגות הנפיחות, מה שפישט את המודל על ידי ביטול הצורך בהתאמות נפרדות לכל קבוצת ניסוי. הקריטריון השלישי היה היצמדות תאים, שכן חיבור נכון נחוץ כדי למנוע ניתוק תאים ולשמור על שלמות חד-שכבתית. GelMA סיפקה היצמדות תאים, ובכך הפחיתה את הצורך בצעדים נוספים להצמדת מולקולות דבק תאים למצע, דבר חיוני לביופולימרים רבים. יתר על כן, נלקחה בחשבון היכולת של GelMA לאנקפסולציה של תאים, אם כי היא לא נבדקה ישירות במחקר זה. פוטנציאל האנקפסולציה של התא כולל אינדיקציות לתמיכה בתרבית תאים תלת-ממדית ולשילוב שכבות תאים, כגון תאי שריר חלק וסקולרי או פריציטים, כדי לשפר את דיוק המודל¹⁹. בנוסף, הסינתזה של GelMA היא חסכונית ודורשת ציוד מינימלי, מה שהופך אותו למועמד מצוין כחומר ביולוגי לייצור מצע 20,21,22.

תא הזרימה המקבילי משמש בדרך כלל להפעלת לחץ גזירה על תאים, אך באופן מסורתי נעשה בו שימוש רק עם כיסויי זכוכית או חומרים קשיחים. עם זאת, חומרים כאלה חסרים רלוונטיות פיזיולוגית²³. לעומת זאת, התקנים מיקרופלואידים הציגו מורכבות גיאומטרית רבה יותר ומצעים רכים יותר על ידי שימוש בחומרים מבוססי פולימרים. עם זאת, התקנים אלה לעתים קרובות אינם יכולים לשלוט במשטר הזרימה באופן מדויק, והמדים הקטנים שלהם מגבילים את יכולתם לחקור רק מספר קטן של תאים, מה שמגביל את תוצאות הניסוי¹¹. המכשיר המוצע משלב את היתרונות של שתי המערכות על ידי שילוב הידרוג'ל זרעים חד-שכבתי של תאי אנדותל עם תא זרימה המפעיל לחץ גזירה מבוקר במדויק.

המכשיר הוכיח את היכולת לשלב הן כוחות מכניים שמקורם בזרימה והן כוחות מכניים שמקורם במוצק. כאשר מתח גזירה של 12 דיין / ס"מ² הוחל במשך 6 שעות, נצפתה היווצרות של סיבי לחץ ציטוסוליים, בניגוד לדומיננטיות של אקטין היקפי בקבוצת המצע הרך יותר. זה עולה בקנה אחד עם דיווחים רבים המראים פחות סיבי עקה שנוצרו כאשר ECs הם תרבית על משטחים רכים 24,25,26,27. מצד שני, זרימה למינרית עלולה לגרום להיווצרות סיבי מאמץ בולטים. הוכח כי תגובת השלד הציטו-שלד לתנאי הזרימה מתחילה תוך שעה מהחשיפה לזרימה, אך דורשת זמן ארוך יותר להפליא כדי להשלים ארגון מחדש 28,29,30. רשת האקטין ההיקפית חיונית לפונקציות EC שונות, כולל הידבקות תאים-תאים ופונקציונליות מחסום¹⁷. ויסות רשת זו בקבוצת ניסוי בריאה בהשוואה לקבוצה הפתולוגית בעלת סיבי הלחץ הנרחבים מאשר את המידול המוצלח של המכשיר למצבים בריאים וחולים.

חיסרון אחד של מכשיר זה הוא פוטנציאל הנזק להידרוג'לים, שעלול לשבש את הזרימה ולהפחית את אחוזי ההצלחה של הניסויים. בעיה זו נובעת בעיקר מפגמים ראשוניים בהידרוג'לים, אשר, תחת לחץ גזירה, עלולים להחמיר, מה שמוביל לניתוק הדגימה ולחסימת זרימה חלקית. לכן, שלבי הכנת הדגימה, כולל פילמור, שיווי משקל וחיתוך, צריכים להתבצע בזהירות כדי למנוע נזק נוסף לדגימות. אתגר נוסף במערכת זו הוא להשיג ולשמור על שלמות המונולייה. בעוד שציפוי ההידרוג'לים בג'לטין יכול לשפר את החיבור הראשוני של התא, עבודתנו הקודמת הראתה כי ציפוי זה אינו משפיע על התפשטות התאים⁸. לכן, כדי לשפר את היווצרות monolayer, במיוחד בהתחשב בכך התפשטות התא הוא איטי יותר על הידרוג'לים רכים³¹, הגדלת צפיפות הזריעה מועיל. בנוסף, התאים עשויים להתנתק עקב לחץ הגזירה המושרה על ידי זרימת נוזלים. לכן, חיוני להגביר בהדרגה את קצב הזרימה, ולאפשר לתאים מספיק זמן להסתגל לתנאי הסביבה החדשים.

לסיכום, המכשיר מהווה התקדמות משמעותית בהדמיית סביבת כלי הדם בצורה מדויקת יותר בשל יכולתו לדמות בו זמנית הן כוחות מכניים שמקורם בנוזל והן כוחות מכניים שמקורם במוצק. הוא מציע פלטפורמה מקיפה לחקר התנהגות EC בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. רב-תכליתיות זו הופכת אותו לכלי רב ערך לקידום הבנתנו את הביולוגיה של כלי הדם ואת התקדמות המחלה. מודל זה יכול לתרום למגוון מחקרים, כולל מכנוביולוגיה, טרשת עורקים, התפתחות גרורות סרטניות, הנדסת רקמות כלי דם ואנגיוגנזה, מתן תרופות והקרנה.

המחברים מצהירים כי הוגשה בקשת פטנט זמנית (מס' 63/634,853) תחת הכותרת Flow Chamber עם מצע מכני, וכי לא קיימים אינטרסים מתחרים אחרים.

המחברים מודים לרוברט איגן על עזרתו בייצור תא הזרימה. המחברים מודים ללוקאס מקולי על עזרתו במהלך הניסויים. בנוסף, הם רוצים להודות למתקני הליבה של המכון לדימות כימי של מערכות חיות (CILS) של אוניברסיטת נורת'איסטרן על מתן גישה למיקרוסקופים קונפוקליים. המחברים מכירים בתמיכת המימון הניתנת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH 1R01EB027705 הוענק ל- SB) והקרן הלאומית למדע (פרסי קריירה של NSF: DMR 1847843 ל- SB ו- CMMI 1846962 ל- EE).