整合基质刚度和流动性的体外模型以研究内皮细胞反应

我们合成并表征了一种可调节的基于明胶的底物，用于在相关血管流动条件下培养血管内皮细胞 （EC）。这种仿生表面复制了生理和病理条件，从而能够研究机械力对 EC 行为的影响，并促进我们对血管健康和疾病机制的理解。

我们提出了一种创新的 体外 模型，旨在研究组织刚度和剪切应力对内皮细胞 （EC） 功能的综合影响，这对于了解血管健康和动脉粥样硬化等疾病的发作至关重要。传统上，研究独立探讨了剪切应力和基材刚度对 EC 的影响。然而，这个集成系统结合了这些因素，以提供对脉管系统的机械环境的更精确模拟。目的是使用人类 EC 检查各种组织硬度水平和流动条件下的 EC 机械转导。我们详细介绍了合成具有可调刚度的甲基丙烯酸明胶 （GelMA） 水凝胶并用 EC 接种它们以实现汇合的方案。此外，我们还描述了经济高效的流动室的设计和组装，并辅以计算流体动力学模拟，以生成以层流和适当剪切应力水平为特征的生理流动条件。该方案还结合了用于共聚焦显微镜的荧光标记，能够评估 EC 对组织顺应性和流动条件的反应。通过让培养的 EC 接受多种综合机械刺激，该模型能够全面研究高血压和衰老等因素如何影响 EC 功能和 EC 介导的血管疾病。从这些研究中获得的见解将有助于阐明血管疾病的潜在机制和制定有效的治疗策略。

内皮细胞位于血管内表面，在维持血管健康方面起着关键作用。内皮细胞 （EC） 是调节各种心血管功能的核心，包括血管张力控制、选择性通透性、止血和机械转导 ^1,2。研究已将 EC 功能障碍与动脉粥样硬化发展的主要作用紧密联系起来。值得注意的是，内皮细胞在与血流和底层血管组织相互作用的界面处遇到不同的机械力 ^3,4。几项研究将 EC 功能障碍与血管环境中机械因素的异常变化联系起来，例如血流产生的流体剪切应力和组织僵化 ^5,6,7。

然而，在理解组织硬度和剪切应力对 EC 功能的综合影响方面，先前的研究受到的关注有限。为了提高将研究成果转化为动脉粥样硬化和其他心血管疾病有效治疗的能力，必须改进该领域使用的细胞模型。通过使用人类 EC 并使其承受剪切应力或具有不同刚度水平的基材，在使细胞模型人性化方面取得了重大进展 ^8,9,10。然而，将动态流动环境与具有可调节刚度特性的 EC 基材集成的蜂窝模型的采用和改进进展缓慢。挑战在于设计不溶胀的 EC 底物，以防止流道内流动参数的变化，同时促进完整和粘附良好的 EC 单层的培养。能够克服这些障碍的体外模型可以促进更有效地研究高血压、衰老和血流条件如何协同影响 EC 机械转导、血管健康，并最终影响动脉粥样硬化的发展。已经开发了各种方法，可以在控制基材刚度的同时对细胞施加剪切应力，包括旋转板和微流体装置。在旋转板法中，将单元放置在两个板之间，并通过板的旋转运动施加剪切应力。此方法不太复杂，并且提供了一个快速的模型;然而，它受到空间剪切应力变化的影响，中心剪切应力为零，外围剪切应力最大¹¹。

另一方面，微流体器件代表了新一代工具，能够控制基板刚度和流动条件。这些系统适用于模拟层流条件下的微血管系统。然而，用这种设备研究动脉粥样硬化是不切实际的，因为动脉粥样硬化发生在血流受阻的大血管中¹¹。本文旨在通过提出一种经济高效的系统来为 EC 研究的关键研究领域做出贡献，该系统能够检查不同流动条件下 EC 基材中不同刚度水平的影响。该系统整合了具有不同刚度的基质，以模拟病理和生理血管。该协议概述了创建无膨胀和刚度水平为 5 kPa 和 10 kPa 的明胶基水凝胶的方法，分别代表生理和病理刚度。此外，还详细介绍了能够集成这些基材的平行板流动室的结构。采用计算流体动力学 （CFD） 来评估剪切应力和流动条件。描述了用于 EC 培养的水凝胶的制备和 6 小时流动实验的执行，然后讨论了实验后免疫染色。

1. GelMA 的合成

1. 制备 0.2 M 无水碳酸钠溶液和 0.2 M 碳酸氢钠溶液。
2. 将 46 mL 碳酸氢钠溶液与 15 mL 碳酸钠溶液混合，并加入 139 mL 去离子 （DI） 水。如有必要，使用 0.1 M NaOH 和 HCl 将 pH 值调节至 9.5。
3. 将 10 g A 型 300 开花明胶从猪皮中加入到 100 mL 浓度为 10% w/v 的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中。
4. 使用 55 °C 水浴溶解明胶，同时使用磁力搅拌器以 700 rpm 搅拌溶液。完全溶解后，使用 0.1 M NaOH 将明胶溶液的 pH 值调节至 9.5。
5. 要启动甲基丙烯酸化，请向溶液中滴加 938 μL 甲基丙烯酸酐 （MAH）。通过将 MAH 注射到不同的位置（包括不同的深度和距中心的径向距离）来改善明胶溶液中 MAH 的初始分布。
6. 用铝箔包裹反应容器以防止暴露在光线下。将温度保持在 55 °C，并以 500 rpm 搅拌溶液 1 小时以完成反应（图 1A）¹²。
   注：反应在 pH 值低于 7.4 时停止。
7. 准备一个装有 1.8 L 丙酮的 2 L 烧杯和一个装有 0.3 L 丙酮的 0.6 L 烧杯。
8. 将所得 GelMA 溶液滴加到 2 L 烧杯中，同时以 200 RPM 搅拌以诱导沉淀¹³。为了最大限度地收集沉淀产物，将不锈钢棒或刮刀作为成核部位，以便于转移。
9. 将产品从较大的烧杯转移到较小的烧杯中，静置 10 分钟，然后进行干燥步骤。沉淀的 GelMA 应显示为白色纤维。
10. 将产品收集在吸水纸上，在室温 （RT） 的真空烘箱中干燥，并储存在 -20 °C 直至进一步使用。
    注：有关通过质子核磁共振 （¹H NMR） 对产品进行化学表征的更多详细信息，请参阅先前发表的工作⁸。

2. 玻璃盐化

注：将水凝胶连接到载玻片上可提供平坦均匀的表面，便于处理并确保在流动衍生剪切应力下的稳定性。用 3-（三甲氧基甲硅烷基）甲基丙烯酸丙酯对玻璃进行功能化对于增强表面性能并在聚合过程中实现水凝胶的共价连接是必要的。

1. 使用玻璃切割机将普通显微镜载玻片（1 mm 厚）精确切割成与最终水凝胶尺寸相似的碎片。用肥皂清洗切割好的载玻片，以去除可能阻碍玻璃表面处理的表面污染物和碎屑。
   注：如有必要，在乙醇中对载玻片超声处理 5 分钟，然后风干。
2. 在无水乙醇中制备 0.5% 的 3-（三甲氧基甲硅烷基）甲基丙烯酸丙酯溶液。在 DI 水中制备 10% 冰醋酸溶液。混合溶液以达到 3% 冰醋酸的最终浓度。
   注意：冰醋酸溶液可以大量制备并储存。
3. 将载玻片整理在玻璃容器中，以确保玻璃表面不受阻碍。将所得溶液倒在载玻片上，并在摇杆上以 80 rpm 的速度保持约 5 分钟以完成反应。通过去除任何残留的气泡，确保对载玻片的两侧进行改性。
4. 反应完成后，吸出溶液并用乙醇洗涤载玻片 2 次。风干载玻片并在室温下避光储存。
   注意：在这些条件下，载玻片将其修饰保留 1 个月。

3. 水凝胶制备

1. 使用氧化还原诱导的自由基聚合法制备水凝胶。
   1. 组装具有适当深度和 10 mm² 开口窗口的两件式聚四氟乙烯 （PTFE） 模具，以塑造最终基材。在设计过程中，水凝胶在聚合后的高度收缩了 25%。确保模具平整，并紧固在底板和顶板上，以防止泄漏。
      注意：设计的模具尺寸故意比预期的水凝胶尺寸大 10%。这种设计有多种用途：它可以防止模具分离时损坏侧面，通过将杂质或气泡推到侧面来提高水凝胶的表面均匀度，并补偿由于脱水收缩效应而导致的平衡后预期的 25% 收缩，其中高度交联的水凝胶在平衡后排斥水，导致收缩。收缩量在协议⁸ 中指定。
   2. 为确保水凝胶具有均匀的表面和恒定的高度，将改性的载玻片悬挂在模具的顶板上，留出一个狭窄的开口用于注射聚合物溶液。使用盖玻片悬浮改性的载玻片（图 1B）。
   3. 要制作盖板玻璃，请切割比模具大 20% 的普通微观玻璃。将两个垫片连接到较短的一侧。按如下方式计算垫片厚度：
      垫片厚度 = 1.33 x 最终凝胶厚度 + 1（改性玻璃的厚度）- 模具深度
   4. 在盖玻片的较长侧面上涂上一层薄薄的与电池兼容的密封脂，位于垫片连接的同一面上。
   5. 将改性的载玻片连接到两个垫片之间的盖玻片上。
   6. 将盖玻片放在模具上，使垫片位于模具上，并且改性后的玻璃延伸到模具中。这种设置在改性玻璃和模具底部之间提供了最终水凝胶高度的 1.33 个间隙。
   7. 将 GelMA 分别溶解在 4% 和 10% w/v 的去离子水中，用于 5 kPa 和 10 kPa 水凝胶，并将其置于 45 °C 水浴中。
      注：GelMA 是一种热敏聚合物，将溶液温度保持在 45 °C 可防止聚合前凝固并降低溶液粘度，这对于制造扁平水凝胶至关重要。
   8. 将 TEMED（5 kPA 水凝胶为 24 mM，10 kPa 水凝胶为 6.25 mM）添加到聚合物溶液中并充分混合。
      注意：单独的 TEMED 不会引发聚合，因此请确保在继续之前准备好模具、移液器和溶液。
   9. 将 APS（5 kPA 水凝胶为 24 mM，10 kPa 水凝胶为 24.5 mM）添加到 GelMA 溶液中并充分混合。
      注意：添加 APS 会引发聚合，水凝胶可能会迅速形成，需要立即采取行动以防止水凝胶有缺陷。有关刚度测量的更多详细信息，请参阅以前发表的著作⁸。
   10. 在 RT 上小心地将所得溶液移液到悬浮的载玻片和模具之间的开口处，并使其交联。毛细管力将聚合物溶液驱动到模具中。避免在凝胶中添加气泡，并在移液器吸头中残留少量溶液时停止移液。
       注：在聚合过程中，GelMA 的甲基丙烯酸酯基团与改性载玻片上的甲基丙烯酸酯残基反应，导致水凝胶化学附着在玻璃上。
   11. 15 分钟后，反应完成。使用针等尖锐物体将基板从模具上拆下，然后将基板从盖玻片上滑开以将其分离。
   12. 将水凝胶转移到用塑料薄膜密封的 100 mm 培养皿中的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，并在 37 °C 下平衡以去除剩余的反应物和副产物。
   13. 由于水凝胶略大于最终尺寸，因此修剪侧面多余的凝胶以匹配流动室窗口所需的尺寸。
   14. 使用流动室验证水凝胶尺寸。确保水凝胶正确安装在流动室中，水凝胶和模具之间没有间隙，也没有任何可能影响流型的缺陷。如果存在可能影响流动室中流型的形状不规则性，从而导致不良的细胞行为，请保存水凝胶以用于静态条件。
   15. 将四颗水凝胶转移到含有 1x PBS 的培养皿中进行灭菌。
2. 如下所述使用 70% 乙醇对水凝胶进行消毒。
   1. 准备 25%、50% 和 70% 的酒精溶液，用于水凝胶逐渐脱水。
      注意：如果不进行逐渐脱水，较硬的水凝胶可能会收缩和破裂，而较软的水凝胶表面可能会形成皱纹。
   2. 从含有水凝胶的培养皿中吸出 1x PBS 溶液。向每个培养皿中加入 25% 乙醇溶液，将 5 kPa 和 10 kPa 水凝胶浸没 15 分钟。
   3. 吸出 25% 酒精溶液。向每个培养皿中加入 50% 酒精溶液，将 5 kPa 和 10 kPa 水凝胶浸入水中 15 分钟。
   4. 吸出 50% 酒精溶液。向每个培养皿中加入 70% 酒精溶液，将 5 kPa 和 10 kPa 水凝胶浸入水中 5 分钟。将培养皿以 100 rpm 的速度放在摇床上。
   5. 将 5 kPa 水凝胶浸没 40 分钟，将 10 kPa 水凝胶浸没 20 分钟。
      注：观察到 5 kPa 水凝胶比 10 kPa 水凝胶更容易受到污染。
   6. 将样品转移到生物安全柜中的 6 孔板中，并使用无菌 PBS 洗涤水凝胶 2 次-3 次。

4. 涂覆水凝胶

1. 通过将 3 mg 明胶溶解在 50 mL 无菌 PBS（1x 镁和钙盐）中来制备 60 μg/mL 明胶溶液。在 37 °C 的水浴中加热溶液 30 分钟或直到所有明胶完全溶解。
2. 使用 0.2 μm 注射器过滤器对涂层溶液进行无菌过滤。从每个孔板中吸出 1x PBS 溶液，并向每个孔中加入明胶溶液，确保完全覆盖每个水凝胶。为了最大限度地降低污染风险，向包被溶液中加入 40 单位/mL 的青霉素和 10 μg/mL 的链霉素。
3. 将每个孔板在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 45 分钟。用 1x PBS 溶液洗涤水凝胶。
4. 吸出 PBS 并添加细胞培养基。
5. 将水凝胶保存在细胞培养基中不超过两天，并在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育直至细胞接种。
   注意：尽管纤连蛋白具有出色的细胞附着特性，但由于 EC 在动脉粥样硬化条件下沉积内源性纤连蛋白，这可能导致促炎反应，因此对其使用存在担忧。为避免化学刺激的细胞反应，我们避免使用纤连蛋白。此外，Orr 等人证明，与胶原蛋白 I 涂层相比，纤连蛋白涂层上调了动脉粥样硬化基因。具体来说，他们观察到细胞间粘附分子 1 （ICAM-1） 、血管细胞粘附分子 1 （VCAM-1） 和核因子-κB （NF-κB） 的表达水平增加¹⁴。

5. 在底物上接种细胞

1. 按照可用的分离方案制备细胞悬液，并使用血细胞计数器⁸ 对细胞进行计数。
2. 从水凝胶中彻底吸出培养基。向每个样品中加入 50,000 个细胞/cm2。向每个样品中加入适当体积的细胞悬液，以防止细胞溢出。
   注意：较硬的基材更疏水性;因此，最大限度地减少步骤之间的时间，以提高基底表面的润湿性和细胞悬浮液分散。
3. 将细胞接种的水凝胶在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 2 小时。一旦细胞附着到凝胶上，就向样品中添加细胞培养基。

6. 流动室制造

注意：设计流通室的方法具有成本效益，并且需要最少的制造和使用专业知识。

1. 使用聚甲基丙烯酸甲酯进行腔室制造，以直观地评估流动质量、剪切应力下的水凝胶完整性，以及流动实验期间潜在的实时生物标志物研究。腔室设计是使用计算机辅助设计 （CAD） 软件创建的。流动室已申请专利，有关该装置的详细信息不能在本方案中披露。
2. 流动室中流动条件的计算评估
   1. 组装设计的流通室的各个组件 （.SLDPRT 文件）创建最终的 Chamber 设置。
   2. 沿与水凝胶表面相切的流动中心线画一条线，以分析剪切应力。关闭入口和出口开口以定义闭合的控制体积。
   3. 从 CAD 软件的 Add-Ins 选项卡中打开 Flow Simulation。在 Flow Simulation 选项卡中，打开 Wizard 功能以输入属性。指定单位制并将压力和应力单位调整为 dyne/cm²。
   4. 检查 Physical 特征中的 Fluid Flow 和 Gravity 。在 Z 分量中将重力设置为 -9.8;X 和 Y 分量应为零。
   5. 在 Geometry Handling 中为分析类型选择 Internal 。选择 Water （水 ） 作为默认流体。
      注意：假设介质的行为与水类似。
   6. 选择 Laminar （层流） 和 Turbulent （湍流 ） 作为流类型。将壁定义为绝热壁，并在 Wall Condition 中输入表面粗糙度。
   7. 在初始条件下，将温度设置为 37.5 °C （310.65 K）。在 Flow Simulation 项目中定义计算域，确保它涵盖整个控制体积。
   8. 选择与流体接口的所有壁以定义流体子域。在边界条件中，将入口盖的内表面指定为入口体积流量，并指定流速 （Q） 和均匀流量。然后，将出口盖密封的内表面指定为静压。
   9. 根据可用的计算资源确定 Global Mesh Size。点击 Run 启动模拟。
   10. 完成后，查看所需的结果，包括剪切应力图解和流动模拟。
   11. 以不同的流速重复步骤 6.2.8 到 6.2.10，以计算不同速率下施加的剪应力。使用回归分析建立流速-剪切应力关系。
   12. 评估系统对水凝胶尺寸变化的容忍度，以增强模拟的真实感。

7. 运行均匀的层流

1. 在 5 kPa 和 10 kPa 水凝胶上培养细胞后，确保细胞单层在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中汇合。应在每个水凝胶上实现单层细胞。
2. 用 30 分钟的重力高压灭菌器循环对平行板流通室系统的可高压灭菌组件（不锈钢螺钉、抹刀、镊子、垫圈和培养基储液器）进行消毒。用紫外线照射对其他部件（丙烯酸组件和储液罐密封剂/阻尼器）进行消毒。
3. 将流通室装置组装在生物安全柜中。将水凝胶样品固定在设备中，确保均匀性。如果可用于流动的样品数量不足，请使用与水凝胶相同大小的填料。
4. 预润湿腔室内表面和水凝胶表面，以最大限度地减少气泡形成并防止组装过程中细胞干燥。
5. 向入口储液槽中添加足够的介质，使 20%-30% 的介质在组装时流向出口储液槽。使用阻尼器/密封器密封入口储液罐。
   注意：入口储液罐中的压力积聚会驱动流量，任何空气泄漏都会改变流速。如果外管中形成气泡，请检查密封剂是否有缺陷。
6. 将出口风门设置为大气压，以建立压差。将设备和储液槽置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中。将设备管连接到放置在培养箱外部的蠕动泵（图 1C）。
7. 打开泵开始施加 3.6 dyne/cm²。以 2 mL/min 的增量逐渐增加流速（例如，10 分钟后从 65 mL/min 增加到 85 mL/min），直到施加大约 8 dyne/cm²。
8. 以 2.5 mL/min 的增量进一步增加流速，直到达到 12 dyne/cm² 的剪切应力。
   注：让细胞有时间适应动态条件，因为快速增加的流速可能会使细胞分离并损坏单层。
9. 6 小时后，停止流动，从培养箱中取出设备，然后拆卸流动室。随后，将水凝胶样品转移到六孔板中。
10. 用冰冷的 PBS 洗涤样品，固定细胞进行免疫染色或裂解细胞进行蛋白质分离。

8. 用于高放大倍率共聚焦显微镜的免疫染色设置

注：为了提高研究效率，开发了一种对小部分水凝胶进行免疫染色的方法，能够检查单个样品中的多个生物靶标。

1. 准备直径为 3 或 4 mm 的活检打孔器或首选切割工具。
2. 使用移液器吸头盒作为染色室。在移液器吸头盒底部放置湿纸巾，加湿腔室以控制长时间孵育期间染色液的蒸发。
3. 通过为单个样品创建小型溶液池来减少抗体消耗。用透明薄膜盖住吸头盒盒架，用指尖轻轻将薄膜压在吸头盒孔上，以形成凹痕。用 70 μL 的 PBS 填充酒窝。
4. 将单个水凝胶转移到空培养皿中，并使用活检打孔器或首选切割工具进行切割。使用显微镜切割具有代表性的样品区域。切下完整的凝胶圆柱体以避免共聚焦显微镜问题。
5. 将切割的水凝胶样品放入步骤 8.3 中创建的凹坑中。按照标准方案¹⁵ 进行染色。最后一次染色洗涤后，获得与水凝胶厚度相匹配的硅橡胶片。
   注意：最好使用具有一个粘性面的板材，以改善密封性。在这项研究中，使用与 Phalloidin 偶联的荧光二抗以 1：20 的稀释度对肌动蛋白纤维进行染色。
6. 将橡胶板切成 15 毫米 x 15 毫米的正方形。使用活检打孔器或首选切割工具打一个 6 mm 的孔。
7. 通过将橡胶连接到显微镜盖玻片（编号 1.5）上来创建样品容器。在样品仍然存在的情况下，向凹坑中加入 10 μL 湿封固剂，并在黑暗中孵育 10-15 分钟。
   注：在本研究中，封固剂含有 0.9 μg/mL 的 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI），以缩短染色方案。
8. 从染色室中取出样品，并将其放入步骤 8.7 中创建的容器中。在样品顶部涂抹 1-2 μL 封固剂。
   注意：封固介质的数量会影响高放大倍率下的图像质量。过多或不足的封固剂会影响图像清晰度。
9. 将另一个盖玻片放在顶部并轻轻按压以确保样品接触玻璃。将样品在 4 °C 下避光储存，直到显微镜成像。

图 1 描述了实验装置，概述了通过甲基丙烯酸化反应合成 GelMA 的过程。然后使用所得产品制造水凝胶底物，将 EC 接种到该底物上。随后，将细胞引入流动室中，以 12 dyne/cm² 进行 6 h 的流动实验。

¹H NMR 波谱用于评估甲基丙烯酸化反应的成功（图 2A）。GelMA 中存在 1.9 ppm 的甲基和 5.4-5.6 ppm 之间的乙烯基峰，证实了甲基丙烯酸化成功。此外，GelMA 中赖氨酸峰在 3 ppm 处的降低表明赖氨酸残基的消耗，赖氨酸残基被甲基丙烯酸酯残基 12,13,16 取代。使用压缩测试评估 GelMA 水凝胶的刚度，结果表明压缩模量随着 GelMA 浓度的增加而增加（图 2B）。由 4% 和 8% （w/v） GelMA 组成的水凝胶分别用于模拟生理 （5 kPa） 和病理 （10 kPa） 基质刚度⁸。

流通室采用抗紫外线丙烯酸聚合物，设计经济高效且易于消毒。其透明度有助于在实验过程中实时监测水凝胶和流动条件。腔室设计有三个不同的层，可最大限度地降低加载或卸载过程中水凝胶损坏的风险：底板提供坚固的底座，中间层为水凝胶提供横向支撑，顶板沿垫圈形成流体流动所需的间隙 （图 3A）。使用 CFD 进行计算模拟，以评估腔室内的流动条件和剪切应力。以下公式 - 剪切应力 = 0.0558 x 流速 - 根据作为输入的流速计算了施加到单元上的剪切应力 （图 3B）。值得注意的是，材料属性（例如刚度）的变化不会改变仿真中的剪切应力。为了计算最终实验设置中水凝胶尺寸的差异，在计算模型中有意将水凝胶的尺寸略小。在水凝胶的一侧和腔室的中间板壁之间形成一个 0.5 mm 的间隙，垂直于流动方向。这种配置允许分析这些间隙中的剪切应力效应。虽然在间隙位置观察到剪切应力不规则 （图 3B），但它们的影响仅限于与间隙相邻的小区域，其余的水凝胶表面受到均匀的剪切应力 （图 3C）。这些见解建议丢弃水凝胶边缘的细胞，以最大限度地减少湍流区域的潜在影响。值得一提的是，实验将更高的剪切应力（高达 15 dyne/cm²）施加到接种在 5 kPa 和 10 kPa 水凝胶上的 EC 上，且装置中没有泄漏（不包括数据）。然而，进一步增加剪切应力可能会导致细胞分离和水凝胶失效，这强调了仔细优化实验条件的必要性。

为了使细胞接种形成单层，使用比传统培养物更高的细胞密度至关重要。低晶种密度已被证明会阻碍较软水凝胶上的单层形成⁸。此外，在细胞接种前用明胶预涂水凝胶可增强初始细胞附着和在较软水凝胶上的铺展。然而，重要的是要注意这种涂层的有益效果是暂时的，因为它主要促进细胞和底物之间的初始相互作用。

图 4 显示了刚度和剪切应力如何影响肌动蛋白纤维的形成。在剪切应力下，形成较厚的应力纤维，表明与表面的附着力更强。在较软的样本中，有更多的外周肌动蛋白纤维，这是生理状况的指标。然而，在较硬基材上的 EC 中，更强应力纤维和较少外周纤维的存在可能导致 EC 功能障碍¹⁷。该数据证实了所提出的系统在调节 EC 行为方面的有效性。

图 1：当前研究概述。 （A） GelMA 合成。通过明胶和甲基丙烯酸酐 （MAH） 在 55 °C 下的反应，将明胶化学改性为甲基丙烯酸明胶 （GelMA）。 然后将产物沉淀在丙酮中并在真空下干燥。（B） 水凝胶制造。盖玻片是通过安装垫片来制备的。然后，将改性后的玻璃贴在盖玻片上。将盖玻片放置在模具上，垫片在改性玻璃和模具底部之间提供所需的间隙。将含有引发剂的 GelMA 溶液添加到改性玻璃和模具之间的开口中，聚合形成与改性玻璃共价结合的水凝胶。（C） 流动实验。所得水凝胶用于接种 EC。形成单层后，细胞在 12 dyne/cm² 的剪切应力下进行 6 h 流动实验。这个数字是用 BioRender.com 创建的。请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：明胶和 GelMA 预聚合的 1 个 H-NMR 谱图。 （A） 请参阅相关峰的虚线框。甲基丙烯酰基峰（即乙烯基和甲基）出现在明胶的化学修饰后，而赖氨酸基团用于量化化学反应后的取代程度¹⁸。（B） 通过压缩试验测量水凝胶的杨氏模量，4% （w/v） GelMA 水凝胶被视为生理底物，10% （w/v） 被视为病理底物 （n=4，平均 ± SEM）。此数字已从⁸ 修改。请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：平行板流动室设计和计算模拟。 （A） 使用了三个独立的板来减少在加载或卸载过程中损坏水凝胶的可能性;其中底板提供背衬表面，中间表面为水凝胶提供横向支撑，顶板和垫圈形成流体流动的间隙。 （B） 流动室进行了计算模拟¹¹.当流速为 215 mL/min 时，沿画线的剪切应力约为 12 dyne/cm^2， 代表生理剪切应力。（C） 0.5 mm 间隙的影响仅限于与间隙相邻的小区域。水凝胶的其余表面承受均匀的剪切应力。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：剪切应力和坚硬的水凝胶会增加应力纤维的形成。 在流下 5 kPa 样品的 EC 中形成更多的外周肌动蛋白纤维。当细胞暴露于 10 kPa 水凝胶上的剪切应力时，会形成更强的应力纤维，展示了该模型对 EC 行为的有效性。箭头表示外周肌动蛋白，星号表示应力纤维。比例尺 = 10 μm（蓝色：DAPI，红色：肌动蛋白纤维）。请单击此处查看此图的较大版本。

血管系统是一个动态环境，其中各种力会显着影响细胞行为。在不考虑这些力的情况下研究心血管疾病中的生物事件是不准确的。因此，能够模拟血管机械环境的细胞模型至关重要。研究人员在强调这些力量对细胞行为的影响方面已经取得了重大进展¹¹。然而，要了解人体病理和生理条件下的细胞行为，必须开发更接近血管环境的更精确模型。因此，我们的目标是开发一种系统，该系统可以更准确地复制血管环境，同时保持易用性和用户友好性。

该模型可以将受控流动衍生的剪切应力应用于具有不同刚度水平的基材上的人体细胞，与现有模型相比，产生更接近生理现实的条件。在该模型中合成和利用 GelMA 以满足以下标准：1） 可调的机械性能，2） 非溶胀行为，3） 细胞相容性和粘附性，以及 4） 包埋血管细胞的能力，以更准确地模拟血管。机械性能的可调节性是通过改变生物聚合物浓度⁸ 来模拟生理和病理条件来实现的。第二个标准是非膨胀行为。拥有不溶胀的基质对于保持一致的流动室尺寸、相关流动条件和细胞上的剪切应力至关重要。具有高度甲基丙烯酸化的 GelMA 表现出不溶胀特性，在整个实验过程中保持了水凝胶的形状和表面光滑度⁸。重要的是，浓度和刚度不会影响膨胀行为，这简化了模型，无需为每个实验组单独调整。第三个标准是细胞粘附，因为正确的粘附对于防止细胞分离和保持单层完整性是必要的。GelMA 提供了细胞粘附，从而减少了将细胞粘附分子偶联到基材上的额外步骤的需要，这对于许多生物聚合物来说是必不可少的。此外，考虑了 GelMA 的细胞封装能力，尽管在本研究中没有直接测试它。细胞包封电位具有支持 3D 细胞培养和整合细胞层（如血管平滑肌细胞或周细胞）的指示，以提高模型的准确性¹⁹。此外，GelMA 的合成具有成本效益，并且需要最少的设备，使其成为作为基材制造生物材料的绝佳候选者 20,21,22。

平行板流通室通常用于对细胞施加剪切应力，但传统上仅用于玻璃盖玻片或刚性材料。然而，这些材料缺乏生理相关性²³。相比之下，微流体器件通过利用聚合物基材料引入了更多的几何复杂性和更柔软的基材。然而，这些设备通常无法准确控制流态，并且它们的小尺寸限制了它们仅研究少量细胞的能力，从而限制了实验结果¹¹。拟议的设备通过将内皮细胞单层种子水凝胶与施加精确控制的剪切应力的流动室相结合，结合了两种系统的优点。

该设备已经展示了整合流动衍生和固体衍生机械力的能力。当施加 12 dyne/cm² 的剪切应力 6 h 时，观察到胞质应力纤维的形成，这与较软底物组中外周肌动蛋白的优势形成鲜明对比。这与许多报告一致，这些报告显示，当 EC 在较软的表面上培养时，形成的应力纤维较少 24,25,26,27。另一方面，层流可能导致明显的应力纤维形成。已经表明，细胞骨架对流动条件的反应在暴露于流动后 1 小时内开始，但需要非常长的时间才能完成重组 28,29,30。外周肌动蛋白网络对于各种 EC 功能至关重要，包括细胞间粘附和屏障功能¹⁷。与具有广泛应力纤维的病理组相比，在健康实验组中上调该网络认可了该设备对健康和疾病状况的成功建模。

该设备的一个缺点是可能会损坏水凝胶，这可能会破坏流动并降低实验的成功率。这个问题主要是由水凝胶的初始缺陷引起的，在剪切应力下，这些缺陷可能会恶化，导致样品脱落和部分流动阻塞。因此，应仔细进行样品制备步骤，包括聚合、平衡和切割，以防止对样品造成任何额外损坏。该系统的另一个挑战是实现和保持单层的完整性。虽然用明胶包被水凝胶可以改善初始细胞附着，但我们之前的工作表明这种涂层不会影响细胞增殖⁸。因此，为了增强单层形成，特别是考虑到细胞增殖在较软的水凝胶上较慢³¹，增加接种密度是有益的。此外，由于流体流动引起的剪切应力，细胞可能会脱落。因此，逐渐增加流速至关重要，让细胞有足够的时间适应新的环境条件。

总之，该设备代表了更准确地模拟血管环境的重大进步，因为它能够同时模拟流体衍生和固体衍生的机械力。它为研究各种生理和病理条件下的 EC 行为提供了一个全面的平台。这种多功能性使其成为推进我们对血管生物学和疾病进展的理解的宝贵工具。该模型有助于各种研究，包括机械生物学、动脉粥样硬化、癌症转移发展、血管组织工程和血管生成以及药物递送和筛选。

作者声明，已提交临时专利申请（第 63/634,853 号），标题为具有机械可调基板的流动室，并且不存在其他竞争利益。

作者感谢 Robert Egan 在制造流动室方面的帮助。作者感谢 Lucas McCauley 在实验期间的帮助。此外，他们要感谢东北大学生命系统化学成像研究所 （CILS） 的核心设施授予共聚焦显微镜的使用权。作者感谢美国国立卫生研究院（NIH 1R01EB027705 授予 SB）和美国国家科学基金会（NSF CAREER Awards：DMR 1847843 SB 和 CMMI 1846962 EE）提供的资金支持。