内皮細胞応答を研究するための基質の剛性と流れを統合するin vitroモデル

私たちは、関連する血管流条件下で血管内皮細胞(EC)を培養するための調整可能なゼラチンベースの基質を合成し、特徴付けました。この生体模倣表面は、生理学的条件と病理学的条件の両方を再現し、ECの挙動に対する機械的な力の研究を可能にし、血管の健康と疾患のメカニズムの理解を深めます。

私たちは、血管の健康やアテローム性動脈硬化症などの疾患の発症を理解するために重要な、組織の硬直性とせん断応力が内皮細胞(EC)機能に及ぼす複合的な影響を調査することを目的とした革新的な in vitro モデルを提示します。従来、研究では、せん断応力と基板剛性がECに与える影響を独立して調査してきました。しかし、この統合システムは、これらの要素を組み合わせて、血管系の機械的環境をより正確にシミュレーションすることができます。目的は、ヒトECを使用して、さまざまな組織剛性レベルと流動条件にわたるECメカノトランスダクションを調べることです。ゼラチンメタクリレート(GelMA)ハイドロゲルを調整可能な剛性で合成し、ECを播種してコンフルエンシーを達成するためのプロトコルについて詳しく説明します。さらに、層流と適切なせん断応力レベルによって特徴付けられる生理学的流れ条件を生成するために、計算流体力学シミュレーションによって補完された、費用対効果の高いフローチャンバーの設計と組み立てについて説明します。このプロトコールには、共焦点顕微鏡用の蛍光標識も組み込まれており、組織のコンプライアンスと流動条件の両方に対するECの反応の評価を可能にします。このモデルは、培養したECに複数の統合された機械的刺激を与えることにより、高血圧や老化などの要因がEC機能やEC介在性血管疾患にどのように影響するかを包括的に調べることができます。これらの研究から得られた知見は、血管疾患の根底にあるメカニズムの解明や効果的な治療戦略の開発に役立ちます。

血管の内面を覆う内皮は、血管の健康を維持する上で極めて重要な役割を果たしています。内皮細胞(EC)は、血管の緊張制御、選択的透過性、止血、メカノトランス^{ダクションなど}、さまざまな心血管機能の調節の中心です^1,2。研究は、EC機能障害をアテローム性動脈硬化症の発症における主要な役割にしっかりと関連付けています。特に、ECは、血流およびその下にある血管組織と相互作用する界面で多様な機械的力に遭遇する^3,4。いくつかの研究は、ECの機能障害を血管環境内の機械的要因の異常な変化と関連付けています。たとえば、血流による流体せん断応力や組織の硬直^性5,6,7。

しかし、これまでの研究では、組織の剛性とせん断応力がEC機能に及ぼす複合的な影響を理解するために、あまり注目されていませんでした。研究成果をアテローム性動脈硬化症やその他の心血管疾患の効果的な治療法に変換する能力を高めるためには、この分野で使用される細胞モデルを改善することが不可欠です。ヒトECを使用し、それらをせん断応力またはさまざまな^{剛性レベルの基}質にさらすことにより、細胞モデルのヒト化において大きな進歩が見られました^8,9,10。しかし、動的な流動環境と調整可能な剛性特性を持つEC基板を統合したセルラーモデルの採用と改良は、徐々に進んでいます。課題は、流路内のフローパラメータの変化を防ぎながら、無傷で密着性のあるEC単分子膜の培養を容易にするために、膨潤しないEC基質を考案することにあります。これらの障害を克服できるin vitroモデルは、高血圧、老化、および血流状態がECメカノトランスダクション、血管の健康、そして最終的にはアテローム性動脈硬化症の発症にどのように共同で影響するかについてのより効果的な研究を促進する可能性があります。基板の剛性を制御しながら細胞にせん断応力を加えるために、回転プレートやマイクロ流体デバイスなど、さまざまな方法が開発されています。回転プレート法では、2枚のプレートの間にセルを配置し、プレートの回転運動によってせん断応力が加えられます。この方法はそれほど複雑ではなく、迅速なモデルを提供します。ただし、空間的なせん断応力の変動に悩まされ、中心でせん断応力がゼロ、周辺¹¹ で最大せん断応力が大きくなります。

一方、マイクロ流体デバイスは、基板の剛性と流動条件を制御する能力を備えた新世代のツールを表しています。これらのシステムは、層流条件下での微小血管系の模倣に適しています。しかし、このような装置を用いてアテローム性動脈硬化症を研究することは、アテローム性動脈硬化症が流れが乱れた大きな血管で起こるため、非現実的である¹¹。この論文は、さまざまな流動条件下でEC基板のさまざまな剛性レベルの影響を調べることができる費用対効果の高いシステムを提示することにより、EC研究の重要な研究領域に貢献することを目的としています。このシステムは、異なる剛性を持つ基質を統合して、病理学的および生理学的血管をエミュレートします。このプロトコルは、生理学的および病理学的剛性をそれぞれ表す、5kPaおよび10kPaの膨潤および剛性レベルがないゼラチンベースのヒドロゲルを作成する方法を概説しています。さらに、これらの基板を統合できるパラレルプレートフローチャンバーの構造も詳細に説明されています。数値流体力学(CFD)を使用して、せん断応力と流動条件を評価しました。EC培養用のハイドロゲルの調製と6時間フロー実験の実施について説明し、続いて実験後の免疫染色について説明します。

1. GelMAの合成

1. 無水炭酸ナトリウムの0.2M溶液と重炭酸ナトリウムの0.2M溶液を調製します。
2. 46 mLの重炭酸ナトリウム溶液を15 mLの炭酸ナトリウム溶液と混合し、139 mLの脱イオン(DI)水を加えます。.必要に応じて、0.1 M NaOHおよびHClを使用してpHを9.5に調整します。
3. ブタの皮から採取したA型300ブルームゼラチン10gを、100mLの炭酸塩-重炭酸緩衝液に10%w/vの濃度で加えます。
4. 55°Cのウォーターバスを使用してゼラチンを溶解し、マグネチックスターラーを使用して700rpmで溶液を攪拌します。完全に溶解したら、0.1 M NaOHを使用してゼラチン溶液のpHを9.5に調整します。
5. メタクリル化を開始するには、938 μLの無水メタクリル酸(MAH)を溶液に滴下します。ゼラチン溶液中のMAHの初期分布を改善するには、中心からの深さや半径方向の距離など、さまざまな場所にMAHを注入します。
6. 反応容器をアルミホイルで包み、光が当たらないようにします。温度を55°Cに維持し、溶液を500rpmで1時間攪拌して反応を完了させます(図1A)¹²。
   注:反応は7.4未満のpHで停止します。
7. 1.8 Lのアセトンを含む2 Lビーカー1つと、0.3 Lのアセトンを含む0.6 Lビーカー1つを準備します。
8. 得られたGelMA溶液を200RPMで攪拌しながら2Lビーカーに滴下して沈殿を誘発する¹³。沈殿物の収集を最大化するには、転写を容易にするために、核形成部位としてステンレス鋼のロッドまたはスパチュラを配置します。
9. 大きいビーカーから小さいビーカーに製品を移し、10分間放置してから乾燥ステップに進みます。沈殿したGelMAは白い繊維として現れるはずです。
10. 吸収紙に集め、室温(RT)の真空オーブンで乾燥させ、さらに使用するまで-20°Cで保管します。
    注:陽子核磁気共鳴(^1HNMR)による製品の化学的特性に関する詳細は、以前に発表された研究⁸に記載されています。

2.ガラスの塩類化

注:スライドガラスにハイドロゲルを付着させると、表面が平らで均一になり、取り扱いが容易になり、流れに起因するせん断応力下での安定性が確保されます。3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレートでガラスを官能基化することは、表面特性を強化し、重合プロセス中にヒドロゲルの共有結合を可能にするために必要です。

1. ガラスカッターを使用して、プレーンな顕微鏡スライド(厚さ1 mm)を最終的なヒドロゲル寸法に類似した断片に正確に切断します。カットスライドを石鹸で洗って、ガラス表面の処理を妨げる可能性のある表面の汚染物質や破片を取り除きます。
   注:必要に応じて、スライドガラスをエタノールで5分間超音波処理し、風乾します。
2. 無水エタノール中の3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレートの0.5%溶液を調製します。脱イオン水に10%氷酢酸溶液を調製します。溶液を混合して、最終濃度の3%氷酢酸を達成します。
   注:氷酢酸溶液は大量に調製して保存することができます。
3. スライドガラスをガラス容器に整理して、ガラス表面が遮られないようにします。得られた溶液をスライドガラスに注ぎ、反応が完了するまで80rpmのロッカーで約5分間保持します。閉じ込められた気泡を取り除き、スライドガラスの両側が変更されていることを確認します。
4. 反応が完了したら、溶液を吸引し、スライドガラスをエタノール2xで洗浄します。スライドを風乾し、RTで暗闇に保管します。
   注:スライドガラスは、これらの条件下で1か月間変更を保持します。

3.ヒドロゲル製剤

1. 酸化還元誘起フリーラジカル重合法を用いてハイドロゲルを作製します。
   1. 2ピースのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)金型を適切な深さで組み立て、開口部の窓を10 mm² にして、最終的な基板を成形します。これは、設計プロセス中の重合後のハイドロゲルの高さの25%の収縮を考慮します。漏れを防ぐために、金型が平らで、底板と天板にしっかりと固定されていることを確認してください。
      注:設計された金型寸法は、意図したヒドロゲルサイズよりも意図的に10%大きくなっています。この設計は、金型分離時の側面の損傷を防ぎ、不純物や気泡を側面に押し出すことでハイドロゲルの表面均一性を高め、高度に架橋されたハイドロゲルが平衡化後に水をはじき、収縮を引き起こす離水効果により、平衡化後に予想される25%の収縮を補償します。収縮量は、プロトコル⁸で指定されています。
   2. ハイドロゲルの表面が均一で高さが一定になるように、改質されたスライドガラスを金型のトッププレートから吊り下げ、ポリマー溶液を注入するための狭い開口部を確保します。カバーガラスを使用して、改造したスライドガラスを吊り下げます(図1B)。
   3. カバーガラスを作成するには、型より20%大きいプレーンな顕微鏡ガラスをカットします。短辺に2つのスペーサーを取り付けます。スペーサーの厚さを次のように計算します。
      スペーサーの厚さ = 1.33 x 最終ゲルの厚さ + 1 (改質ガラスの厚さ) - 金型の深さ
   4. セル適合シーリンググリースの薄層を、スペーサーが取り付けられているのと同じ面のカバーガラスの長辺に塗布します。
   5. 修正したスライドガラスを2つのスペーサーの間のカバーガラスに取り付けます。
   6. スペーサーが金型上に収まり、変更されたガラスが金型に伸びるように、カバーガラスを金型に置きます。このセットアップでは、改質ガラスと金型の底部との間に、最終的なハイドロゲルの高さの1.33のクリアランスが確保されます。
   7. 5 kPaおよび10 kPaのハイドロゲルについて、GelMAを脱イオン水にそれぞれ4%および10%w/vで溶解し、45°Cの水浴に入れます。
      注:GelMAは感熱性ポリマーであり、溶液の温度を45°Cに維持すると、重合前の固化を防ぎ、フラットなハイドロゲルの製造に不可欠な溶液の粘度が低下します。
   8. TEMED(5 kPAハイドロゲルの場合は24 mM、10 kPaハイドロゲルの場合は6.25 mM)をポリマー溶液に添加し、十分に混合します。
      注:TEMEDだけでは重合は開始されないため、先に進む前に型、ピペット、および溶液が準備されていることを確認してください。
   9. APS(5 kPAハイドロゲルの場合は24 mM、10 kPaハイドロゲルの場合は24.5 mM)をGelMA溶液に加え、十分に混合します。
      注:APSを添加すると重合が開始され、ハイドロゲルが迅速に形成される可能性があるため、ハイドロゲルの欠陥を防ぐための迅速な処置が必要です。剛性測定の詳細については、以前に公開された作品⁸を参照してください。
   10. 得られた溶液を懸濁したスライドガラスとRTの金型との間の開口部に慎重にピペットで固定し、架橋させます。毛細管現象は、ポリマー溶液を金型内に駆動します。ゲルに気泡を加えないようにし、ピペットチップに少量の溶液が残っている場合はピペッティングを停止してください。
       注:重合中、GelMAのメタクリレート基は、改質されたスライドガラス上のメタクリレート残基と反応し、ガラスへのヒドロゲルの化学的付着をもたらします。
   11. 15分後、反応が完了します。針などの鋭利なものを使用して基板を金型から取り外し、基板をカバーガラスからスライドさせて分離します。
   12. プラスチックフィルムで密封した100 mmのシャーレで、ヒドロゲルを1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に移し、37°Cで平衡化して、残りの反応物と副生成物を除去します。
   13. ハイドロゲルは最終寸法よりわずかに大きいため、フローチャンバーウィンドウに必要な寸法に一致するように、側面の余分なゲルをトリミングします。
   14. フローチャンバーを使用して、ハイドロゲルの寸法を確認します。ハイドロゲルがフローチャンバーに適切に収まり、ハイドロゲルと金型の間に隙間やフローパターンに影響を与える可能性のある欠陥がないことを確認します。フローチャンバー内のフローパターンに影響を与える可能性のある形状の凹凸があり、細胞の挙動が悪くなる場合は、ハイドロゲルを静的な状態用に保存してください。
   15. 4つのヒドロゲルを1x PBSを含むシャーレに移して滅菌します。
2. 以下に説明するように、70%エタノールを使用してヒドロゲルを滅菌します。
   1. 25%、50%、70%のアルコール溶液を調製して、徐々にハイドロゲルを脱水します。
      注:段階的な脱水が行われない場合、硬いハイドロゲルは収縮して破損する可能性がありますが、柔らかいハイドロゲルの表面にしわが形成される可能性があります。
   2. ヒドロゲルを含むペトリ皿から1x PBS溶液を吸引します。各シャーレに25%エタノール溶液を加えて、5 kPaおよび10 kPaのハイドロゲルを15分間浸します。
   3. 25%アルコール溶液を吸引します。各シャーレに50%アルコール溶液を加えて、5 kPaおよび10 kPaのハイドロゲルを15分間浸します。
   4. 50%アルコール溶液を吸引します。各シャーレに70%アルコール溶液を加え、5 kPaおよび10 kPaのハイドロゲルを5分間沈めます。ペトリ皿を100rpmのシェーカーに置きます。
   5. 5 kPa のハイドロゲルを 40 分間、10 kPa のハイドロゲルを 20 分間沈めたままにします。
      注:5 kPaハイドロゲルは、10 kPaハイドロゲルと比較して汚染されやすいことが観察されました。
   6. サンプルをバイオセーフティキャビネット内の6ウェルプレートに移し、滅菌PBSを使用してハイドロゲルを2x-3x洗浄します。

4.コーティングハイドロゲル

1. 3 mgのゼラチンを50 mLの滅菌PBS(マグネシウムおよびカルシウム塩を含む1倍)に溶解して、60 μg/mLのゼラチン溶液を調製します。溶液を37°Cのウォーターバスで30分間、またはすべてのゼラチンが完全に溶解するまで加熱します。
2. 0.2μmシリンジフィルターを使用してコーティング溶液を滅菌ろ過します。各ウェルプレートから1x PBS溶液を吸引し、各ウェルにゼラチン溶液を添加して、各ヒドロゲルが完全にカバーされるようにします。汚染のリスクを最小限に抑えるために、コーティング溶液に40ユニット/ mLのペニシリンと10μg/ mLのストレプトマイシンを追加します。.
3. 各ウェルプレートを37°C、5%_CO2 インキュベーターで45分間インキュベートします。ハイドロゲルを1x PBS溶液で洗浄します。
4. PBSを吸引し、細胞培養培地を添加します。
5. 2日以内に、ヒドロゲルを細胞培養培地に保持し、細胞播種まで37°C、5%_CO2 インキュベーターでインキュベートします。
   注:フィブロネクチンの優れた細胞接着特性にもかかわらず、ECがアテローム性動脈硬化症で内因性フィブロネクチンを沈着させ、炎症誘発性反応を引き起こす可能性があるため、その使用について懸念があります。化学的に刺激された細胞応答を避けるため、フィブロネクチンの使用は控えています。さらに、Orrらは、フィブロネクチンコーティングがコラーゲンIコーティングと比較して、アテローム発生遺伝子をアップレギュレーションすることを示しました。具体的には、細胞間接着分子1(ICAM-1)、血管細胞接着分子1(VCAM-1)、および核因子-κB(NF-κB)¹⁴の発現レベルの増加が観察されました。

5. 基板上に細胞を播種する

1. 利用可能な剥離プロトコルに従って細胞懸濁液を調製し、血球計算盤⁸を使用して細胞をカウントします。
2. ハイドロゲルから培地を完全に吸引します。各サンプルに50,000細胞/cm2を添加します。細胞のオーバーフローを防ぐために、各サンプルに適切な量の細胞懸濁液を添加します。
   注:硬い基材は疎水性が高くなります。したがって、ステップ間の時間を最小限に抑えて、濡れ性と基板表面への細胞懸濁液の分散を改善します。
3. 細胞播種したハイドロゲルを37°C、5%_CO2 インキュベーターで2時間インキュベートします。細胞がゲルに付着したら、細胞培養培地をサンプルに加えます。

6. フローチャンバーの製作

注:フローチャンバーを設計するためのアプローチは費用対効果が高く、製造と利用に必要な専門知識は最小限です。

1. チャンバー製造にポリ(メタクリル酸メチル)を使用して、流動品質、せん断応力下でのヒドロゲルの完全性、および流動実験中の潜在的なリアルタイムバイオマーカー研究を視覚的に評価します。チャンバーの設計は、コンピューター支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して作成されました。フローチャンバーは特許を申請されており、このデバイスに関する詳細は現在のプロトコルでは開示できません。
2. フローチャンバー内の流動条件の計算評価
   1. 設計されたフローチャンバー(.SLDPRT ファイル) を使用して、最終的なチャンバー設定を作成します。
   2. ヒドロゲル表面に接する流れの中心線に沿って線を引き、せん断応力を解析します。入口と出口の開口部を閉じて、閉じた制御ボリュームを定義します。
   3. CAD ソフトウェアの[アドイン]タブから Flow Simulation を開きます。[Flow Simulation] タブで、ウィザード機能を開いてプロパティを入力します。単位系を指定し、圧力と応力の単位をdyne/cm²に調整します。
   4. 物理的特徴の 流体の流れ と 重力 を確認します。Z成分の重力を-9.8に設定します。X コンポーネントと Y コンポーネントは 0 である必要があります。
   5. [ジオメトリ処理]の解析タイプとして[ 内部 ]を選択します。既定の流体として [水 ]を選択します。
      注意: 媒体が水のように振る舞うと仮定します。
   6. 流れのタイプとして [層流]と[乱流] を選択します。壁を断熱壁として定義し、壁の条件でサーフェスの粗さを入力します。
   7. 初期条件で温度を37.5°C(310.65K)に設定します。Flow Simulation プロジェクトで計算領域を定義し、制御ボリューム全体をカバーするようにします。
   8. 流体とインターフェースするすべての壁を選択して、流体サブドメインを定義します。[境界条件]で、入口リッドの内側サーフェスを[入口体積流量]として指定し、流量(Q)と一様流量を指定します。次に、出口蓋シールの内面を静圧として割り当てます。
   9. 使用可能な計算リソースに基づいてグローバル メッシュ サイズを決定します。 [実行 ]をクリックしてシミュレーションを開始します。
   10. 完了したら、せん断応力プロットや流れシミュレーションなど、目的の結果を確認します。
   11. さまざまな流量で手順 6.2.8 から 6.2.10 を繰り返して、さまざまな速度で適用されるせん断応力を計算します。回帰分析を使用して、流量とせん断応力の関係を確立します。
   12. ハイドロゲルの寸法変動に対するシステムの許容範囲を評価して、シミュレーションのリアリズムを高めます。

7. 均一な層流を実行する

1. 5 kPaおよび10 kPaのハイドロゲルで細胞を培養した後、37 °C、5% CO₂ インキュベーターで細胞単層が合流することを確認します。各ハイドロゲル上に細胞の単層を達成する必要があります。
2. パラレルプレートフローチャンバーシステムのオートクレーブ可能なコンポーネント(ステンレス製ネジ、スパチュラ、鉗子、ガスケット、メディアリザーバー)を30分間の重力オートクレーブサイクルで滅菌します。他の部品(アクリル部品とリザーバーシーラー/ダンパー)をUV光で滅菌します。
3. フローチャンバー装置をバイオセーフティキャビネットに組み立てます。ハイドロゲルサンプルをデバイス内に固定し、均一性を確保します。フローに使用できるサンプルの数が不十分な場合は、ハイドロゲルと同じサイズのフィラーを使用してください。
4. チャンバーの内面とハイドロゲル表面を事前に濡らして、気泡の形成を最小限に抑え、組み立て中の細胞の乾燥を防ぎます。
5. インレットリザーバーに十分なメディアを追加し、組み立て時にメディアの20%〜30%がアウトレットリザーバーに流れるようにします。インレットリザーバーをダンパー/シーラーを使用して気密にシールします。
   注:入口リザーバーに圧力が蓄積すると流れが駆動され、空気漏れがあると流量が変化します。外側のチューブに気泡が発生する場合は、シーラーの欠陥がないか確認してください。
6. 出口ダンパーを大気圧に設定して、圧力差を確立します。デバイスとリザーバーを37°C、5%_CO2 インキュベーターに入れます。デバイスのチューブをインキュベーターの外側に配置された蠕動ポンプに接続します(図1C)。
7. ポンプの電源を入れて、3.6ダイン/^cm2の塗布を開始します。流速を2 mL/min刻みで徐々に増やし(例:10分後に65 mL/minから85 mL/minに到達)、約8 dyne/cm²を適用するまで。
8. 流速をさらに 2.5 mL/分ずつ増やし、せん断応力が 12 dyne/cm² に達します。
   注:急激な流量の増加により細胞が剥離し、単分子膜が損傷する可能性があるため、細胞が動的条件に適応するまで時間をかけてください。
9. 6時間後、流れを止め、インキュベーターからデバイスを取り外し、フローチャンバーを分解します。その後、ハイドロゲルサンプルを6ウェルプレートに移します。
10. 氷冷したPBSでサンプルを洗浄し、免疫染色のために細胞を固定するか、タンパク質を分離するために細胞を溶解します。

8. 高倍率共焦点顕微鏡法のための免疫染色セットアップ

注:研究効率を高めるために、少量のハイドロゲルを免疫染色する方法が開発され、1つのサンプルで複数の生物学的ターゲットを検査できるようになりました。

1. 生検パンチまたは直径3mmまたは4mmの好ましい切削工具を準備します。
2. ピペットチップボックスを染色チャンバーとして使用します。チャンバーを加湿して、ピペットチップボックスの底に濡れたペーパータオルを置き、長時間のインキュベーション中に染色液の蒸発を制御します。
3. 個々のサンプルに対して小さな溶液プールを作成することにより、抗体の消費量を削減します。チップボックスラックを透明フィルムで覆い、指先でラックの穴にフィルムをそっと押し付けてくぼみを作ります。ディンプルに70μLのPBSを充填します。
4. 個々のヒドロゲルを空のペトリ皿に移し、生検パンチまたはお好みの切断ツールを使用して切断します。顕微鏡を使用して、代表的なサンプル領域をカットします。共焦点顕微鏡の問題を避けるために、フルゲルシリンダーをカットします。
5. カットしたヒドロゲルサンプルを、ステップ8.3で作成したディンプルに入れます。標準プロトコール¹⁵に従って染色を行います。最終染色洗浄後、ハイドロゲルの厚さに一致するシリコンゴムシートを入手してください。
   注意: できれば、シールを改善するために、片面が粘着性のあるシートを使用してください。この研究では、アクチンファイバーをファロイジンに結合した蛍光二次抗体を1:20の希釈率で染色しました。
6. ゴムシートを15mm×15mmの角にカットします。生検パンチまたはお好みの切削工具を使用して6mmの穴を開けます。
7. ゴムを顕微鏡カバースリップ(No.1.5)に取り付けてサンプル容器を作成します。サンプルがまだ存在する間に、10 μLの湿った封入剤をディンプルに加え、暗所で10〜15分間インキュベートします。
   注:この研究では、封入剤に0.9 μg/mLの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)が含まれ、染色プロトコルを短縮しました。
8. サンプルを染色チャンバーから取り出し、ステップ8.7で作成した容器に入れます。サンプルの上に1〜2μLの封入剤を塗布します。
   注意:封入剤の量は、高倍率での画質に影響します。マウントメディアが過剰または不足していると、画像の鮮明さが損なわれる可能性があります。
9. 別のカバースリップを上に置き、サンプルがガラスに接触するように静かに押します。顕微鏡イメージングまで、サンプルを暗所で4°Cで保存します。

図1 は、メタクリル化反応によるGelMA合成のプロセスの概要を示す実験セットアップを示しています。次に、得られた生成物を使用してヒドロゲル基質を作製し、その上にECを播種しました。続いて、細胞をフローチャンバーに導入し、12 dyne/cm² で 6 時間のフロー実験を行いました。

¹H NMR分光法を使用して、メタクリル化反応の成功を評価しました(図2A)。GelMAには1.9 ppmのメチル基と5.4〜5.6 ppmのビニルピークの存在により、メタクリル化の成功が確認されました。さらに、GelMAの3 ppmでのリジンピークの減少は、リジン残基の消費を示しており、リジン残基はメタクリレート残基12,13,16に置き換えられています。GelMAハイドロゲルの剛性は、圧縮試験を使用して評価され、圧縮弾性率がGelMA濃度とともに増加することが示されました(図2B)。4%および8%(w/v)GelMAからなるハイドロゲルを使用して、それぞれ生理学的(5 kPa)および病理学的(10 kPa)のマトリックス剛性を模倣^した8。

フローチャンバーは、UV耐性のあるアクリルポリマーを利用することにより、費用対効果が高く、滅菌を容易にするように設計されています。その透明性により、実験中のハイドロゲルと流動条件のリアルタイムモニタリングが容易になります。3つの異なる層で設計されたこのチャンバーは、ローディングまたはアンロード中のハイドロゲル損傷のリスクを最小限に抑えます:底板は頑丈なベースを提供し、中間層はハイドロゲルを横方向にサポートし、ガスケットに沿ったトッププレートは流体の流れに必要なクリアランスを作成します (図3A)。CFDを使用して計算シミュレーションを行い、チャンバー内の流れ条件とせん断応力を評価しました。次の式(せん断応力 = 0.0558 x 流量)は、流量を入力としてセルに加えられたせん断応力を計算しました (図3B)。特に、剛性などの材料特性の変更は、シミュレーションのせん断応力を変更しませんでした。最終的な実験セットアップでハイドロゲルのサイズの違いをカウントするために、計算モデルではハイドロゲルのサイズを意図的にわずかに小さくしました。ハイドロゲルの片側とチャンバーの中央プレート壁との間に、流れ方向に垂直に0.5mmのギャップが作られました。この構成により、これらのギャップのせん断応力効果の解析が可能になりました。ギャップ位置ではせん断応力の不規則性が観察されました が(図3B)、その影響はギャップに隣接する小さな領域に限定され、残りのヒドロゲル表面は均一なせん断応力を受けました (図3C)。これらの知見は、乱流領域の潜在的な影響を最小限に抑えるために、ハイドロゲルの端から細胞を廃棄することを示唆しています。注目すべきは、5 kPa および 10 kPa のハイドロゲルにシーディングされた EC に対して、最大 15 dyne/cm² の高せん断応力が実験的に適用され、デバイス内で漏れが発生しなかったことです (データは含まれていません)。しかし、せん断応力がさらに増加すると、細胞の剥離やハイドロゲルの破損につながる可能性があるため、実験条件を慎重に最適化する必要性が強調されています。

播種細胞が単層を形成するためには、従来の培養よりも高い細胞密度を使用することが重要です。播種密度が低いと、より柔らかいハイドロゲル⁸上の単層形成が妨げられることが示されている。さらに、細胞播種前にハイドロゲルをゼラチンでプレコーティングすると、初期の細胞接着と柔らかいハイドロゲルへの拡散が促進されます。ただし、このコーティングの有益な効果は一時的なものであり、主に細胞と基板との間の初期相互作用を促進することに注意することが重要です。

図4は、剛性とせん断応力がアクチンファイバーの形成にどのように影響するかを示しています。せん断応力下では、より太い応力繊維が形成され、表面への付着が強くなることが示唆されます。より柔らかいサンプルでは、生理学的状態の指標である末梢アクチン繊維が多く含まれていました。しかし、より硬い基板上のECでは、より強い応力繊維の存在とより少ない周辺繊維の存在が、ECの機能不全につながる可能性があります¹⁷。このデータは、提示されたシステムがECの挙動を調節するのに効果的であることを裏付けています。

図1:現在の研究の概要(A)GelMA合成。ゼラチンは、ゼラチンと無水メタクリッドメタクリッド(MAH)との55°Cでの反応により、ゼラチンメタクリレート(GelMA)に化学修飾されました。 次いで、生成物をアセトン中で沈殿させ、真空下で乾燥させた。(b)ヒドロゲル製造。カバーガラスはスペーサーを取り付けて用意しました。そして、改質したガラスをカバーガラスに取り付けました。カバーガラスを金型に置き、スペーサーは改質ガラスと金型の底部との間に所望の隙間を提供しました。開始剤を含むGelMA溶液を改質ガラスと型との間の開口部に添加し、重合して改質ガラスに共有結合したヒドロゲルを形成した。(C)フロー実験。得られたヒドロゲルは、ECのシードに使用されました。単層を形成した後、細胞は12ダイン/cm²のせん断応力で6時間の流れ実験を受けました。このフィギュアは BioRender.com で作成されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ゼラチンおよびGelMA予備重合のための1つのH-NMRスペクトル。 (A)関連するピークについては、破線のボックスを参照してください。メタクリロイルのピーク(すなわち、ビニル基およびメチル基)はゼラチンの化学修飾後に現れ、一方、リジン基は化学反応後の置換の程度を定量するために使用された¹⁸。(B)ハイドロゲルのヤング率を圧縮試験により測定し、4%(w/v)のGelMAハイドロゲルを生理的基質と、10%(w/v)を病理学的基質(n=4、SEM平均)と±した。この数値は⁸から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:パラレルプレートフローチャンバーの設計と計算シミュレーション(A)ローディングまたはアンロード中にハイドロゲルを損傷する可能性を減らすために、3つの別々のプレートが使用されました。底板が裏打ち面を提供したのに対し、中間面はハイドロゲルを横方向に支持し、天板とガスケットは流体が流れるためのクリアランスを形成しました。(B)フローチャンバーは計算シミュレーションを受けました¹¹。流速が215mL/minの場合、描かれた線に沿ったせん断応力は約12ダイン/^{cm2であり、}生理的せん断応力を表します。(C)0.5mmのギャップの影響は、ギャップに隣接する小さな領域に限定されます。ハイドロゲルの残りの表面は、均一なせん断応力を受けます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:せん断応力と硬いヒドロゲルは、応力繊維の形成を増加させます。 より多くの末梢アクチン繊維が、フロー下で5 kPaサンプル上のECに形成されます。細胞が10 kPaのハイドロゲル上でせん断応力にさらされると、より強い応力繊維が形成され、ECの挙動に対するモデルの有効性が示されました。矢印は末梢アクチン、アスタリスクはストレスを受けた繊維を示します。スケールバー= 10 μm(青:DAPI、赤:アクチンファイバー)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

血管系は、さまざまな力が細胞の挙動に大きな影響を与えるダイナミックな環境です。これらの力を考慮せずに心血管疾患の生物学的事象を研究することは不正確です。したがって、血管の機械的環境をエミュレートできる細胞モデルが重要です。研究者たちは、これらの力が細胞の行動に及ぼす影響を強調することで、すでに大きな進歩を遂げています¹¹。しかし、人体の病理学的および生理学的条件下での細胞の挙動を理解するためには、血管の環境により近い、より精密なモデルを開発することが不可欠です。そこで、アクセスのしやすさや使い勝手の良さを保ちつつ、より正確に血管環境を再現するシステムの開発を目指しました。

このモデルは、制御された流れから導き出されたせん断応力を、さまざまな剛性レベルの基板上のヒト細胞に適用でき、既存のモデルと比較して生理学的現実に近い条件を作り出します。このモデルでは、1)調整可能な機械的特性、2)非腫脹挙動、3)細胞適合性と接着性、4)血管細胞を埋め込みて血管をより正確にモデル化する能力を満たすために、GelMAが合成され、このモデルで利用されました。機械的特性の調整可能性は、生理学的および病理学的条件を模倣するために生体高分子濃度⁸を変化させることによって達成された。2つ目の基準は、腫れない行動でした。一貫したフローチャンバーの寸法、関連するフロー条件、および細胞へのせん断応力を維持するためには、膨潤しない基質を用意することが重要です。高度なメタクリル化を施したGelMAは、非膨潤性を示し、実験全体を通じてハイドロゲルの形状と表面の滑らかさを維持しました⁸。重要なことに、濃度と硬さは腫れの挙動に影響を与えなかったため、実験グループごとに個別に調整する必要がなくなり、モデルが簡素化されました。3番目の基準は細胞接着であり、細胞の剥離を防ぎ、単層の完全性を維持するためには適切な接着が必要である。GelMAは細胞接着を提供し、それにより、多くの生体高分子に不可欠な細胞接着分子を基質に結合するための追加のステップの必要性を減らしました。さらに、GelMAの細胞カプセル化能力も考慮されましたが、この研究では直接テストされていません。細胞カプセル化電位は、3D細胞培養をサポートし、血管平滑筋細胞や周皮細胞などの細胞の層を統合して、モデルの精度を向上させるための適応を有する¹⁹。さらに、GelMAの合成は費用対効果が高く、最小限の機器しか必要としないため、基質作製のための生体材料として優れた候補となる20,21,22。

パラレルプレートフローチャンバーは、セルにせん断応力を加えるために一般的に使用されますが、従来はガラス製のカバースリップや硬質材料にしか使用されていませんでした。しかし、そのような材料は生理学的関連性を欠いている²³。対照的に、マイクロ流体デバイスは、ポリマーベースの材料を利用することにより、より幾何学的な複雑さとより柔らかい基板を導入しています。しかし、これらの装置はしばしばフローレジームを正確に制御することができず、その小さな寸法は少数の細胞のみを研究する能力に制限され、実験結果^{を制限します11}。提案されたデバイスは、内皮細胞単層播種ハイドロゲルをフローチャンバーと統合し、正確に制御されたせん断応力を適用することにより、両方のシステムの利点を兼ね備えています。

このデバイスは、流れから派生した機械力と固体から派生した機械力の両方を統合する能力を実証しました。12 dyne/cm²のせん断応力を6時間加えると、細胞質ストレス繊維の形成が観察され、より柔らかい基質群では末梢アクチンが優勢であることとは対照的でした。これは、ECをより柔らかい表面で培養したときに形成される応力繊維が少ないことを示す多くの報告と一致しています^24,25,26,27。一方、層流は顕著な応力繊維形成をもたらす可能性があります。流れ条件に対する細胞骨格の反応は、流れへの曝露から1時間以内に開始されるが、再編成を完了するには著しく長い時間が必要であることが示されています28,29,30。末梢アクチンネットワークは、細胞間接着やバリア機能など、さまざまなEC機能に不可欠です¹⁷。このネットワークを健康な実験群で、ストレス線維が広範な病理学的群と比較して、このネットワークを過剰に制御することは、デバイスが健康な状態と病気の状態をうまくモデル化することを承認しています。

この装置の欠点の1つは、ハイドロゲルが損傷する可能性があり、流れを乱し、実験の成功率を低下させる可能性があることです。この問題は主にハイドロゲルの初期欠陥から生じ、せん断応力下で悪化し、サンプルの剥離や部分的な流れの障害につながる可能性があります。したがって、重合、平衡化、切断などのサンプル調製ステップは、サンプルへの追加の損傷を防ぐために慎重に行う必要があります。このシステムのもう一つの課題は、単分子膜の完全性を達成し、維持することです。ハイドロゲルをゼラチンでコーティングすると、初期の細胞接着を改善することができますが、私たちの以前の研究では、このコーティングが細胞増殖に影響を与えないことが示されました⁸。したがって、単層形成を増強するためには、特に細胞増殖がより柔らかいハイドロゲル³¹上で遅くなることを考慮すると、播種密度を増加させることが有益である。さらに、細胞は流体の流れによって誘発されるせん断応力により剥離する可能性があります。したがって、流量を徐々に増やし、細胞が新しい環境条件に適応するのに十分な時間を確保することが重要です。

結論として、このデバイスは、流体由来の力と固体由来の機械的力の両方を同時にシミュレートする能力により、血管環境をより正確にシミュレートする上で大きな進歩を遂げています。これは、さまざまな生理学的および病理学的条件下でのEC行動を研究するための包括的なプラットフォームを提供します。この汎用性により、血管生物学と疾患の進行に関する理解を深めるための貴重なツールとなっています。このモデルは、メカノバイオロジー、アテローム性動脈硬化症、がん転移の発生、血管組織工学と血管新生、薬物送達とスクリーニングなど、さまざまな研究に貢献できます。

著者らは、仮特許出願(第63/634,853号)が「Flow Chamber with a Mechanically Tunable Substrate」というタイトルで提出されており、他に競合する利益は存在しないことを宣言します。

著者らは、フローチャンバーの製作に協力してくれたロバート・イーガンに感謝の意を表します。著者らは、実験中に助けてくれたルーカス・マッコーリーに感謝しています。さらに、ノースイースタン大学のInstitute for Chemical Imaging of Living Systems(CILS)の中核施設が共焦点顕微鏡へのアクセスを許可したことに感謝します。著者らは、国立衛生研究所(NIH 1R01EB027705、SBに授与)と国立科学財団(NSF CAREER Awards:DMR 1847843 to SBおよびCMMI 1846962 to EE)から提供された資金援助に感謝しています。