마우스의 심근경색 및 심근 허혈-재관류 손상 유도

여기서는 미세 조작을 통해 좌측 전방 하행 관상동맥의 정밀 결찰에 의해 마우스에서 심근경색 또는 심근 허혈 재관류 손상을 유도할 수 있는 간단하고 재현 가능한 방법을 설명합니다.

급성 심근경색은 사망률이 높은 흔한 심혈관 질환입니다. 심근 재관류 손상은 심장 재흐름의 유익한 효과를 상쇄하고 이차성 심근 손상을 유발할 수 있습니다. 심근 경색 및 심근 허혈 재관류 손상의 간단하고 재현 가능한 모델은 연구자에게 좋은 도구입니다. 여기에서는 미세조작을 통해 좌측 전방 하행 관상동맥(LAD)을 정밀하게 결찰하여 심근경색(MI) 모델 및 MIRI를 생성하는 맞춤형 방법을 설명합니다. LAD의 정확하고 재현 가능한 합자 위치 지정은 심장 손상에 대한 일관된 결과를 얻는 데 도움이 됩니다. ST 세그먼트 변경은 모델 정확도를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 심장 트로포닌 T(cTnT)의 혈청 수치는 심근 손상을 평가하는 데 사용되고, 심장 초음파는 심근 수축기 기능을 평가하는 데 사용되며, Evans-Blue/트리페닐 테트라졸륨 클로라이드 염색은 경색 크기를 측정하는 데 사용됩니다. 일반적으로 이 프로토콜은 시술 기간을 단축하고, 제어 가능한 경색 크기를 보장하며, 마우스 생존율을 향상시킵니다.

급성 심근경색(AMI)은 전 세계적으로 흔한 심혈관 질환이며 사망률이 높습니다¹. 기술의 발전으로 AMI 환자는 조기에 효과적인 혈관재생술을 받을 수 있습니다. 일부 환자에서 이러한 치료 후 심근 허혈 재관류 손상(MIRI)이 발생할 수 있다². 따라서 작용 메커니즘과 MI/MIRI를 개선하는 방법을 이해하는 것이 매우 중요합니다. 마우스는 비용이 저렴하고 번식 시간이 빠르며 유전자 변형이 용이하기 때문에 모델로 널리 사용됩니다³. 학자들 은 동물 4,5,6,7,8,9에서 MIRI와 MI를 모델링하는 다양한 방법을 개발했습니다. 이 전략은 연구를 촉진하지만 채택된 다양한 기준과 방법은 연구 팀 간의 결과 해석을 복잡하게 만듭니다.

마우스에서, MI는 이소프로테레놀¹⁰, cryoinjury ^{11,12 또는 소}작 ¹³에 의해 유도되었다. MI는 이소프로테레놀에 의해 쉽게 유도될 수 있지만, 병태생리학적 과정은 임상적 MI의 그것과 다릅니다. 극저온손상으로 인한 MI는 일관성이 떨어지고, 좌측 전방 하행 관상동맥(LAD) 주위의 과도한 심근 손상을 유발하며, 부정맥을 쉽게 유발할 수 있습니다. 소작으로 인한 MI는 심근 경색의 자연적인 과정과 상당히 다르며 작열 부위의 염증 반응이 더 강렬합니다. 또한 수술적 접근은 기술적인 어려움이 있습니다. 또한, 중재적 기법을 통한 풍선 차단 또는 색전술 또는 혈전증 방법을 사용하여 미니피그에서 MI 모델을 개발하는 실험실(¹⁴)이 있습니다. 이 모든 방법은 관상동맥 폐색을 직접적으로 유발할 수 있지만, 관상동맥 조영술 장치가 필요하고 무엇보다도 쥐의 관상동맥이 너무 얇기 때문에 이러한 수술은 실용적이지 않습니다. MIRI의 경우 호흡기/미세 조작을 사용하거나 사용하지 않는 것과 같이 서로 다른 모델 간의 차이는 매우 미미했습니다 ^5,6.

여기에서, MI를 유도할 수 있는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법과, 이전에 발표된 방법 4,5,6,7,8,9,15로부터 채택된 MIRI 모델을 설명한다. 이 방법은 결찰을 통해 LAD를 직접 봉쇄하여 병태생리학적 과정을 시뮬레이션할 수 있습니다. 또한, 결찰을 완화시킴으로써, 이 모델은 또한 재관류 손상을 시뮬레이션할 수 있다. 이 프로토콜에서는 LAD 시각화를 위해 해부 현미경이 사용됩니다. 그러면 연구자는 LAD를 쉽게 식별할 수 있습니다. 그 후, LAD의 정확한 결찰은 재현 가능하고 예측 가능한 혈액 폐색과 심실 허혈로 이어집니다. 또한 현미경으로 관찰된 LAD의 색 변화 외에도 심전도(ECG) 변화를 사용하여 허혈 및 재관류를 확인할 수 있습니다. 이 전략은 시술 기간을 단축하고 수술 합병증 위험을 낮추며 필요한 실험용 쥐를 줄입니다. 트로포닌-T 검사, 심장 초음파 및 트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC) 염색 방법도 설명합니다. 전반적으로 이 프로토콜은 MI/MIR 메커니즘 연구와 약물 발견에 유용합니다.

동물 연구는 Huazhong University of Science and Technology(중국 우한)의 동물 관리 및 활용 위원회의 승인을 받았습니다.

알림: 수컷 C57BL/6J 마우스(8-10주)가 모델로 사용됩니다. 생쥐는 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있으며 특정 병원체가 없는 조건에서 사육됩니다. 실내는 제어된 온도(22°C ± 2°C)와 습도(45%-65%)로 유지됩니다. 생쥐는 이 기관에서 정한 지침에 따라 Tongji Medical School(중국 우한)의 동물 보호 시설에서 12시간 명암 환경에 노출됩니다. 멸균 미세 수술 기구 및 수술 용품을 사용하십시오. 수술 내내 수술용 장갑과 마스크가 필요합니다. 실험 워크플로우는 그림 1A에 나와 있습니다.

1. 수술 전 준비

1. 수술 과정 내내 예열된 가열 패드(37°C)가 있는 직사각형 수술대(OT)를 사용하십시오(그림 1B). 절차를 시작하기 전에 자외선과 70% 알코올로 보드를 소독하십시오.
2. 필요한 마취제의 투여량을 계산하기 위해 모든 마우스의 무게를 정확하게 측정합니다. 그런 다음 복강 내 주사를 통해 케타민(80mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)으로 마우스를 마취합니다. 발가락 꼬집기 및 눈 깜빡임 반사에 대한 금단 반사가 없어 적절한 마취 깊이를 보장합니다.
3. 눈이 과열되지 않도록 머리 아래에 거즈를 사용하여 마우스를 OT에 올려놓습니다. 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 안과 연고를 바르십시오.
4. 전기 면도기로 왼쪽 흉부의 털을 면도합니다. 미리 면도한 흉부에 털 제거 크림을 바르고 멸균 면봉으로 ~1분 동안 골고루 마사지합니다. 여분의 느슨한 털을 거즈로 닦으십시오.
5. 포비돈 요오드를 사용하고 70% 알코올을 사용하여 해당 부위를 청소하십시오. 거즈로 흉부를 덮으십시오.
6. 위쪽 앞니 아래에 4-0 봉합사를 사용하고 앵커 포인트(코 위의 OT 가장자리에 가까움)에 고정하여 입을 약간 벌리고 캐뉼레이션을 용이하게 합니다.
7. 꼬리를 당겨 몸체를 똑바로 유지하고 테이프를 사용하여 꼬리를 OT에 고정합니다. 네 개의 팔다리를 고정하고 다른 앵커 포인트에 조입니다. 중요한 것은 앞다리를 과도하게 스트레칭하지 않는 것입니다. 그렇지 않으면 호흡기 손상이 발생할 수 있습니다.
8. 구부러진 집게와 집게를 사용하여 턱을 열고 혀를 들어 올립니다. 조명기를 사용하여 목구멍과 성문을 명확하게 시각화합니다.
9. 뭉툭하고 잘린 바늘로 22G 캐뉼라를 목구멍 아래 ~1cm의 입을 통해 기관에 부드럽게 삽입합니다. 한 손으로 혀를 잡고 뭉툭한 집게로 혀를 약간 위로 움직인 다음 동시에 다른 손으로 튜브를 기관에 부드럽게 삽입합니다. 튜브를 식도에 삽입하지 않도록 주의하십시오.
10. 바늘을 부드럽게 제거하십시오. 인공호흡기에 연결하기 전에 튜브를 물에 넣어 기포가 형성되는지 삽관을 확인하십시오.
11. 기관내관을 120/min으로 설정된 인공호흡기에 연결하고 일회 호흡량을 250μL로 조정합니다.
    알림: 인공호흡기 설정은 체중에 따라 조정됩니다(일반적으로 체중이 높을수록 더 높은 일회 호흡량이 필요함).
12. 양측 대칭 흉부 확장을 확인하여 삽관을 확인합니다. 그런 다음 튜브가 떨어지는 것을 방지하기 위해 테이프로 연결을 OT에 고정합니다.
13. 발에 ECG 전극을 놓고 ECG 레코더에 연결합니다. 시술 전반에 걸쳐 심장 전기 생리학을 모니터링합니다.

2. 흉곽 절제술

1. 흉부의 거즈를 제거합니다. 절개 부위를 70% 알코올로 다시 소독하고 세 번의 스크럽 주기를 사용합니다. 그런 다음 수술 부위의 오염을 줄이기 위해 수술 부위에 구멍이 있는 멸균 수술용 드레이프로 마우스를 덮습니다.
2. 멸균 메스로 왼쪽 쇄골 중앙선을 따라 비스듬한 피부 절개(0.8-1.0cm)를 합니다.
3. 아래의 갈비뼈를 노출시키기 위해 피하 조직을 둔하게 해부합니다. 혈관, 갈비뼈, 폐를 다치지 않도록 주의하십시오. 멸균 면 어플리케이터를 사용하여 출혈을 멈춥니다.
4. 세 번째 늑간 공간을 확인하고 약 6-8mm를 절개합니다. 그런 다음 흉강을 열기 위해 연안 공간에서 조직을 둔기로 절개합니다. 내부 흉부 동맥을 다치지 않도록 주의하십시오.
5. 집게를 사용하여 늑간 공간에 걸쳐 있습니다. 사전 멸균된 수제 견인기(그림 1C)를 흉곽에 삽입하고 뒤로 당겨 절개 부위를 너비 ~6mm로 벌립니다. 고무 밴드로 견인기를 OT에 부착합니다.
6. 주변 조직을 조심스럽게 제거하여 심장이 완전히 노출되도록 합니다. 심장을 다치게 하지 않고 구부러진 집게로 심낭을 부드럽게 잡아당깁니다. 이제 심장을 선명하게 볼 수 있습니다.

3. LAD 결찰

참고: LAD는 정점 부근에서 좌심실을 통해 수직으로 이어지는 얇은 빨간색 선으로 나타납니다. LAD는 밝은 빨간색이므로 정맥으로 착각하지 않도록 주의하세요. 일반적으로 결찰 부위는 왼쪽 귓바퀴 아래 ~ 1-2mm입니다. 이 결찰 위치는 좌심실에서 허혈의 약 40%-50%를 생성합니다. 위치가 높을수록 더 넓은 경색 영역이 만들어집니다. 더 말단 부위는 더 작은 경색 영역을 만듭니다.

1. 해부 현미경을 사용하여 LAD 시각화를 위해 초점이 맞춰진 적절한 조명을 비춥니다. 선택한 결찰 위치 아래의 부위를 부드럽게 눌러 LAD를 일시적으로 확대합니다(시간당 ≤5초). 이 방법으로 LAD를 다시 확인합니다.
2. 테이퍼 바늘(3/8, 2.5 x 5)을 사용하여 8-0을 통과합니다. 해부 현미경으로 LAD 아래의 실크 합자. 바늘 깊이에 주의하십시오: 좌심실에 들어가기에는 너무 깊지 않고 LAD가 손상되지 않도록 너무 얕지 않아야 합니다.
3. 느슨한 이중 매듭으로 합자를 묶습니다. 루프 직경은 약 2-3mm입니다.
4. 2-3mm PE-10 튜브를 동맥과 평행한 루프에 넣습니다.
5. 합자 루프가 동맥과 튜브 주위에 올 때까지 부드럽게 조입니다. 그런 다음 슬립 매듭으로 루프를 고정하십시오. 과도한 조임 압력으로 심근 벽이 손상되지 않도록 주의하십시오.
   알림: 가짜 수술 그룹에 대해서는 결찰이 수행되지 않습니다.
6. LAD의 혈류 중단 확인: 결찰 후 LV의 전벽에서 더 옅은 색을 관찰합니다. 또한, 몇 번의 심장 박동 내에서 상당한 ST 상승은 폐색을 나타낸다¹⁶. 영구 결찰이 필요한 경우(예: MI) PE-10 튜브를 제거하고 LAD를 매듭으로 직접 묶습니다. 아래 4.3단계에서 설명한 대로 나머지 절차를 다시 시작합니다.
7. 절개부에서 견인기를 제거합니다. 그런 다음 불독 클램프로 상처를 일시적으로 봉합합니다. 허혈 지속 시간은 실험 설계에 따릅니다. 마우스가 인공호흡기에 계속 연결되어 있는지 확인합니다.

4. 재관류

1. 허혈 기간이 끝나면 불독 클램프를 제거하고 견인기를 다시 삽입하여 절개 부위를 열고 심장 (특히 결찰 부위)을 노출시킵니다.
2. 슬립매듭을 풀고 PE-10 튜브를 제거합니다. 이 단계에서 20초 이내에 색상이 다시 분홍색-빨간색으로 변하는 것을 관찰하여 혈류의 회복을 확인합니다. 동시에 ECG를 주의 깊게 관찰하십시오: ST 상승의 잠재적인 용해는 또한 재관류를 시사합니다.
3. 8-0을 떠나 후속 Evans-Blue 및 TTC 염색을 위한 합자 in situ . 다른 경우에는 이 단계에서 봉합사를 제거하십시오.
4. 견인기를 제거하고 세 번째와 네 번째 갈비뼈를 4-0 나일론 봉합사로 봉합하여 절개 부위를 봉합합니다. 폐를 다치지 않도록 주의하십시오. 봉합사 매듭을 묶으면서 가슴을 부드럽게 눌러 흉강에 갇힐 수 있는 공기를 밀어냅니다.
5. 연속 봉합사로 근육층을 닫습니다. 4-0 나일론 봉합사로 피부를 닫으십시오. 연속 봉합사와 중단된 봉합사가 허용됩니다.

5. 수술 후 관리

1. 예를 들어 마취에서 회복된 징후가 있는지 쥐를 주의 깊게 관찰하십시오.ample, 꼬리나 수염의 움직임. 그 후 쥐는 일반적으로 약 150bpm의 호흡수로 정상적인 호흡 패턴을 재개합니다. 튜브를 천천히 제거하여 마우스를 발관합니다.
2. 호흡 곤란이 없는지 확인하기 위해 추가로 3-5분 동안 마우스를 모니터링합니다.
3. 생쥐가 숨을 쉬기 시작한 후 100μL의 부프레노르핀(0.1mg/mL, s.c.)을 투여합니다. 다음 24시간 동안 4-6시간마다 추가 용량을 제공하십시오. 이부프로펜을 식수에 0.2mg/mL 용액으로 넣어 수술 전 2일, 수술 후 ≤7일 동안 추가로 진통제로 투여합니다.
4. 쥐는 마취 후 저체온증에 걸리기 쉽기 때문에 단열 담요를 사용하여 쥐를 따뜻하게 유지하고 사망 위험을 줄입니다.

6. 시술 후 유효성 검사

1. 트로포닌-T 테스트
   1. 후안와신경총에서 혈액 샘플을 채취하고 원심분리(3,000× g, 10분, 실온)를 통해 혈청을 분리합니다.
   2. 트로포닌-T 검사를 위해 식염수로 혈청 20μL를 100μL로 희석합니다. 나머지 샘플은 -80 °C에 보관합니다.
   3. 제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 트로포닌 T(cTnT)를 감지합니다.
2. 심장 초음파
   참고: 심장 초음파는 실험 설계^17,18에 따라 수술 전후의 여러 단계에서 심장 기능 및 벽 운동 이상을 평가하는 데 사용됩니다. 심실 벽 두께, 심실 용적, 심실 공동 직경, 박출률 및 단축 단축 분율과 같은 다양한 파라미터가 측정됩니다.
   1. 복강 내 주사를 통해 케타민(80mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)으로 마우스를 마취합니다.
   2. 전기 면도기로 가슴을 면도하십시오. 털 제거 크림을 바르고 골고루 마사지하십시오. 여분의 느슨한 털을 거즈로 닦으십시오.
   3. 마우스를 OT에 놓고 접착 테이프로 네 개의 팔다리를 고정합니다.
   4. 초음파 프로브(30MHz)를 흉골까지 ~ 30°의 심장 전방 영역에 놓습니다. 이 보기의 프로브는 심장의 긴 축과 정렬되어 있습니다. 초음파를 B-모드로 설정합니다. 좌심실, 좌심방, 승모판막, 상행 대동맥을 명확하게 확인할 수 있습니다. 비디오 캡처를 사용하여 후속 분석을 위한 데이터를 얻습니다.
   5. 변환기를 시계 방향으로 90° 회전하여 유두근 수준에서 흉골 주위 단축 보기를 얻어 좌심실과 우심실을 명확하게 감지합니다. 그런 다음 B-모드 및 M-모드를 사용하여 심장 기능 및 형태 측정을 평가합니다.
   6. 초음파 영상에서 해당 위치를 지정하여 좌심실 이완기 끝 직경(Dd), 수축기 말단 직경(Ds) 및 심실 중격 두께를 계산합니다.
      알림: 기계는 좌심실 이완기 말기 용적(LVEDV) 및 수축기 말기 용적(LVESV)을 수동으로 계산합니다. 또한 기계는 FS = (Dd-Ds)/Dd × 100% 및 EF= (LVEDV-LVESV)/LVEDV × 100% 공식을 사용하여 분수 단축(FS) 및 취출률(EF) 값을 계산합니다. 5개의 연속된 심장 주기를 선택하고 평균값을 구합니다.
3. 심근 경색 크기 측정
   참고: Evans-Blue/TTC 염색은 조직 생존율을 평가할 수 있기 때문에 경색 크기를 측정하는 데 사용된다¹⁹. 흉터가 줄어들기 때문에 재관류 후 72시간 이내에 염색하는 것이 좋습니다. 이 단계는 복강 내 주사를 통해 200mg/kg 펜토바르비탈 나트륨으로 동물을 안락사시킨 후 수행됩니다.
   1. 2.2-2.5단계의 이전 절차에 따라 심장을 다시 노출합니다. 그런 다음 원하는 재관류 기간이 끝날 때 4.3단계에서 언급한 봉합사로 검증된 초기 부위에서 LAD를 다시 결찰합니다.
   2. 대동맥을 캐뉼레이션한 다음 1% Evans Blue 용액 0.3mL를 심장에 관류합니다. 비허혈성 부위의 심근은 파란색으로 염색되어 있습니다. 관류 후 가위로 대동맥을 잘라 심장을 빠르게 제거합니다.
   3. 그런 다음 KCl 용액(30mM)으로 심장을 씻어 심장 박동을 멈춥니다. -20°C에서 주변 지방 조직을 제거한 후 ≥4시간 동안 보관하십시오.
   4. 날카로운 메스를 사용하여 가로 방향으로 심장을 1mm 두께의 5 조각으로 자릅니다. 슬라이스의 무게를 잰 다음 37°C에서 40분 동안 2% TTC로 배양합니다.
      참고: 배양 후 경색 부위는 흰색으로 구분되는 반면 비경색 부위의 생존 가능한 조직은 빨간색으로 유지됩니다.
   5. 밤새 4% 포름알데히드로 조각을 고정합니다.
      알림: 이 작업은 경색 영역과 비경색 영역 사이의 대비를 향상시킵니다. 또한 슬라이스가 축소됩니다.
   6. 디지털 카메라로 슬라이스를 촬영합니다. 그런 다음 그래픽 소프트웨어를 사용하여 위험 영역(AAR), 경색 영역 및 비허혈 영역을 계산합니다.
      알림: Evans-Blue/TTC 이중 염색 후 파란색 영역은 "정상" 영역입니다. 나머지 영역(흰색 및 빨간색 포함)은 "허혈 위험" 영역입니다: 흰색 영역은 심근 경색 영역(IA)이고 빨간색 영역은 허혈성(경색이 아닌) 영역입니다. 심장 절편 크기의 불일치를 고려하여 결과는 무게에 맞게 조정됩니다.
      
      할당하다:
      A1-A5 경색 영역 영역 / 심장 절편 영역;
      B1-B5 비경색 영역 / 심장 절편 영역;
      W1-W5 : 하트 슬라이스의 무게.
      
      그러면:
      경색 심근의 총 무게 : A1 × × A1 + W2 A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5;
      경색되지 않은 심근의 총 무게: W1 × B1 + W2 × B2 + W3 × B3 + W4 × B4+ W5 × B5;
      AAR의 총 중량 = (W1 + W2 +W3 + W4 + W5) - (W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5)
      
      마침내:
      심근 허혈의 면적은 좌심실의 AAR 비율로 계산됩니다.
      
      심근 경색 면적은 AAR에서 IA의 백분율로 계산됩니다.
      

실험 워크플로우는 그림 1A에 나와 있습니다. 연구자는 연구 시작 시 실험 설계에 따라 시간 노드를 예약할 수 있습니다. LAD 결찰 기간은 연구 목적에 따라 다릅니다. MI의 경우 연구는 재관류 단계를 무시할 수 있습니다. 심장 초음파는 비침습적이기 때문에 연구의 여러 단계에서 사용할 수 있는 반면, Evans-Blue/TTC 염색은 마우스를 희생한 경우에만 수행할 수 있습니다. 섬유증 및 심실 리모델링에 중점을 둔 연구의 경우 관찰 시간이 훨씬 더 깁니다.

실험 과정의 일부에 대한 일반적인 이미지는 기관 내 삽관, 피부 절개, 개흉술, LAD 식별, LAD 결찰에서 재관류에 이르기까지 그림 2A에 나와 있습니다. 심근 허혈 및 재관류를 확인하기 위해 결찰 후 상당한 ST 상승 및 슬립매듭이 풀렸을 때 ST 상승이 용해된 대표적인 ECG 이미지가 그림 2B에 나와 있습니다.

모든 쥐에서 혈액 샘플을 채취한 후 트로포닌-T 검사를 통해 경색을 확인할 수 있습니다. 그림 3A 는 가짜 그룹과 비교할 때 MIRI 및 MI 그룹에서 cTnT가 크게 증가했음을 보여줍니다. 그림 3B 는 가짜 그룹과 MIRI 그룹 사이의 심장의 5개 연속 횡절편에 대한 Evans-Blue 및 TTC의 이중 염색을 보여줍니다. 파란색 영역은 정상 영역, 흰색 영역은 심근 경색 영역, 빨간색 영역은 허혈성 영역이지만 경색이 없는 영역을 나타냅니다. 그림 3C 는 가짜 그룹과 MI 그룹 사이의 심장 초음파의 장축 이미지를 나타냅니다. 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 MI 그룹과 비교하여 그림 3C 의 가짜 그룹에 대한 더 높은 박출률 값과 같은 다양한 기능 파라미터를 계산할 수 있습니다.

그림 1: 수술 설정. (A) 실험 타임라인의 개요. (B) 예열된 가열 패드와 ECG 전극 연결이 있는 수술대. (C) 수제 견인기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 실험 과정 및 ECG 변화. (A) 기관내 삽관, 피부 절개, 개흉술, LAD 식별, LAD 결찰 및 재관류의 이미지는 각각 1, 2, 3, 4, 5 및 6에 나와 있습니다. (B) 결찰 및 재관류 후 MI 및 MIRI의 일반적인 ECG 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 절차 후 유효성 검사. (A) 가짜, MIRI 24 h 및 MI 3 d 그룹 중 심장 트로포닌의 발현. (B) Evans - 가짜 및 MIRI 24시간 그룹에 대한 파란색/TTC 이중 염색. (C) 가짜 및 MI 그룹에 대한 심장 초음파. 위위; d, 이완기 말기 좌심실 내부 치수; 위위; S, 수축기 좌심실 내부 치수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

최근 몇 년 동안 임상 및 과학 연구에서 MI 및 MIRI에 대한 모델 생성이 빠르게 발전했습니다^20,21. 그러나 행동 메커니즘 및 MI/MIRI를 개선하는 방법과 같이 해결해야 할 몇 가지 질문이 여전히 남아 있습니다. 여기서, MI 및 MIRI의 뮤린 모델을 확립하기 위한 수정된 프로토콜이 설명된다. 몇 가지 핵심 사항을 신중하게 고려해야 합니다.

첫 번째 요점은 기관내 삽관입니다. 일부 시술^(6,9)은 자궁경부 피부를 절개하고, 조직을 분리한 다음^, 흉골 근육을 노출시켜 기관을 관찰하는 것이다. 이러한 방식으로 연구원은 기관으로의 튜브 삽입을 시각화할 수 있습니다. 이것은 호흡 곤란의 위험을 줄이기 위한 좋은 단계입니다. 현재 방법에서 연구원은 조명기 아래에서 호흡으로 성문이 닫히고 열리는 것을 명확하게 시각화한 다음 튜브를 기관에 쉽게 삽입할 수 있습니다. 따라서 자궁경부 절개는 염증 신호 연구에서 중요한 피부 외상과 잠재적 감염을 줄이기 위해 이루어지지 않습니다. 시각 후두경은 임상 기관 삽관에 널리 사용되며, 생쥐에서도 사용할 수 있습니다. Mares et ^al.22는 동물의 코와 입에 놓인 비침습적 마스크를 통해 산소를 투여하여 5% 이소플루란 유도 후 2% 이소플루란 흡입에 의해 수행된 기관내 삽관 없이 연속 마스크 흡입 마취를 보고했습니다. 조직 손상을 방지하고 마취의 안전성과 효율성을 향상시킬 수 있습니다. 그러나 특수 흡입 마취 기계가 필요합니다. 또한 휘발성 마취제는 작업자에게 신체적 상해를 입힐 수 있습니다.

두 번째이자 가장 중요한 핵심 포인트는 LAD의 식별 및 결찰입니다. LAD 식별 및 결찰에서 실수할 때마다 일관성 없는 결과가 발생합니다: 너무 큰 경색 크기는 사망을 초래하거나 너무 작은 경색 크기는 실패를 초래합니다. LAD를 식별하고 결찰을 확인하기 위해 다양한 방법을 적용할 수 있습니다. 여기에서 해부 현미경을 사용하여 LAD를 찾습니다. LAD는 일반적으로 정점 부근에서 좌심실을 통해 수직으로 이어지는 얇은 빨간색 선으로 나타납니다. 선택한 결찰 위치 아래의 부위를 부드럽게 눌러 LAD를 일시적으로(시간당 ≤5초) 확대하면 LAD를 다시 확인할 수 있습니다. 결찰 후 LAD 폐색은 좌심실 전벽의 옅은 색과 몇 번의 심장 박동 내에 상당한 ST 상승으로 확인됩니다. 그런 다음 결찰이 풀리고 20초 이내에 다시 분홍색-빨간색으로 색상이 변경되고 ECG 시 ST 상승이 용해될 수 있으므로 재관류가 검증됩니다. 마지막으로 트로포닌-T 검사, TTC 염색 및 심장 초음파를 사용하여 심근 손상을 평가합니다. 이러한 여러 보험과 상호 검증을 통해 실험 결과의 신뢰성이 높습니다. 또한 미세 조작은 더 높은 정확도와 더 적은 합병증(예: 출혈)을 유도합니다. 또 다른 중요한 문제는 쥐의 혈관이 정상이라는 가정이지만 실제로 일부 관상 동맥은 크게 다르며 측부 순환조차도^23,24를 나타낼 수 있습니다. 따라서 경색 크기는 결찰이 동일한 수준으로 간주되더라도 일정하지 않은 경우가 있습니다. 현미경의 장점이 여기에 전시되어 있습니다. 결찰은 경험이나 해부학적 특징만으로 수행할 수 없습니다: 결찰 전에 LAD와 그 방향을 명확하게 확인해야 하며, 그렇지 않으면 결과를 신뢰할 수 없습니다. 일부 실험^6,8에서^, 마우스는 심장 노출 후 좌심실 및 관상 동맥의 전벽을 관찰하는 편의를 위해 오른쪽 측면 욕창 위치에 있습니다.

이 모델에는 두 가지 주요 제한 사항이 있습니다. 첫째, LAD 결찰술은 우측 관상동맥의 폐색을 시뮬레이션할 수 없습니다. 실제로, 동물 간의 해부학적 차이로 인해(²⁵), LAD는 일반적으로 생쥐와 쥐에서 심장의 정점까지 확장되며, 좌측 곡절 가지는 발달하지 않았으므로, 생쥐와 쥐의 모델은 LAD 결찰에 의해 확립된다. 토끼 및 돼지와 같은 대형 및 중형 동물의 경우 LAD가 상대적으로 짧은 반면 좌측 곡절 동맥은 심장의 넓은 영역을 덮기 때문에 모델을 설정하기 위해 좌측 곡절 동맥의 결찰을 선택합니다. Sicard et ^al.26 은 생쥐의 우측 관상동맥을 결찰하여 우심실 기능 장애 및 양심실 상호작용을 조사하는 새로운 방법을 보고했으며, 이는 이러한 한계를 해결할 수 있습니다. 두 번째 한계는 관상동맥 해부학적 구조의 가변성과 외과의사의 경험으로 인한 경색의 크기가 일정하지 않다는 것이다²⁷ . 위에서 논의한 바와 같이 현미경은 결찰 전에 LAD와 그 방향을 확인하여 일관성을 높이는 데 매우 중요하며, 숙련된 연구자의 경우 혈관 해부학을 완전히 평가한 후 결찰 위치를 조정할 수 있습니다.

언급할 가치가 있는 몇 가지 다른 문제가 있습니다. 예를 들어, 개흉술과 바늘 피어싱은 필연적으로 근육과 심근에 약간의 손상을 일으켜 염증에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 진통제는 MI²⁸에 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 따라서 염증이나 MI에 미치는 영향을 분석할 때 이러한 요인을 고려해야 합니다. 문제 해결을 위해 쥐를 죽일 수 있는 몇 가지 요인이 있습니다. 예를 들어, 심근 경색, 마취 사고 및 출혈과 관련된 합병증이 있습니다. 더욱이, 일관성 없는 결과는 주로 부적절한 결찰 위치에서 비롯됩니다: 너무 높은 결찰 위치는 생쥐 심지어 너무 큰 경색 크기를 유도할 것입니다. 한편, LAD의 잘못된 식별은 모델 실패를 초래할 수 있습니다. 이 방법에서는 몇 가지 세부 사항을 개선해야 합니다. 예를 들어, 시술 중 온도를 모니터링하기 위해 직장 프로브를 삽입할 수 있다면 더 좋을 것입니다. 마지막으로, 실험자는 동물 연구와 임상 현실의 차이점, 특히 30분 허혈 시간이 임상에 매우 짧다는 점을 명심해야 합니다. 연구자는 허혈 시간을 포함하여 실험 설계에 따라 단계를 정렬하는 것이 좋습니다. 이러한 방식으로만 이 프로토콜은 MI/MIRI 및 약물 발견의 메커니즘 및 치료 연구에 유용할 수 있습니다.

요컨대, MIRI 및 MI에 대한 간단하고 생식적인 쥐 모델이 제공됩니다. 이 모델은 MI/MIRI 메커니즘 연구 및 치료 연구에 사용할 수 있습니다.

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82070317, Jibin Lin, 81700390 8210021880 Bingjie Lv, Boyuan Wang 82000428)과 중국 국가 핵심 R & D 프로그램 (2017YFA0208000에서 Shaolin He)의 지원을 받았습니다.