Method Article
כאן אנו מתארים שיטה פשוטה וניתנת לשחזור שיכולה לגרום לאוטם שריר הלב או לפגיעה באיסכמיה של שריר הלב בעכברים על ידי קשירה מדויקת של העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי באמצעות מיקרומניפולציה.
אוטם שריר הלב חריף הוא מחלה קרדיווסקולרית נפוצה עם תמותה גבוהה. פגיעה בזילוח שריר הלב יכולה לנטרל את ההשפעות המועילות של זרימת הלב מחדש ולגרום לפגיעה משנית בשריר הלב. מודל פשוט וניתן לשחזור של אוטם שריר הלב ופגיעה באיסכמיה של שריר הלב הוא כלי טוב לחוקרים. כאן מתוארת שיטה הניתנת להתאמה אישית ליצירת מודל אוטם שריר הלב (MI) ו- MIRI על ידי קשירה מדויקת של העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי (LAD) באמצעות מיקרומניפולציה. מיקום ליגטורה מדויק וניתן לשחזור של LAD מסייע להשיג תוצאות עקביות עבור פגיעה בלב. שינויים במקטע ST יכולים לסייע בזיהוי דיוק הדגם. רמת הסרום של טרופונין T (cTnT) בסרום משמשת להערכת הפגיעה בשריר הלב, אולטרסאונד לב משמש להערכת תפקוד שריר הלב, וצביע כלוריד אוונס-בלו / טריפניל טטרזוליום משמש למדידת גודל אוטם. באופן כללי, פרוטוקול זה מקצר את משך ההליך, מבטיח גודל אוטם נשלט ומשפר את הישרדות העכבר.
אוטם חריף של שריר הלב (AMI) היא מחלה קרדיווסקולרית נפוצה ברחבי העולם ונושאת תמותה גבוהה1. ההתקדמות בטכנולוגיות הופכת רה-וסקולריזציה מוקדמת ויעילה לזמינה עבור חולי AMI. לאחר טיפולים אלה בחלק מהחולים, פגיעה איסכמיה שריר הלב (MIRI) יכולה להתרחש2. לכן, יש חשיבות רבה להבנת מנגנוני הפעולה וכיצד לשפר את MI/MIRI. עכברים נמצאים בשימוש נרחב כמודלים בגלל עלותם הנמוכה, זמן הרבייה המהיר שלהם והקלות לביצוע שינויים גנטיים3. חוקרים פיתחו שיטות שונות למדל MIRI ו-MI בבעלי חיים 4,5,6,7,8,9. אסטרטגיה זו מקדמת מחקר, אך הקריטריונים והשיטות השונות הננקטים מסבכים את פרשנות התוצאות בקרב צוותי המחקר.
בעכברים, MI נגרם על ידי isoproterenol 10, cryoinjury 11,12, או צריבה 13. MI יכול להיגרם בקלות על ידי isoproterenol, אבל התהליך הפתופיזיולוגי שונה מזה של MI קליני. MI המושרה Cryoinjury יש עקביות ירודה, מעורר נזק שריר הלב מוגזם סביב העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי (LAD), והוא יכול בקלות לגרום הפרעות קצב. MI המושרה על ידי צריבה שונה למדי מהתהליך הטבעי של אוטם שריר הלב, והתגובה הדלקתית באזור השריפה אינטנסיבית יותר; בנוסף, לגישה הניתוחית יש קשיים טכניים. יתר על כן, ישנן מעבדות14 המפתחות מודל MI במיני-חזירים באמצעות חסימת בלונים או אמבוליזציה או שיטת פקקת באמצעות טכניקה התערבותית. כל השיטות הללו יכולות לגרום לחסימת עורקים כליליים ישירות, אך הצורך במכשירי אנגיוגרפיה כלילית, ומעל לכל, העורקים הכליליים הדקים מדי של העכבר הופך פעולות אלה ללא מעשיות. עבור MIRI, ההבדלים בין דגמים שונים היו צנועים למדי, כגון שימוש במכונות הנשמה / מיקרומניפולציה או לא 5,6.
כאן מתוארת שיטה פשוטה ואמינה שיכולה לגרום ל-MI ולמודל MIRI, המותאם משיטות 4,5,6,7,8,9,15 שפורסמו בעבר. שיטה זו יכולה לדמות תהליכים פתופיזיולוגיים על ידי חסימה ישירה של LAD באמצעות קשירה. יתר על כן, על ידי הקלה על הקשירה, מודל זה יכול גם לדמות פגיעה רפרפוזיה. בפרוטוקול זה, מיקרוסקופ מנתח משמש להדמיית LAD. לאחר מכן, החוקר יכול לזהות את LAD בקלות. לאחר מכן, קשירה מדויקת של LAD מובילה לחסימת דם ניתנת לשחזור וצפויה ולאיסכמיה חדרית. יתר על כן, שינויים אלקטרוקרדיוגרפיה (ECG) ניתן להשתמש כדי לאשר איסכמיה ו reperfusion בנוסף לשינויי צבע של LAD שנצפו תחת מיקרוסקופ. אסטרטגיה זו מובילה למשך הליך קצר יותר, סיכון נמוך יותר לסיבוכים כירורגיים ופחות עכברי ניסוי הדרושים. כמו כן מתוארות השיטות לבדיקת טרופונין-T, אולטרסאונד לב וצביעה של טריפניל טטרזוליום כלוריד (TTC). בסך הכל, פרוטוקול זה שימושי למחקרים של מנגנון MI/MIR, כמו גם לגילוי תרופות.
מחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול וניצול בעלי חיים של אוניברסיטת Huazhong למדע וטכנולוגיה (ווהאן, סין).
הערה: עכברי C57BL/6J זכרים (8-10 שבועות) משמשים כמודלים. לעכברים יש גישה חופשית למזון ומים והם מגודלים בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים. החדר נשמר תחת טמפרטורה מבוקרת (22 ° C ± 2 ° C) ולחות (45%-65%). עכברים נחשפים לסביבה בהירה / כהה של 12 שעות במתקן לטיפול בבעלי חיים של בית הספר לרפואה טונג'י (ווהאן, סין) על פי ההנחיות שנקבעו על ידי מוסד זה. השתמש במכשירים מיקרוכירורגיים סטריליים ובציוד כירורגי. כפפות כירורגיות ומסכות נדרשות לאורך כל ההליך. תהליך העבודה הניסיוני מוצג באיור 1A.
1. הכנה טרום ניתוחית
2. Thoracotomy
3. קשירת LAD
הערה: ה-LAD מופיע כקו אדום דק העובר בניצב מקרוב לקודקוד ומטה דרך החדר השמאלי. ה- LAD הוא בצבע אדום בהיר, אז היזהר לא לטעות בו לווריד. בדרך כלל, אתר הקשירה הוא ~ 1-2 מ"מ מתחת לאוריקל השמאלי. תנוחת קשירה זו תייצר כ-40%-50% מהאיסכמיה בחדר השמאלי. מיקום גבוה יותר ייצור אזור אוטם נרחב יותר. אתר דיסטלי יותר ייצור אזור אוטם קטן יותר.
4. רפרפוזיה
5. טיפול לאחר הניתוח
6. אימות לאחר ההליך
תהליך העבודה הניסיוני מוצג באיור 1A. החוקר יכול לתזמן את צמתי הזמן בהתאם לתכנון הניסוי עם תחילת המחקר. משך קשירת LAD הוא בהתאם למטרת המחקר. עבור MI, המחקר יכול להתעלם משלב הרפרפוזיה. אולטרסאונד לב זמין בשלבים שונים של המחקר מכיוון שהוא אינו פולשני, בעוד צביעת אוונס-בלו / TTC יכולה להתבצע רק כאשר העכבר מוקרב. עבור מחקר המתמקד בפיברוזיס ושיפוץ חדרים, זמן התצפית ארוך בהרבה.
התמונות האופייניות לחלק מתהליך הניסוי מוצגות באיור 2A, החל מאינטובציה אנדוטרכאלית, חתך בעור, תורקוטומיה, זיהוי LAD, קשירת LAD ועד רפרפוזיה. כדי לאמת איסכמיה ורפרפוזיה של שריר הלב, תמונות האק"ג המייצגות עם העלאת ST משמעותית לאחר קשירה ופירוק של ST-elevation כאשר החלקה אינה קשורה מוצגות באיור 2B.
לאחר קבלת דגימות דם מכל העכברים, ניתן לבצע את בדיקת טרופונין-T כדי לאמת אוטם. איור 3A מראה עלייה משמעותית של cTnT בקבוצות MIRI ו-MI בהשוואה לקבוצות דמה. איור 3B מדגים את הצביעה הכפולה של אוונס-בלו ו-TTC במשך חמישה חתכים רוחביים רצופים של הלב בין קבוצת הדמה לקבוצת MIRI. האזור הכחול מרמז על האזור הנורמלי, האזור הלבן מרמז על אזור אוטם שריר הלב, והאזור האדום מרמז על האזור האיסכמי אך לא אוטם. איור 3C מייצג את התמונות ארוכות הציר של אולטרסאונד לב בין קבוצת הדמה לקבוצת MI. ניתן להשתמש ביישומי תוכנה כדי לחשב פרמטרים פונקציונליים שונים, כגון ערך גבוה יותר של מקטע פליטה עבור קבוצת הדמה באיור 3C בהשוואה לזה שבקבוצת MI.
איור 1: מערך כירורגי. (A) סקירה כללית של ציר הזמן של הניסוי. (B) שולחן ניתוחים עם כרית חימום שחוממה מראש וחיבור לאלקטרודות אק"ג. (ג) מחזירים תוצרת בית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שינויים בתהליך הניסוי ובאק"ג. (A) תמונות של אינטובציה אנדוטרכאלית, חתך בעור, בית החזה, זיהוי LAD, קשירת LAD ורפרפוזיה מוצגות ב-1, 2, 3, 4, 5 ו-6, בהתאמה. (B) תמונות אק"ג אופייניות של MI ו-MIRI לאחר קשירה ורפרפוזיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תיקוף לאחר ההליך. (A) ביטוי של טרופונין לבבי בקרב קבוצות דמה, MIRI 24 h, ו-MI 3 d. (B) אוונס -כחול / TTC צביעה כפולה עבור קבוצות sham ו- MIRI 24 שעות. (C) אולטרסאונד לב לקבוצות דמה ו-MI. LVID; D, ממד פנימי של החדר השמאלי הדיאסטולי הסופי; LVID; S, ממד פנימי של החדר השמאלי הסיסטולי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
בשנים האחרונות, יצירת מודלים עבור MI ו- MIRI במחקר קליני ומדעי התפתחה במהירות20,21. עם זאת, יש עדיין כמה שאלות, כגון מנגנוני הפעולה וכיצד לשפר MI / MIRI, כי יש לפתור. כאן מתואר פרוטוקול שונה להקמת מודל מורין של MI ו- MIRI. יש לשקול בזהירות מספר נקודות מפתח.
נקודת המפתח הראשונה היא אינטובציה אנדוטרכאלית. חלק מההליכים6,9 כוללים חתך של עור צוואר הרחם, הפרדת רקמות, ואחריו חשיפה של שריר sternohyoideus כדי לראות את קנה הנשימה. בדרך זו, החוקר יכול לדמיין החדרת צינור לתוך קנה הנשימה. זהו צעד טוב להפחתת הסיכון למצוקה נשימתית. בשיטה הנוכחית, החוקר יכול לדמיין בבירור את הסגירה והפתיחה של הגלוטיס עם נשימה תחת מאיר ולאחר מכן להכניס את הצינור לתוך קנה הנשימה בקלות. לפיכך, חתך צוואר הרחם אינו נעשה כדי להפחית טראומה בעור וזיהומים פוטנציאליים, אשר חשוב במחקר על איתות דלקתי. לרינגוסקופים חזותיים נמצאים בשימוש נרחב באינטובציה קלינית בקנה הנשימה: אולי ניתן להשתמש בהם גם בעכברים. Mares et al.22 דיווחו על הרדמה רציפה בשאיפת מסכה ללא אינטובציה אנדוטרכאלית, שבוצעה על ידי שאיפת איזופלורן 2% לאחר אינדוקציה איזופלורנית של 5% עם חמצן שניתן דרך מסכה לא פולשנית שהונחה על האף והפה של החיה. זה יכול למנוע נזק לרקמות ולשפר את הבטיחות והיעילות של הרדמה. עם זאת, יש צורך במכונת הרדמה מיוחדת בשאיפה. יתר על כן, חומרי הרדמה נדיפים עלולים לגרום נזק פיזי למפעיל.
נקודת המפתח השנייה והחשובה ביותר היא זיהוי וקשירה של LAD. כל טעות בזיהוי וקשירת LAD תוביל לתוצאות לא עקביות: או גודל אוטם גדול מדי הגורם למוות או גודל אוטם קטן מדי המביא לכישלון. ניתן ליישם שיטות שונות כדי לזהות את LAD ולאמת את קשירתו. כאן, מיקרוסקופ דיסקציה משמש כדי לאתר את LAD. ה- LAD מופיע בדרך כלל כקו אדום דק העובר בניצב מקרוב לקודקוד ומטה דרך החדר השמאלי. על ידי לחיצה עדינה על האתר מתחת למיקום הקשירה שנבחר כדי להגדיל את ה- LAD באופן זמני (≤5 שניות בכל פעם), ניתן לבדוק שוב את ה- LAD. לאחר הקשירה, חסימת LAD מאומתת על ידי צבע חיוור יותר בדופן הקדמית של החדר השמאלי והגבהת ST משמעותית תוך מספר פעימות לב. לאחר מכן, הקשירה אינה קשורה, והרפרפוזיה מאומתת על ידי שינוי צבע בחזרה לוורוד-אדום תוך 20 שניות ופירוק פוטנציאלי של גובה ST באק"ג. לבסוף, בדיקת טרופונין-T, צביעת TTC ואולטרסאונד לב משמשים להערכת הפגיעה בשריר הלב. ביטוחים מרובים אלה ואימותים הדדיים הופכים את תוצאות הניסוי לאמינות ביותר. יתר על כן, מיקרומניפולציה מעוררת דיוק גבוה יותר ופחות סיבוכים (למשל, דימום). נושא חשוב נוסף הוא ההנחה כי כלי הדם של עכברים הם נורמליים, אבל למעשה, כמה עורקים כליליים להשתנות מאוד, ואפילו זרימת בטחונות יכול להציג23,24. לפיכך, גדלי האוטם לעיתים אינם עקביים למרות שהקשירות נחשבות באותה רמה. היתרונות של המיקרוסקופ מוצגים כאן. קשירה לא יכולה להיעשות רק על סמך ניסיון או ציוני דרך אנטומיים: יש לאמת את ה- LAD ואת כיוונו בבירור לפני הקשירה אחרת, התוצאות לא יהיו אמינות. בחלק מהניסויים6,8, עכברים נמצאים במצב דקוביטוס צדדי ימני לנוחות התבוננות בדופן הקדמית של החדר השמאלי והעורקים הכליליים לאחר חשיפה ללב.
למודל זה שתי מגבלות עיקריות. ראשית, קשירת LAD אינה יכולה לדמות חסימה של העורק הכלילי הימני. למעשה, בשל הבדלים אנטומיים בין בעלי חיים25, LAD בדרך כלל משתרע על קודקוד הלב בעכברים וחולדות, ואת ענפי circumflex השמאלי אינם מפותחים, ולכן המודלים בעכברים וחולדות נקבעים על ידי קשירת LAD. עבור בעלי חיים גדולים ובינוניים כגון ארנבות וחזירים, עורק ה- LAD קצר יחסית, ואילו עורק ה- circumflex השמאלי מכסה שטח גדול של הלב, ולכן קשירה של עורק ה- circumflex השמאלי נבחרת כדי לבסס את המודל. Sicard et al.26 דיווחו על שיטה חדשנית לחקר תפקוד לקוי של החדר הימני ואינטראקציה דו-חדרית על ידי קשירת העורק הכלילי הימני בעכברים, אשר יכולה לתקן מגבלה זו. המגבלה השנייה היא גודל אוטם לא עקבי עקב שונות באנטומיה של העורקים הכליליים27 וניסיונו של המנתח. כפי שפורט לעיל, המיקרוסקופ חשוב מאוד להגברת העקביות על ידי אימות ה- LAD וכיוונו לפני הקשירה, ולחוקר מנוסה, ניתן להשיג התאמת תנוחת הקשירה לאחר הערכה מלאה של אנטומיה וסקולרית.
כמה נושאים אחרים ראויים לאזכור. לדוגמה, כריתת בית החזה ופירסינג במחטים יגרמו בהכרח לנזק קל לשרירים ולשריר הלב, מה שעשוי להשפיע על הדלקת. בנוסף, דווח על משככי כאבים שיש להם השפעות על MI28. לפיכך, גורמים אלה חייבים להילקח בחשבון בעת ניתוח דלקת או השפעותיה על MI. לפתרון בעיות, ישנם מספר גורמים שיובילו למוות עכברים. לדוגמה, סיבוכים הקשורים לדלקת שריר הלב, תאונה הרדמה ודימום. יתר על כן, התוצאות הלא עקביות נובעות בעיקר מתנוחות קשירה לא מתאימות: תנוחת קשירה גבוהה מדי תגרום לגודל אוטם גדול מדי אפילו למוות עכברים; בינתיים, הזיהוי הכוזב של LAD יגרום לכשל במודל. כמה פרטים צריכים להיות משופרים בשיטה זו. לדוגמה, עדיף אם בדיקה רקטלית ניתן להכניס כדי לפקח על הטמפרטורה במהלך ההליך. אחרון חביב, על הנסיין לזכור את ההבדלים בין מחקרים בבעלי חיים לבין המציאות הקלינית, במיוחד שזמן איסכמיה של 30 דקות הוא אכן קצר למדי עבור מחקרים קליניים. אנו מעודדים את החוקר לארגן את השלבים בהתאם לתכנון הניסוי שלו, כולל זמן האיסכמיה. רק בדרך זו פרוטוקול זה יכול להיות שימושי למחקרים על המנגנון והטיפול ב- MI/MIRI וגילוי תרופות.
בקיצור, מודל מורין פשוט ורבייה עבור MIRI ו- MI מסופק. מודל זה יכול לשמש לחקר מנגנוני MI/MIRI ולמחקר טיפולי.
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82070317, 81700390 לג'יבין לין, 8210021880 לבינג'יה LV ו-82000428 לבויואן וואנג) ותוכנית המו"פ הלאומית של סין (2017YFA0208000 לשאולין הא).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.9 % sodium chloride solution | Kelun Industry Group,China | - | |
4% paraformaldehyde fixing solution | Servicebio,China | G1101 | - |
4-0 silk suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | C412 | - |
8-0 suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | H801 | - |
Buprenorphine | IsoReag,China | IR-11190 | - |
Camera | Canon,Japan | EOS 80D | - |
Depilatory cream | Veet,French | - | |
Elecsys Troponin T hs STAT | Roche,Germany | - | |
Electrochemical luminescence immunoanalyzer | Roche,Germany | Elecsys 2010 | - |
Evans blue | Sigma,America | E2129 | - |
Eye scissors | Shanghai Medical Instruments,China | JC2303 | - |
Haemostatic forceps | Shanghai Medical Instruments,China | J31020 | - |
High frequency in vivo imaging systems | Visualsonics,Canada | Vevo2100 | - |
Ibuprofen | PerFeMiKer,China | CLS-12921 | - |
Intravenous catheter | Introcan,Germany | 4254090B | - |
Ketamine | Sigma-Aldrich,America | K2753 | - |
Medical alcohol | Huichang ,China | - | |
Microneedle holders | Shanghai Medical Instruments,China | WA2040 | - |
Microscopic shears | Shanghai Medical Instruments,China | WA1040 | - |
Microsurgical forceps | Shanghai Medical Instruments,China | WA3020 | - |
Mouse electrocardiograph | Techman,China | BL-420F | - |
Needle holders | Shanghai Medical Instruments,China | JC3202 | - |
operating floor | Chico,China | ZK-HJPT | - |
PE-10 tube | Huamei,China | - | |
Pentobarbital | Merck,America | 1030001 | - |
Rodent Ventilator | Shanghai Alcott Biotech,China | ALC-V8S-P | - |
Stereo microscope | Aomei Industry,China | SZM0745-STL3-T3 | - |
Surgical thermostatic heating pad | Globalebio, China | GE0-20W | - |
Triphenyltetrazolium chloride | Servicebio,China | G1017 | - |
Xylazine | Huamaike Biochemicals and Life Science Research Prouducts,China | 323004 | - |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved