小鼠心肌梗死和心肌缺血再灌注损伤的诱导

在这里，我们描述了一种简单且可重复的方法，该方法可以通过显微操作精确结扎左前降支冠状动脉来诱导小鼠心肌梗死或心肌缺血再灌注损伤。

急性心肌梗死是一种常见的心血管疾病，死亡率很高。心肌再灌注损伤可以抵消心脏回流的有益作用，诱发继发性心肌损伤。简单且可重复的心肌梗死和心肌缺血再灌注损伤模型是研究人员的良好工具。在这里，描述了一种通过显微操作精确结扎左前降支冠状动脉 （LAD） 来创建心肌梗死 （MI） 模型和 MIRI 的可定制方法。LAD 的准确且可重复的结扎定位有助于获得一致的心脏损伤结果。ST 段更改有助于识别模型准确性。血清心肌肌钙蛋白T（cTnT）水平用于评估心肌损伤，心脏超声用于评估心肌收缩功能，Evans-Blue/三苯基氯化四氮唑染色用于测量梗死面积。一般来说，该协议减少了手术时间，确保了可控的梗死大小，并提高了小鼠的存活率。

急性心肌梗死 （AMI） 是全球常见的心血管疾病，死亡率很高¹.技术的进步使AMI患者可以进行早期有效的血运重建。在一些患者进行这些治疗后，可能会发生心肌缺血再灌注损伤 （MIRI）²。因此，了解MI/MIRI的作用机制和改善MI/MIRI具有重要意义。小鼠因其成本低、繁殖时间短且易于进行基因改变而被广泛用作模型³.学者们开发了不同的方法来模拟动物⁴、^5、6、⁷、^8、9 的 MIRI 和 MI。这种策略促进了研究，但采用的不同标准和方法使研究团队对结果的解释变得复杂。

在小鼠中，异丙肾上腺素 10、冷冻损伤^11,12 或烧灼¹³ 诱导了心肌梗死。异丙肾上腺素易诱发心肌梗死，但病理生理过程与临床心肌梗死不同。 冷冻损伤诱发的心肌梗死一致性差，引起左冠状动脉前降支（left anterior lower coronary artery，LAD）周围过度心肌损伤，易诱发心律失常。烧灼诱发的心肌梗死与心肌梗死的自然过程有很大不同，烧灼部位的炎症反应更强烈;此外，手术方法存在技术困难。此外，还有一些实验室¹⁴ 通过介入技术使用球囊阻塞或栓塞或血栓形成方法在小型猪中开发 MI 模型。所有这些方法都可能直接导致冠状动脉闭塞，但需要冠状动脉造影设备，尤其是太薄的小鼠冠状动脉使这些手术不切实际。对于MIRI，不同模型之间的差异非常小，例如是否使用呼吸器/显微操作^5,6。

在这里，描述了一种简单可靠的方法可以诱导MI和MIRI模型，该模型改编自先前发表的方法4,5,6,7,8,9,15。该方法可以通过结扎直接阻断LAD来模拟病理生理过程。此外，通过解除结扎，该模型还可以模拟再灌注损伤。在该协议中，解剖显微镜用于LAD可视化。然后，研究人员可以很容易地识别 LAD。随后，LAD的准确结扎导致可重复和可预测的血液闭塞和心室缺血。此外，除了在显微镜下观察到的 LAD 颜色变化外，心电图 （ECG） 变化还可用于确认缺血和再灌注。这种策略导致更短的手术时间，更低的手术并发症风险，以及更少的实验小鼠。还描述了肌钙蛋白-T 试验、心脏超声和氯化三苯基四唑 （TTC） 染色的方法。总体而言，该方案可用于MI / MIR机制的研究以及药物发现。

动物研究已获得华中科技大学（中国武汉）动物护理和利用委员会的批准。

注:雄性C57BL / 6J小鼠（8-10周）用作模型。小鼠可以自由获取食物和水，并在特定的无病原体条件下繁殖。房间保持在受控温度（22°C±2°C）和湿度（45%-65%）下。根据该机构制定的指南，将小鼠暴露在同济医学院（中国武汉）动物护理设施的12小时光/暗环境中。使用无菌显微手术器械和手术用品。在整个手术过程中需要戴上外科手套和口罩。实验工作流程如图 1A所示。

1.术前准备

1. 在整个外科手术过程中，使用带有预热加热垫（37°C）的矩形手术台（OT）（图1B）。在程序开始之前，用紫外线和 70% 酒精对电路板进行消毒。
2. 准确称量所有小鼠以计算所需麻醉药物的剂量。然后，通过腹膜内注射用氯胺酮（80mg / kg）和甲苯噻嗪（10mg / kg）麻醉小鼠。通过没有对脚趾捏合和眨眼反射的退缩反射来确保适当的麻醉深度。
3. 将鼠标仰卧在OT上，头部下方有纱布，以免眼睛过热。将眼药膏涂抹在眼睛上，以防止眼睛干燥。
4. 用电动剃须刀剃掉左心前区胸部的皮毛。在剃须前的胸部使用毛发去除霜，并用无菌棉签均匀按摩~1分钟。用纱布擦拭多余的松散皮毛。
5. 使用聚维酮碘，然后使用70%的酒精清洁该区域。用纱布覆盖胸部。
6. 在上切牙下方使用 4-0 缝合线并将其固定在锚点（靠近鼻子上方的 OT 边缘），以保持嘴巴略微张开并促进插管。
7. 拉动尾巴以保持身体笔直，然后用胶带将尾巴固定在 OT 上。固定四肢并将它们拧紧在其他锚点上。重要的是，不要过度伸展前肢;否则，可能会发生呼吸功能损害。
8. 使用弯曲的镊子和镊子打开下颌并抬起舌头。使用照明器清楚地观察喉咙和声门。
9. 用钝头和截短的针头轻轻地将 22 G 套管插入气管，通过喉咙下方 ~1 厘米的嘴。用一只手握住舌头，用钝镊子将其稍微向上移动，同时用另一只手轻轻地将管子插入气管。小心不要将管子插入食道。
10. 轻轻取下针头。在连接到呼吸机之前，将管子放入水中以形成气泡来检查插管。
11. 将气管插管连接到设置为 120/min 的呼吸机，并将潮气量调节为 250 μL。
    注意: 呼吸机设置根据体重进行调整（一般来说，较高的体重需要较高的潮气量）。
12. 通过检查双侧对称性胸廓扩张来验证插管。然后，用胶带将连接固定在OT上，以避免管子脱落。
13. 将心电图电极放在爪子上并将它们连接到心电图记录仪。在整个手术过程中监测心脏电生理学。

2. 开胸手术

1. 取下胸部的纱布。用 70% 酒精再次对切口区域进行消毒，使用三个擦洗周期。然后，用无菌手术单盖住小鼠，在手术区域上开一个孔，以减少手术部位的污染。
2. 用无菌手术刀沿左锁骨中线做一个倾斜的皮肤切口（0.8-1.0厘米）。
3. 对皮下组织进行钝性解剖，露出下面的肋骨。注意不要伤害血管、肋骨和肺部。使用无菌棉涂抹器止血。
4. 识别并在第三肋间隙做一个约 6-8 毫米的切口。然后，在沿海空间进行组织钝性解剖以打开胸腔。注意不要伤到胸内动脉。
5. 使用镊子跨越肋间隙。将预先灭菌的自制牵开器（图1C）插入肋骨架并向后拉，将切口扩散至~6mm宽。用橡皮筋将牵开器连接到 OT 上。
6. 小心地去除周围的组织，使心脏完全暴露。用弯曲的镊子轻轻拉出心包，而不会伤害心脏。现在可以清楚地看到心脏。

3. LAD结扎

注意:LAD 显示为一条细红线，从心尖附近垂直向下穿过左心室。LAD是鲜红色的，所以要注意不要把它误认为是静脉。通常，结扎部位位于左耳廓下方~1-2毫米处。这种结扎位置会产生左心室约40%-50%的缺血。较高的位置将产生更广泛的梗死区。更远端的部位将产生更小的梗死区。

1. 使用解剖显微镜并引导聚焦且适当的光线进行 LAD 可视化。轻轻按压所选结扎位置下方的部位以暂时扩大LAD（每次≤5秒）。以这种方式重新检查 LAD。
2. 使用锥形针（3/8,2.5 x 5）通过 8-0解剖显微镜下LAD下方的丝绸结扎。注意针头深度:不要太深而无法进入左心室，也不要太浅，以免损坏LAD。
3. 用松散的双结系紧结扎。环直径约为 2-3 毫米。
4. 将 2-3 mm PE-10 管放入平行于动脉的环中。
5. 轻轻收紧结扎环，直到它绕过动脉和管道。然后，用滑结固定环。注意不要因过度收紧压力而损坏心肌壁。
   注意:假手术组不进行结扎。
6. 确认LAD血流停止:结扎后左心室前壁颜色变浅。此外，几次心跳内显著的ST段抬高也提示闭塞¹⁶。如果需要永久结扎（例如，MI），请取下 PE-10 管并直接用结将 LAD 系好。按照下面的步骤 4.3 中所述恢复其余过程。
7. 从切口上取下牵开器。然后，用斗牛犬夹暂时闭合伤口。缺血持续时间根据实验设计。确保鼠标继续连接到呼吸机。

4. 再灌注

1. 当缺血期结束时，取下斗牛犬夹并再次插入牵开器以打开切口并暴露心脏（尤其是结扎部位）。
2. 解开滑结并取下 PE-10 管。通过观察颜色在 20 秒内变回粉红色来确认此步骤中血流的恢复。同时，仔细观察心电图:ST 段抬高的潜在溶解也提示再灌注。
3. 离开 8-0 原 位结扎用于随后的 Evans-Blue 和 TTC 染色。在其他情况下，请在此步骤中移除缝合线。
4. 取出牵开器，用4-0尼龙缝合线缝合第三和第四肋骨，闭合切口。注意不要伤到肺部。在系紧缝合结的同时轻轻按压胸部，将可能滞留在胸腔中的空气推出。
5. 用连续缝合线闭合肌肉层。用 4-0 尼龙缝合线闭合皮肤;连续缝合和间断缝合是可以接受的。

5. 术后护理

1. 仔细观察鼠标是否有从麻醉中恢复的迹象，例如尾巴或胡须的运动。之后，小鼠通常会恢复正常的呼吸模式，呼吸频率约为 150 bpm。通过缓慢取出管子来拔管小鼠。
2. 再观察鼠标 3-5 分钟，以确保没有呼吸窘迫。
3. 在小鼠开始呼吸后给予100μL丁丙诺啡（0.1mg / mL，皮下注射）。在接下来的 24 小时内，每 4-6 小时提供额外剂量。在手术前 2 天和手术后 ≤7 天以 0.2 mg/mL 溶液的形式在饮用水中提供布洛芬作为额外的疼痛缓解剂。
4. 通过使用隔热毯保持小鼠温暖并降低死亡风险，因为小鼠在麻醉后容易体温过低。

6. 程序后的验证

1. 肌钙蛋白-T检测
   1. 从眶后神经丛收集血样，并通过离心（3,000× g，10分钟，室温）分离血清。
   2. 用生理盐水将 20 μL 血清稀释至 100 μL，用于肌钙蛋白 T 测试。将剩余的样品储存在-80°C。
   3. 按照制造商的说明使用商业试剂盒检测肌钙蛋白 T （cTnT。
2. 心脏超声
   注:根据实验设计^17,18，心脏超声用于评估手术前后不同阶段的^心脏功能和室壁运动异常。测量不同的参数，如心室壁厚、心室容积、心室腔直径、射血分数和短轴缩短分数。
   1. 通过腹膜内注射用氯胺酮（80mg / kg）和甲苯噻嗪（10mg / kg）麻醉小鼠。
   2. 用电动剃须刀剃掉胸部。使用脱毛霜并均匀按摩。用纱布擦拭多余的松散皮毛。
   3. 将鼠标放在 OT 上并用胶带固定四肢。
   4. 将超声探头 （30 MHz） 放在与胸骨成 ~ 30° 的心脏前部区域。该视图中的探头与心脏的长轴对齐。将超声波设置为 B模式;左心室、左心房、二尖瓣和升主动脉可以清晰识别。使用视频采集获取数据，以便后续分析。
   5. 通过顺时针旋转换能器90°，获得肌水平的胸骨旁短轴视图，以清晰检测左右心室。然后使用 B 模式 和 M 模式 评估心脏功能和形态测量。
   6. 通过在超声图像中指定相应的位置来计算左心室舒张末期直径 （Dd）、收缩末期直径 （Ds） 和室间隔厚度。
      注意:机器将手动计算左心室舒张末期容积 （LVEDV） 和收缩末期容积 （LVESV）。此外，机器将使用公式 FS = （Dd-Ds）/Dd × 100% 和 EF= （LVEDV-LVESV）/LVEDV × 100% 计算缩短分数 （FS） 和射血分数 （EF） 的值。选择五个连续的心动周期并获得其平均值。
3. 心肌梗死大小的测量
   注:Evans-Blue/TTC 染色用于测量梗死大小，因为它可以评估组织活力¹⁹。建议在再灌注后 72 小时内染色，因为疤痕会缩小。通过腹膜内注射用200mg / kg戊巴比妥钠对动物实施安乐死后，进行此步骤。
   1. 按照步骤 2.2-2.5 中的先前程序再次暴露心脏。然后，在所需的再灌注持续时间结束时，在步骤 4.3 中提到的缝合线验证的初始部位重新结扎 LAD。
   2. 插管主动脉，然后用 0.3 mL 的 1% Evans Blue 溶液灌注心脏。非缺血区域的心肌被染成蓝色。灌注后，用剪刀剪开主动脉，迅速切除心脏。
   3. 然后，用KCl溶液（30mM）清洗心脏以停止心脏跳动。除去周围脂肪组织后，在-20°C下储存≥4小时。
   4. 使用锋利的手术刀将心脏横向切成五片厚度为1毫米的切片。称量切片，然后在37°C下用2%TTC孵育40分钟。
      注意:孵育后，梗死区域被划定为白色，而非梗死区域的活组织保持红色。
   5. 用4%甲醛固定切片过夜。
      注意:此操作将增强梗死区域和非梗死区域之间的对比度。它还会缩小切片。
   6. 用数码相机拍摄切片。然后，使用图形软件计算危险面积 （AAR）、梗死面积和非缺血区。
      注意:Evans-Blue/TTC 双染色后，蓝色区域为"正常"区域。其余区域（包括白色和红色）是"缺血风险"区域:白色区域是心肌梗死区域（IA），红色区域是缺血（但未梗死）区域。考虑到心形切片大小的不一致，根据重量调整结果。
      
      分配:
      A1-A5为梗死区面积/心脏切片面积;
      B1-B5 为非梗死区面积/心脏切片面积;
      W1-W5 表示心形切片的重量。
      
      然后:
      梗死心肌总重量:W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5;
      非梗死心肌总重量:W1 × B1 + W2 × B2 + W3 × B3 + W4 × B4+ W5 × B5;
      AAR 总重量 = （W1 + W2 +W3 + W4 + W5） - （W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5）
      
      最后:
      心肌缺血面积计算为左心室中AAR的百分比:
      
      心肌梗死的面积计算为 AAR 中 IA 的百分比:
      

实验工作流程如图 1A所示。研究开始后，研究者可以根据实验设计安排时间节点。LAD结扎的持续时间取决于研究目的。对于心肌梗死，研究可以忽略再灌注步骤。心脏超声可在研究的不同阶段进行，因为它是非侵入性的，而 Evans-Blue/TTC 染色只能在小鼠被处死时进行。对于专注于纤维化和心室重塑的研究，观察时间要长得多。

部分实验过程的典型图像如图 2A所示，从气管插管、皮肤切口、开胸手术、LAD鉴定、LAD结扎到再灌注。为了验证心肌缺血和再灌注，图 2B显示了结扎后ST段抬高和滑结解开时ST段抬高溶解后具有显着ST段抬高的代表性心电图图像。

从所有小鼠获得血液样本后，可以进行肌钙蛋白-T测试以验证梗死。 图3A 显示与假手术组相比，MIRI和MI组的cTnT显著增加。 图 3B 显示了假手术组和 MIRI 组之间连续五个心脏横切面的 Evans-Blue 和 TTC 双重染色。蓝色区域表示正常区域，白色区域表示心肌梗死区域，红色区域表示缺血但未梗死区域。 图3C 表示假手术组和心肌梗死组的心脏超声长轴图像。软件应用程序可用于计算不同的功能参数，例如与MI组相比， 图3C 中假手术组的射血分数值更高。

图 1:手术设置。 （A） 实验时间表概述。（B） 带有预热加热垫和心电图电极连接的手术台。（C） 自制牵开器。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:实验过程和心电图变化。 （A）气管插管、皮肤切开、开胸、LAD鉴定、LAD结扎、再灌注等图像分别见1、2、3、4、5、6。（B） 结扎和再灌注后 MI 和 MIRI 的典型心电图图像。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:手术后的验证。 （A） 假手术组、MIRI 24 h组和MI 3 d组心肌肌钙蛋白的表达。（B） Evans -Blue/TTC 双染色假组和 MIRI 组 24 小时。（C） 假手术组和心肌梗死组的心脏超声检查。LVID;d， 舒张末期左心室内部尺寸;LVID;s，收缩期左心室内部尺寸。 请点击这里查看此图的较大版本.

近年来，MI和MIRI模型在临床和科学研究中的创建发展迅速^20,21。然而，仍有一些问题需要解决，例如作用机制和如何改善MI/MIRI。在这里，描述了用于建立MI和MIRI小鼠模型的修改方案。必须仔细考虑几个关键点。

第一个关键点是气管插管。一些程序^6,9 涉及切开颈椎皮肤、组织分离^，然后暴露胸骨舌肌以观察气管。通过这种方式，研究人员可以可视化管子插入气管的情况。这是降低呼吸窘迫风险的好步骤。在目前的方法中，研究人员可以在照明器下通过呼吸清楚地看到声门的闭合和打开，然后轻松地将管子插入气管。因此，宫颈切口不是为了减少皮肤创伤和潜在的感染，这在炎症信号传导的研究中很重要。可视喉镜广泛用于临床气管插管:也许它们也可以用于小鼠。Mares等人²²报道了在没有气管插管的情况下连续面罩吸入麻醉，这是在5%异氟烷诱导后吸入2%异氟醚进行的，氧气通过放置在动物鼻子和嘴巴上的非侵入性面罩给氧。它可以避免组织损伤，提高麻醉的安全性和效率。但是，需要特殊的吸入麻醉机。此外，挥发性麻醉剂会对操作者造成身体伤害。

第二个也是最重要的关键点是LAD的鉴定和连接。LAD识别和结扎中的每一个错误都会导致不一致的结果:要么梗死面积过大导致死亡，要么梗死面积过小导致失败。可以应用各种方法来鉴定 LAD 并验证其连接。在这里，解剖显微镜用于定位LAD。LAD通常表现为一条细红线，从心尖附近垂直向下穿过左心室。通过轻轻按压所选结扎位置下方的部位以暂时扩大 LAD（每次 ≤5 秒），可以再次检查 LAD。结扎后，左心室前壁颜色变浅，几次心跳内出现明显的ST段抬高，证实了LAD闭塞。然后，解开结扎，并通过在 20 秒内变回粉红色和心电图上 ST 段抬高的潜在溶解来验证再灌注。最后，采用肌钙蛋白T试验、TTC染色和心脏超声评估心肌损伤。这些多重保险和相互验证使实验结果具有高度的可靠性。此外，显微操作可提高准确性并减少并发症（例如出血）。另一个重要的问题是假设小鼠的血管是正常的，但实际上，一些冠状动脉差异很大，甚至侧支循环也可以呈现^23,24。因此，即使结扎被认为处于同一水平，梗死大小有时也不一致。这里展示了显微镜的优点。结扎不能仅根据经验或解剖标志进行:结扎前必须清楚地验证 LAD 及其方向，否则结果将不可靠。在一些实验^6,8中^，小鼠处于右侧卧位，以方便观察心脏暴露后左心室和冠状动脉的前壁。

此模型有两个主要限制。首先，LAD结扎不能模拟右冠状动脉的闭塞。事实上，由于动物之间的解剖学差异^25，LAD通常延伸到小鼠和大鼠的心脏顶点，并且左回旋支不发达，因此通过LAD结扎建立小鼠和大鼠的模型。对于兔子、猪等大中型动物，LAD相对较短，而左回旋动脉覆盖心脏面积较大，因此选择结扎左回旋动脉建立模型。Sicard等人²⁶ 报道了一种通过结扎小鼠右冠状动脉来研究右心室功能障碍和双心室相互作用的新方法，该方法可以弥补这一局限性。第二个限制是由于冠状动脉解剖结构的可变性²⁷ 和外科医生的经验，梗死大小不一致。如上所述，显微镜对于通过在结扎前验证LAD及其方向来提高一致性非常重要，对于有经验的研究人员来说，可以在对血管解剖结构进行完整评估后调整结扎位置。

其他一些问题值得一提。例如，开胸手术和穿刺不可避免地会对肌肉和心肌造成轻微损伤，这可能会对炎症产生影响。此外，据报道，镇痛剂对MI²⁸有影响。因此，在分析炎症或其对心肌梗死的影响时，必须考虑这些因素。对于故障排除，有几个因素会导致小鼠死亡。例如，与心肌梗塞、麻醉意外和出血相关的并发症。而且，结果不一致主要来自结扎位置不合适:结扎位置过高会导致梗死面积过大甚至小鼠死亡;同时，LAD的错误识别会导致模型失败。这种方法中的一些细节需要改进。例如，如果可以插入直肠探头以在手术过程中监测温度，那就更好了。最后但并非最不重要的一点是，实验者应该牢记动物研究与临床现实之间的差异，尤其是 30 分钟的缺血时间对于临床来说确实很短。我们鼓励研究人员根据他们的实验设计安排步骤，包括缺血时间。只有这样，该方案才能用于MI / MIRI的机制和治疗以及药物发现的研究。

简而言之，提供了MIRI和MI的简单繁殖小鼠模型。该模型可用于MI/MIRI机制的研究和治疗研究。

作者声明没有利益冲突。

这项工作得到了中国国家自然科学基金（82070317,81700390林继斌，8210021880吕冰杰，82000428王博元）和国家重点研发计划（2017YFA0208000给何少林）的支持。