시험관 에서 미세 유체 질환 모델 전체 혈액 내피 상호 작용 및 혈전 역학을 실시간으로 연구

우리는 환자 유래 내피와 전혈 상호 작용을 조사하기 위하여 체외 혈관 질병 모형을 제시합니다. 이 시스템은 다양한 상황에서 1 차적인 내피 세포의 혈전 생성 특성의 연구를 허용합니다. 이 방법은 응고의 상이한 단계 도중 시혈전증 및 항응고 요법에서 평가하기위하여 특히 적합합니다.

혈전의 형성은 내피 세포, 그들의 근본적인 매트릭스, 각종 혈액 세포 및 단백질 사이 복잡한 상호 작용을 관련시킵니다. 내피는 혈소판 응집, 응고 및 세혈을 제어하는 많은 주요 혈전 성 분자의 주요 소스입니다. 혈전증의 기계장치가 수십 년 동안 조사되었지만, 체외 연구는 주로 체내 성 매트릭스가 노출되는 혈관 손상의 상황 또는 단일 혈액 성분을 가진 세포 간의 상호 작용에 초점을 맞춥니다. 우리의 방법은 전혈과 손상되지 않은, 컨할 수 있는 혈관 세포 네트워크 사이의 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

1 차적인 인간 내피 세포를 이용함으로써, 이 프로토콜은 혈전 역학에 내피 세포의 영향을 연구하고 혈전증 질병의 병생리학에 귀중한 통찰력을 제공하는 유일한 기회를 제공합니다. 맞춤형 미세 유체 흐름 채널을 사용하면 질병별 혈관 기하학을 적용하고 특정 형태학적 혈관 변화를 모델링할 수 있습니다. 혈소판 부착 및 피브린 증착을 특징으로 하는 혈소판 의 발달은 실시간으로 기록된다. 변경된 혈전 역학에서 내피 기능의 효과는 특정 분자의 면역 형광 염색을 통해 사후 분석에 의해 결정됩니다.

대표적인 결과는 실험 적인 설정, 데이터 수집 및 데이터 분석을 설명합니다. 연구 질문에 따라 세포 유형, 전단 속도, 채널 지오메트리, 약물 치료 및 사후 분석 절차를 포함하여 모든 섹션에 대한 매개 변수를 조정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 만성 혈전색전성 질환 환자의 폐 동맥 내피성상에 혈전 형성을 정량화함으로써 검증된다.

내피는 혈관의 내세포 층을 형성하고 주변 조직으로부터 혈액을 분리합니다. 그것은 적극적으로 마이크로 환경을 조절하고 외부 자극^1에반응동적 기관으로 설명되었다. 흐르는 혈액과의 직접적인 접촉으로 인해 내피는 혈전및 혈전증의 조절에 중추적인 역할을 하며 혈소판 응집, 응고 및 세혈^2를제어하는 많은 주요 규제 분자의 주요 공급원입니다. 건강하고, 비활성화되지 않는 내피 세포(EC)는 혈소판 활성화를 중화하고 프로스타시클린, 혈전보모둘린 또는 조직 인자 통로 억제제(TFPI)^2,3과같은 혈류를 유지하기 위해 응고 및 혈전 형성을 방지하는 여러^{분자를 생산한다.} 이것은 혈소판, 혈소판 응집 및 혈전 형성의 접착을 방지합니다. 혈관 벽의 부상 또는 활성화는 국소화된 혈소판 접착 및 응고 형성^2,,4를시작하는 프로코아굴란트 내피타입을 초래한다. 내피 활성화 혈소판이 폰 윌레브란트 팩터(VWF)를 부착하면, EC에서 방출되는 다혈성 단백질또는 기본 서브엔도피알 매트릭스의 노출된 결합 부위에 부착된다. 이어서, 혈소판의 분자 변화와 조직인자(TF)에 대한 노출은 응고 시스템의 활성화를 개시하여, 이는 피브린^{중합제5,,6에}의한 혈전 형성을 유도한다. 함께, 결과 응고는 재내피화^7에의한 상처 폐쇄의 기초를 제공한다. 응고 시스템의 왜곡은 폰 윌레브란트 질병, 혈우병 또는 혈전증과 같은 출혈 장애를 초래할 수 있으며, 이는 종종 내피 성 혈전 경로^2,,3의난독증 프로 및 항혈전성 균형에서 비롯된다.

hemostasis의 과정은 동맥 및 정맥 순환 모두에서 발생합니다. 그러나, 동맥 및 정맥 혈전증의 근본적인 기계장치는 근본적으로 다릅니다. 동맥 혈전증은 허혈성 심장 질환에서 볼 수 있듯이, 주로 높은 전단 스트레스의 조건에서 죽상 경화성 플라크의 파열에 의해 구동되지만, 정맥 혈전증은 주로 정지^8,,9,,10의조건에서 내피 손상의 부재에서 발생합니다. 깊은 정맥 혈전은 폐 색전증을 일으키는 폐 동맥쪽으로 색전및 여행할 수 있습니다. ^,이는 만성 혈전색전성 폐고혈압(CTEPH)^{11,12,13,14의}발달을 포함하여 초닉 폐 질환의 발달을 촉진할 수 있는 유의한 기능성 용량으로 이어지는 만성 혈관 방해가 발생할 수^있다., CTEPH는 혈전색전성 물질에 의한 폐동맥의 방해로 인한 높은 폐압이 특징이며, 적어도 3개월간의 항응고^{요법(15)에}따른다. 폐 색전증 이외에, 폐 내피는 CTEPH에서 혈전증과 폐 동맥의 만성 장애물을 용이하게 하는 in situ 보혈증 환경을 제공한다고 가정되어 궁극적으로 치료되지 않은^{경우 16,,17.}

지난 몇 년 동안, 다양한 연구는 혈소판 기능 및 응고 를 측정하여 혈전 형성을 검사하는 애약의 개발을 주도하고있다^18. 그러나, 그들 대부분은 콜라겐 또는 피브린과 같은 단일 세포 외 매트릭스 구성 요소와 전혈의 상호 작용을 연구하거나 내피 혈소판 또는 내피 -백혈구 상호 작용^{19,,20,,21,,22와}같은 단일 혈액 성분과의 상호 작용에서 내피 기능을 연구한다. 이러한 분석서는 이러한 세포가 쉽게 얻을 수 있기 때문에 인간 배꼽 내피 세포(HUVEC)로 가장 일반적으로 수행됩니다. 그러나, 혈전성 유전자는 혈관나무, 혈관 유형 및 장기^{시스템(23,,24)을}통해 분화되어, 이는 HUVEC를 사용하여 동맥 혈전증 또는 폐 색전증에 관여하는 내피 세포를 나타내게^한다(23).

EC 가소성 이외에, 질병 별 혈역학적 변화 및 혈관 형태에 있는 변경은 일반적인 내피성^(25)에서혈전 형성을 촉진할 수 있습니다. 높은 전단 속도, 때문에 국소 혈관 수축 또는 혈관 기하학의 변화, 예를 들어, 급성 혈전 형성을 초래할 수 있습니다, 혈류의 중단을 가속화 협착증을 일으키는⁽²⁶⁾. 맞춤형 마이크로 엔지니어링 유량 채널을 사용하면 (patho) 생물학을 대표하는 혈관 기하학을 구체적으로 설계할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 건강하거나 병든^EC(27)에대한 국소 생체역학력의 효과를 연구할 수 있다.

응고 폭포에 있는 다른 단계 및 분자를 표적으로 하기 위하여 유효한 항응고 치료가 있습니다, 이는 모든 특정 무질서에 특정한 특정 한 리스크 및 이득을 제기합니다. 이 논문에 설명된 질병 모델링의 접근은 혈전 역학에 대한 다양한 항응고 및 항혈소판 치료의 효과를 테스트하는 데 특히 적합합니다.

목표는 1 차적인 IC를 포함하는 혈전증의 모형을 제시하는 것입니다, 사용된 1 차적인 IC의 모형에 따라 혈전증의 각종 양식의 분석에 적합한 다목적 모형을 산출하는 것입니다. 그림으로, 우리는 혈전 형성에 관여하는 모든 구성 요소 (혈소판, 백혈구, 적혈구, 응고 단백질 및 공동 인자)를 포함하는 전체 인간 혈액과 상호 작용에 CTEPH 환자에서 폐 동맥 내피 세포를 사용했다. 이 방법은 상업적 병렬 흐름 채널 또는 특정 혈관 설계를 가진 맞춤형 미세 유체 흐름 채널에 적용될 수 있습니다. 이와 같이, 모델은 결국 혈전 형성 및 해상도의 연구, 질병 모델링의 염증 반응 평가, 항혈소판 또는 항응고 요법, 궁극적으로 개인화 된 의학에 사용될 수 있습니다.

이 연구는 1 차적인 인간 폐 동맥 내피 세포의 격리를 기술합니다. 다른 1차 인체 내피 세포 유형의 분리를 위해, 우리는 폐 미생물 내피^세포(25),인간 배빌루칼 정맥 내피^세포(28)및 혈액 순환 내피 내피 세포 형성 세포를 포함하는 이전에 발표된 방법을 지칭한다.²⁹

이 연구는 VU 의료 센터 암스테르담의 기관 의료 윤리 검토 위원회에 의해 승인 되었다, 네덜란드 (METC VUmc, NL69167.029.19). 헬싱키 선언에 따라 서면 동의를 얻은 후 인간 과목의 1차 세포 격리 및 혈액 수집이 수행되었다.

1. 1 차적인 인간 폐 내피 세포의 격리 및 배양 (PAEC)

1. 따뜻한 완전한 내피 세포 매체 (cECM)는 5 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 연쇄 상류균 (P / S), 1 % 내피 세포 성장 보충제 (ECGS), 그리고 1 % 불필요한 아미노산 (NEAA)으로 보충, 37 °C에서 수조에. 120°C 열 멸균기 또는 70% 에탄올로 외과 가위, 집게 및 메스를 살균합니다. 멸균 조건하에서 라미나르 플로우 캐비닛에서 PAEC의 격리를 수행합니다.
2. 5 μg/mL fibronectin의 2mL와 함께 60mm 세포 배양 접시 (재료의 표참조)를 코팅하고 적어도 15 분 동안 37 °C에서 배양한다.
3. 폐동맥(PA) 조직을수술(예:엽절제술 또는 폐심근)에서 획득, 4°C 콜드 코드 버퍼(염화칼륨 4m, 염화 나트륨 140m, 염화나트륨 10m HEPES, 11mM D-포도당, 1% P/S, PH=7.3)에 저장
4. 조직 제거 후 2 시간 이내에 PA에서 내피 세포를 분리합니다. 포셉으로 PA를 가져 와서 PBS로 씻는 10cm 페트리 접시에 넣습니다. PA가 여전히 반지인 경우 폐 동맥을 가위로 잘라냅니다. 내피가 쉽게 손상되거나 제거되기 때문에 용기의 가장 안쪽 층을 도구로 만지지 않도록 주의하십시오.
5. 세포 배양 접시에서 섬유네틴을 제거하고 cECM 배지의 4mL를 추가합니다.
6. 포셉으로 PA 조직을 가져 와서 매체에 놓습니다. 한편, 메스를 가지고 용기의 내부 층을 배지로 조심스럽게 긁어냅니다. 종종, 지질 축적은 용기 벽에서 볼 수 있습니다. 세포 아웃성장에 영향을 미치기 때문에 생략해 보십시오.
7. 내피 세포의 작은 식민지가 나타나기 시작할 때까지 배양에 세포를 유지합니다.
8. 격일로 매체를 교체합니다. 섬유아세포가 배양을 오염시면 제조업체의 지침에 따라 CD144에 대한 자기 친화성 세포 분리를 키트로 정화합니다(재료 표참조). 초기 정화및 모든 연속 정화를 위한 원컬럼 방법에 대한 2열 방법을 사용한다. 일반적으로, 배양은 유동 세포측정이 ≤10% 오염세포를 검출할 때 순수하게 정의된다.
9. 충분한 PAIC가 실험용으로 재배될 때까지 1:3 에서 1:4의 비율로 셀을 분할합니다. PAEC를 사용할 준비가 되면 다음 단계를 계속 합니다.
10. 정제 후, 1차 내피 세포는 EC 특이적마커(예를 들어,VE-cadherin, CD31, TIE2)의 존재와 부드러운 근육 세포(α-SMA), 섬유아세포(vimentin), 및 상피(cytokeratin)마커(도 1B)의부재를 특징으로 할 필요가 있다.

2. 유동 챔버 및 PAEC 단층의 준비

참고: 가설에 따라, 시판되는 유동 챔버(재료 표 및 도 1C옵션 A,프로토콜의 2.1단계 참조) 또는 맞춤형 마이크로 유체 흐름 챔버(그림1C옵션 B, 프로토콜의 2.2단계)를 사용합니다.

1. 시판 되는 마이크로 슬라이드에서 내피 단층의 세포 파종
   참고: 상용 유량 챔버는 사용하기 쉬우며 높은 전단 속도로 사용할 수 있는 채널 전체에 라미나르 흐름 패턴을 제공합니다. 이러한 마이크로 슬라이드는 멀티채널 병렬 실행을 허용하고 정확하고 재현 가능한 흐름 프로파일을 제공하도록 설계되었습니다. 반전된 현미경 검사법에 최적화되어 있기 때문에 고품질형 이미지를 캡처할 수 있습니다. 또한 다양한 수조 의 흐름 챔버를 다양한 채널 크기 또는 형상으로 사용할 수 있습니다. 이러한 마이크로 슬라이드에는 치수가 작고 다중 병렬 실행을 허용하기 때문에 6웰 흐름 채널이 이 분석에서 선호됩니다.
   1. 6웰 플로우 슬라이드(3.5mm 폭 x 0.4mm 높이 x 17mm 길이)의 한 채널을 코팅하려면 채널당 0.1% 젤라틴30 μL을 사용하고 37°C에서 최소 15분 동안 배양한다.
   2. 하나의 채널을 시드하려면, 트립시네이크 10cm² 컨실수 PAEC의 트립시니화하고 실온 (RT)에서 7 분 동안 300 x g에서 아래로 회전합니다.
   3. CECM 및 파이펫 100 μL(1.5cm^2)의 600 μL에서 PAECs를 하나의 채널에서 일시 중단합니다. 이것은 모세관 작용을 통해 마이크로 슬라이드를 커버합니다. 너무 느리게 진행되면 기포가 형성됩니다. 파이펫팅 시 조금 더 힘을 사용하여 기포의 형성을 피하십시오.
      참고: 세포 밀도는 내피형에 영향을 미칩니다. 채널이 0.6 cm^2의 표면적을 가지고 있기 때문에 채널 당 컨물 수 있는 세포의 총 1.5cm^2는오버컨실수 있습니다. 실험을 시작하기 전에 최대 수렴성에 도달할 때까지 채널 내에서 이러한 세포를 6일 동안 배양합니다.
   4. 37°C, 5% CO_2에서하룻밤 배양을 위한 충분한 매체를 제공하기 위해 채널에 cECM의 50 μL을 추가한다. 다음 날 배지를 변경하여 언바운드 셀을 씻어내도록 합니다.
   5. PAEC가 단단하고 컨실릭한 단층층을 형성할 수 있도록 37°C, 5%_CO2에서 6일 동안 배양에 세포를 유지한다. cECM의 150 μL로 격일로 배지를 변경합니다.
   6. 7일째에는 PAEC에 ECM내 1μM 히스타민 1μM, FBS 1%로 30분 전에 다른 첨가제없이 치료한다. 자극은 광고 리비툼을선택할 수 있습니다. 예를 들어, TNF-α 일반적으로 염증 활성제로 사용되어 왔다.
2. 맞춤형 미세 유체 흐름 챔버의 준비
   참고: 치수와 형상을 기본 설정으로 쉽게 변경할 수 있으므로 사용자 지정 제작 흐름 챔버는 사용자의 요구에 맞게 조정됩니다. 예를 들어, 생리적으로 관련된 혈관을 모방하기 위해 협착증이 도입될 수있다(도 1D). 이 접근은 미세 혈관 질병에서 보인 것과 같이 아주 작은 혈액 량의 사용을 허용합니다.
   1. 패턴 웨이퍼를 사용하여 폴리디메틸실록산(PDMS)의 부드러운 리소그래피
      1. 1:10 비율로 미세 균형에 PDMS 경화제와 프리 폴리머를 결합하고 범용 실험실 믹서와 철저히 혼합하십시오.
      2. 생성된 기포를 제거하려면 PDMS를 건조기에서 약 1시간 동안 탈가스로 제거합니다.
      3. 유리 페트리 접시에 알루미늄 호일로 줄을 서서 물 방울몇 방울을 넣은 후 웨이퍼를 줄지어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 웨이퍼는 맞춤 제작 채널의 금형 역할을 합니다.
         참고: 웨이퍼 또는 금형은 클린룸 시설에서 제공됩니다. 네거티브 포토레지스트는 웨이퍼에 패턴화되어 300 μm 너비 x 270μm 높이 x 14mm 길이의 일반적인 치수로 돌출 채널과 같은 피처를 생성합니다.
      4. 탈가스 PDMS를 유리 페트리 접시에 넣은 웨이퍼에 붓습니다.
      5. PDMS를 데가스로 디게시터에 넣고 15분 동안 추가로 주조 중에 형성되었을 수 있는 거품을 제거했습니다.
      6. 건조기에서 금형 및 PDMS를 함유한 페트리 접시를 제거하고 PDMS를 교차 연결하는 데 최소 4시간 동안 60°C 오븐에 놓습니다.
   2. 유리 슬라이드에 접합을 위한 교차 연결 PDMS 준비
      1. 오븐에서 금형 및 교차 연결 PDMS를 제거하고 PDMS의 먼지없는 처리를 위해 크로스 플로우 후드로 이동합니다.
      2. 메스를 사용하여 금형 의 바닥에서 PDMS를 제거하고 금형에서 교차 연결된 PDMS의 상단 슬래브를 제거합니다.
      3. 노출된 패턴 PDMS 슬래브를 접착 테이프로 정렬하여 먼지 입자가 PDMS 채널과 접촉하는 것을 방지합니다.
      4. PDMS 칩을 크기로 자르고 생검 펀치를 사용하여 직경 1mm 입구와 콘센트를 펀치합니다.
   3. PDMS 미세 유체 채널 및 유리 슬라이드의 살균 및 본딩
      1. 에탄올로 철저히 헹구고 이소프로필 알코올 헹구는 유리 현미경 슬라이드를 청소합니다. 각 헹구기 후에는 질소 총으로 슬라이드를 철저히 건조시십시오.
         참고: 대안적으로, 커버 전표는 분석이 공초점 현미경을 사용하여 수행되는 경우에 사용될 수 있습니다.
      2. 플라즈마 챔버를 열고 보호 테이프없이 청소 된 현미경 슬라이드 및 미세 유체 칩을로드합니다.
      3. 챔버를 닫고 질소로 1 분 동안 제거하고 500 mTorr의 압력이 도달 할 때까지 여과 된 공기로 챔버를 채웁니다.
      4. 유리 슬라이드와 PDMS 칩을 50W의 전력과 5kHz의 주파수를 사용하여 40s의 플라즈마에 노출합니다.
      5. 플라즈마에 노출 된 후 유리 슬라이드와 미세 유체 칩을 즉시 결합합니다. 장치를 멸균 페트리 접시에 보관하십시오.
3. 미세 유체 채널에서 내피 단층의 세포 파종
   1. 0.1 mg/mL 콜라겐 타입 I또는 채널당 0.1% 젤라틴을 파이프팅하여 맞춤형 마이크로채널을 코팅하고 30분 동안 37°C에서 배양한다.
   2. 4개의 마이크로 채널을 시드하려면 25cm^2의 컨실한 PAEC를 시도하고 RT에서 7분 동안 300 x g로 회전합니다.
      참고: 소수의 셀만 표면에 부착됩니다. 따라서, 컨서적 인 단층층을 달성하기 위해 세포의 과잉을 사용할 필요가있다.
   3. cECM의 20 μL에서 PAEC를 일시 중단하고 각 채널에 대해 5 μL의 셀 서스펜션을 사용합니다. 작은 채널 치수 때문에 모세관 힘은 마이크로 슬라이드를 채우고 기포 형성을 방지합니다.
   4. 3-4 시간 후에 배지를 변경하여 언바운드 셀을 세척합니다.
   5. PAEC가 단단하고 수렴적인 단층층을 형성할 수 있도록 6일 동안 세포를 배양에 보관하십시오. 소량으로 인해 매일 150 μL의 cECM로 매체를 변경합니다. 입구에 매체로 채워진 파이펫 팁을 두고 콘센트에 빈 팁을 넣습니다. 이것은 세포에 충분한 양분 및 성장 인자를 제공하는 저수지 역할을하고 슬라이드가 건조되는 것을 방지할 것입니다.
   6. 7일째, Hoechst(cECM에서 1:5,000)를 가진 살아있는 세포에 핵을 더럽히고 37°C에서 최대 10분, 5%_CO2에서배양한다.
   7. cECM로 3배 조심스럽게 세척하고 분석 전에 30분 동안 ECM + 1% FBS로 치료하십시오. 자극은 광고 리비툼을선택할 수 있습니다. 예를 들어, TNF-α 일반적으로 염증 활성제로 사용되어 왔다.
   8. 직경 1.27mm의 90° 각진 스테인리스 스틸 커넥터를 사용하여 PDMS 칩의 콘센트를 튜브에 연결합니다.

3. 인간의 온혈 준비

1. 구연산나트륨 항응고제0.109M에서 피험자로부터 정맥혈액을 뽑는다. 이것은 항응고 치료를 받지 않는 건강하거나 병에 걸린 과목에서 일 수 있습니다. 튜브를 부드럽게 반전하여 혼합합니다. 실험에 필요한 혈액의 총 량은 주로 선택한 유량에 따라 달라집니다. 25 mL /h의 유량으로, ibidi 6 웰 슬라이드에서 욕조와 유동 채널을 채우기 위해 약간의 초과2 mL의 총 볼륨이 충분합니다.
2. 혈액을 50mL 튜브로 옮기고 칼신 AM(1:10,000)을 추가하여 혈액 세포를 형광 라벨에 넣고 Alexa488-fibrinogen(15 μg/mL)을 결합하여 자가 섬유티노겐을 결합합니다. 혈액이 완전한 흡수를 허용하기 위해 15 분 동안 37 °C에서 배양하게하십시오.
3. 실험 시작 직전에 리칼화 완충제(염화 나트륨 154m, 구산염 10.8m, 염화 칼슘 2.5m, 염화 2mM 마그네슘)로 혈액 1:1을 희석시하십시오.
   참고: 최대 50%의 수배는 응고 반응 시간^30에영향을 미치지 않았다. 게다가, 인간의 혈액은 바이러스 및 그밖 에이전트를 포함할 수 있습니다. 혈액 샘플로 작업, 따라서, 감염의 위험을 수반한다. 적절한 안전 조치를 사용하고 재료를 주의하여 처리하는 것이 좋습니다.

4. 유동 시스템 조립

1. 튜브를 연결하기 전에, 세척 버퍼 (36 mM 구연산, 103 mM 나트륨 염화나트륨, 5 mM 칼륨 염화칼륨, 5 mM EDTA, 및 0.35 % wt /vol 소 serum albumin [BSA], ph = 5.5 의 혈액 차단으로 흐르는 튜브를 헹구십시오.
2. 새로운 주사기를 사용하여 HEPES 버퍼(132mM 나트륨 염화수소, 20m HEPES, 염화 6m 칼륨), 염화 마그네슘 1m, 염화 수소 1m, BSA 1%, 5.5mM D-포도당, pH = 7.4)로 유동 튜브를 채우고 조심스럽게 팔꿈치 모양의 루미터로 연결합니다. 마이크로 채널에 커넥터를 부착하는 동안 슬라이드에서 기포가 형성되는 것을 방지하십시오. 거품은 내피를 손상시키고 실험 결과에 영향을 미칩니다. 세척 버퍼를 완전히 제거하고 버퍼가 응고를 억제하므로 버퍼가 세포와 접촉하지 못하게합니다.
3. 도 1E에표시된 대로 흐름 시스템을 설정합니다. 20mL 주사기에 2mL의 세척 버퍼를 가지고 헹도 혈액이 주사기에 들어갈 때 응고를 방지합니다. 주사기 펌프에 빈 주사기를 삽입하고 출구 튜브를 여성 루어 커넥터와 연결하여 이 주사기에 연결합니다. 준비된 인간의 혈액을 포함하는 용기에 입구 튜브를 넣습니다.
4. 주사기 펌프를 켜고 유량을 계산합니다. 흐름 프로파일은 포물선 패턴을 따라 높이를 따릅니다. 혈액이 뉴턴 유체역할을 한다고 가정하면 다음 공식을 사용하여 유량을 계산합니다.
   (방정식 1)
   어디
   θ = 전단 응력
   η = 동적 점도
   Q = 체적 유량
   h = 채널 높이
   w = 채널 너비
   참고: 0.4mm 높이와 3.5mm 너비의 직사각형 치수를 가진 상업용 6 채널 마이크로 슬라이드에서 혈액이 있는 폐 동맥 흐름의 경우, 25mL/h의 체적 유량은 5분 동안 사용되었다. 사용자 지정 된 흐름 채널의 치수의 차이로 인해 이러한 역학도 변경됩니다. 변수를 조정하여 전단 응력이 동일한지 확인합니다.
5. 20mL 주사기의 직경을 19.05mm로 정의하고 프로그램을 철회하도록 설정합니다. 음압의 적용으로 세포 코팅 채널을 통해 혈액을 당기면 일정한 전단 속도와 세포 층손상의 최소 손상을 보장합니다.

5. 이미지 수집을 위한 현미경 설정

1. 20배 의 목표를 사용하고 마이크로 슬라이드를 반전 된 위상 대조 형광 현미경의 단계에 놓습니다. 현미경 소프트웨어를 시작하여 Z 방향으로 스테이지를 이동하여 세포 단층에 집중합니다.
2. 모든 흐름 채널의 시작, 중간 및 끝에 있는 관심 영역(ROI)을 선택합니다. 시작과 끝은 채널의 입구와 콘센트에서 적어도 3mm 떨어져 있어야 합니다. 최소한의 배경을 보여주는 레이저 파워와 라이트 강도로 파란색, 녹색 및 빨간색 형광 필터를 설정합니다.

6. PAIC를 통해 전체 혈액의 관류

1. 모든 그림 1E에서와 같이 연결되고 현미경이 녹화 할 준비가 된 후 시작하여 비디오를 녹화하십시오. 내피를 통해 혈액을 퍼감는 주사기 펌프에서 시작하십시오.
2. 혈액이 내피 위로 흐르기 시작하자마자 미리 선택된 활성 채널로 이미지를 얻고 ROI는 15초마다 5분 동안 배치됩니다.
3. 5 분 동안 관류 후 녹음을 완료하고 주사기 펌프를 중지하십시오. 흐름 챔버를 분해하고 매우 신중하게 튜브를 제거합니다. 종종, 이 너무 많은 힘으로 수행되는 경우 기포가 형성됩니다. 이 내피를 멀리 플러시 하기 때문에이 방지 하려고.

7. 고정 및 사후 분석

참고: 관혈 실험으로 인한 내피 손상에 의한 거짓 양성 혈소판 부착을 배제하려면, 그들의 갭 형성 및 단층상에 대한 내피 세포를 특성화할 필요가 있다. 이것은 VE-cadherin를 위한 정규 면역 형광 염색에 의해 행해질 수 있습니다.

1. 튜브의 관류 및 분해 후 HEPES로 미세 유체 채널을 세척하십시오. 피펫 HEPES가 출구로 혈액을 밀어 넣을 수 있도록 채널에 헤페트합니다. 다른 파이펫으로 초과를 제거합니다.
   1. 선택적으로, 단백질 상수의⁺⁺ 침전을 방지하기 위해 PBS ++(0.5mMM 염화마그네슘 및 0.9mM 칼슘 염화칼슘)로 채널을 세척하십시오. 이렇게 하면 배경이 줄어듭니다. 그러나, 추가 세척 단계는 포스트 분석 화상 진찰에 영향을 미칠 수 있는 세포 행동 및 형태를 바꿀 수 있습니다.
2. HEPES를 제거하고 37°C를 침전시켜 37°C를 침전시켜 내피브린을 고정하고 RT에서 15분 동안 배양한다.
   참고: 이러한 채널이 더 작기 때문에 사용자 지정된 미세 유체를 고정할 때 주의해야 하며, 이는 모든 처리 단계에서 채널에서 더 높은 전단 력을 유발합니다.
3. 채널에서 PFA를 제거하고 PBS로 3배 세척합니다. 마이크로 슬라이드는 이제 VE-cadherin, CD31, P-selectin 또는 통합, CD42b 와 같은 내피 세포 마커, 또는 백혈구용 CD45와 같은 내피 세포 마커를 특성화하는 표준 염색 프로토콜에 대한 준비가 되었습니다.
4. 염색 후, 공동 현지화를 특성화하기 위해 일반 공초점 현미경으로 적어도 5 개의 이미지를 취하십시오.

8. 이미지 분석

1. ImageJ에서 형광 라벨이 부착된 혈소판 또는 형광 피브린을 포함하는 유량 분석 이미지를 엽니다. 선택한 이미지를 ImageJ로 드래그합니다.
2. 이미지는 RGB 색상으로 촬영됩니다. 분석을 위해 8비트 이미지가 선호되므로 이미지를 8비트로 변환: 이미지 | 입력 | 8 비트.
3. 배경을 최소화하려면 롤링 볼이 로컬로 원본 이미지에서 배경 픽셀을 계산하고 빼는 슬라이딩 포물선으로 뺍니다. 배경 빼기 | 롤링 볼 반경 = 50픽셀 | 슬라이딩 파라볼로이드.
   참고: 이미지 크기는 픽셀단위로 정의됩니다. 그러나 영역을 측정하려면 규모를 설정해야 합니다. 이미지가 0.45의 숫자 조리개로 20배 의 목표로 촬영될 때 현미경은 μm당 2픽셀의 배율을 갖는다. 대부분의 시간 스케일을 설정하는 데 필요한 정보가 이미지의 메타데이터에 저장되며 ImageJ: Analyze | 설정 축척을 설정합니다.
4. 부착된 혈소판 또는 증착 된 피브린을 정의하는 임계값을 설정합니다. 삼각형 메서드를 사용 하 여 임계값 자동으로 조정 됩니다.: 이미지 | 조정 | 임계값.
5. 입자 분석 명령으로 혈소판 또는 피브린이 덮인 영역을 분석합니다. 2-무한대로 설정 된 크기, 혈소판의 최소 크기는 2 μm로 : 분석 | 파티클 분석.
6. 결과는 μm^2의총 면적을 제공하며, μm^2의 골재의 평균 크기와 커버 영역의 백분율을 제공합니다.

대표적인 결과는 각각 실험 설정, 데이터 수집 및 데이터 분석의 각 단계를 나타내는 세 부분으로 나눌 수 있습니다. 연구 질문에 따라 각 단계에 대한 매개 변수를 변경할 수 있습니다. 제시된 데이터는 혈전 형성에 대한 내피의 영향을 연구하기 위해 적용됩니다.

실험 설정
내피 세포는 건강과^{질병(23)에서}위치 및 시간에 따라 구조및 기능에 매우 이질성이 있다는 것이 잘 확립되어 있다. 내피 세포의 다양한 공급원은 내피 상호 작용을 연구하는 데 사용될 수 있으며, 이 경우 시판적으로 사용 가능한 HUVEC 및 PAEC(도1A). HUVECs는 실험실 모형에서 가장 일반적으로 이용되고, PAIC는 폐 동맥에서 환자 유래 한 고립된 세포인 동안. 더욱이, 폐순환 또는 혈액 순환성 내피 콜로니 형성 세포(ECFC)^{25,28,29로부터}미생물 내피 세포(MVEC)를 분리할 수 있는 잘 확립된^{프로토콜이있다.}

격리 후, 내피 세포는 내피형을 확인하기 위해 VE-cadherin, CD31 및 TIE2 염색을 특징으로 하였다. αSMA 및 사이토케라틴의 존재에 대한 특성화는 섬유아세포 또는 상피와 같은 표현형(도1B)의부재를 나타냈다. EC의 고순수 인구를 얻은 후, 3-5세포를 통과하여 상용 마이크로슬라이드 또는 맞춤형 미세유체 흐름채널(도 1C)을시드하는 데 사용되었다. 시판되는 마이크로슬라이드는 주로 평행 유량 챔버, 또는 높이 또는 분기 각도에서 특별히 정의된 파라미터를 가진 Y자형 채널이지만, 미세유체 슬라이드를 사용하면 생체 내 혈관 기하학 및 혈류^{역학(31)에}실험 파라미터를 조정할 수 있다. in vivo 그러나, 맞춤형 미세유체 크기는 더 작고 세포 확산을 제한하고 더 많은 세포 사멸을 유도하는 경향이^{있다 32,,33.} 셀의 잉여를 사용하면 셀의 작은 비율만 부착된다는 사실을 보상합니다. 이는 협착증이 도입되었을 때 관찰되었으며, 여기서 내피 세포는 병렬 미세 유체채널(도 1D)에비해 더 긴 표현형을 보였다. 상업용 유량 챔버는 세포가 결합할 수 있는 더 큰 표면적을 가지고 있습니다. 이렇게 하려면 시드를 위한 세포 수가 줄어듭니다.

내피 상호 작용을 연구하기 위해, 전체 혈액은 내피 단층 위에 퍼져졌다. Citrated 혈액은 실험 당일과 관류가 재발하기 직전에 수집되었다. 세포는 관류 전에 30분 전에 VWF 방출 및 혈소판 접착을 유도하기 위해 히스타민으로 자극하였다(도1E)^34,,35. 작은 차원 때문에, 사용자 정의 만든 미세 유체 채널은 작은 혈액 볼륨의 사용을 허용했다.

데이터 수집
PAECs에 혈전 형성을 조사하기 위하여는, Calcein AM-Red 형광표시 혈액 세포 및 Alexa488-conjugated fibrin는 2.5 dyne/cm² (그림 2A-C)에서5 분 동안 perfed되었습니다. 신봉혈액세포와 증착된 피브린은 정량화되었다. 이미지는 30s마다 획득되어 ImageJ로 정량화되었습니다. 비부착 된 혈소판의 자동 불광을 제거하기 위해 배경을 빼는 것이 중요했습니다. 임계값을 위한 삼각형 알고리즘은 최소한의 배경을 정의하는 데 사용되었습니다. 그것은 작은 혈소판 골재(도 2D)의측정을 허용했다.

예상, 비 자극 조건에서, 내피혈소판과 피브린의 결합이 없었다. 폭스바겐F 방출 및 혈소판 결합을 촉진하기 위해 PAECs는 히스타민으로 자극되어 2.5 분 후에 고원에 도달한 혈소판 접착력이 즉시 증가했습니다. 이 때, 혈소판은 혈소판 응집및 피브린로 혈소판 응집 및 fibrinogen 분열을 유도하는 자동 크리인 인자를 분비하기 시작했다. 피브린은 3분 후에 증착되었고 4분 후 혈소판으로 안정적인 골재를 형성하였다(도2E).

이 효과가 직접적인 경구 항응고제(DOAC)에 의해 억제될 수 있는지 여부를 조사하기 위해 혈액은 10 nM 다비가트란으로 치료되었다. 다비가트란은 응고 경로에서 인자 IIa를 억제하고 피브린 섬유를 형성하기 위해 피브리노겐의 분열을 방지하는 혈액 희석에 첨가되었다. 다비가트란 처리혈액이 자극된 PAEC에 침투했을 때, 혈전 형성은 피브린 증착을 지연시킴으로써 주로 직접적으로 억제될 수있다(도 2F).

데이터 분석
혈전 형성에 대한 다양한 내피 소스의 영향을 연구하기 위해 5 분 혈액 관류시 세포 변화가 분석되었습니다. 내피는 고정되었고 응집성 혈소판은 공초점 현미경으로 이미징하기 전에 CD42b로 표시되었다. 이것은 혈액에 있는 기능 장애 응고 요인을 나타낼 수 있는 혈소판 및 fibrin의 colocalization를 위한 상세한 분석을 제공했습니다. 응고 형성에서 EC의 영향은 표준 면역 형광 염색에 의해 결정되었다. 내피 세포-세포 접촉은 VE-cadherin 염색에 의해 확인된 바와 같이 유지되었으며, 내피 갭 사이의 기본 매트릭스보다는 내피 단층 위에 형성된 혈전이 있음을나타낸다(도 3). 더욱이, 상이한 세포 근원의 사용은 내피에 형성하는 혈전의 상이한 패턴 귀착되었다. HUVECs는 정맥 내피 세포이고 제한된 혈소판 접착 및 피브린 증착을 보였으며, CTEPH 환자로부터 병에 걸린 1 차 PAEC는 건강한 PAEC에 비해 히스타민 자극에 풍부한 혈소판 부착 및 더 많은 피브린 증착을 보였다. 이것은 CTEPH 환자의 내피성이 증가한 혈전 대형 결과 혈관 활성화에 더 높은 반응성을 보여줍니다 건의합니다.

그림 1: 프로토콜의 회로도 개요입니다. (A)다양한 소스와 상이한 유형의 내피 세포는 관류 실험을 위한 미세유체 흐름 채널에서 사용을 위해 분리및 배양되었다. 내피 세포의 다른 모형의 대표적인 밝은 필드 심상. 스케일 바 = 50 μm.(b)절연 된 세포는 내피성 표현형을 확인하기 위해 면역 형광 염색을 특징으로하였다. 스케일 바 = 50 μm.(C)셀은 상업용 유량 슬라이드 또는 맞춤형 마이크로 유체 채널에서 시드될 수 있습니다. (D)다양한 채널 기하학에서 자란 HUVEC의 대표적인 브라이트필드 이미지. 스케일 바 = 50 μm.(E)혈액 관류 실험의 실험 설정. 정액 혈액을 채취하고, 식염수 완충제로 희석하고, 주사기 펌프로 내피 세포에 침투하였다. 이 그림의 폐와 배꼽 정맥은 창조적 인 공통 저작자 3.0 일반 라이센스에 따라 허가 된 세르비어 의료 예술에서 수정되었습니다. http://smart.servier.com/이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 혈전 형성의 이미지 수집 및 정량화. (A)부착된 칼신 AM-레드 라벨혈소판과 1, 3, 5분에 부착된 Alexa488-conjugated fibrin의 대표적인 시간 경과 영상자극을 통해 자극되지 않은 PAEC(B)와 히스타민 자극 PAIC를 통해 전혈 후 1, 3, 5분.B (C)혈소판 부착 및 피브린 증착의 대표적인 타임랩스 이미지는 히스타민 자극 PAEC에 침투하는 다비가트란으로 배양된 전혈으로 1, 3, 5분 동안 관류를 가중시켰다. 스케일 바 = 50 μm.(D)ImageJ에서 이미지 정량화의 회로도 개요. (E)자극되지 않은 히스타민에 대한 매 30s마다 혈소판 부착 및 피브린 증착의 정량화는 내피를 자극하였다. (F)혈소판 부착 및 피브린 증착에 의해 정량화된 혈전 형성에 대한 다비가트라의 효과를 정량화한다. 데이터는 평균 ± SD, n = 3으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: 내피 세포에 혈소판 부착 및 피브린 증착에서 혈전 형성을 특성화하기 위한 유동 실험의 대표적인 공초점 영상. 내피 세포-세포 접접촉은 VE-cadherin에 의해 특징지어지고 제어 PAECs, 환자 유래 CTEPH PAECs 및 HUVEC에서 측정되었습니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

응고는 내피 성분과 혈액 성분 사이의 복잡하고 일시적으로 조절된 상호 작용의 결과입니다. 이 시험관 내 분석법은 내피 세포의 혈전 생성 특성을 실시간으로 조사하는 방법을 제시한다. 1 차적인 인간 내피 세포의 각종 모형은 기관 및 환자 특정 방식으로 시투 혈전증에서 촉진하는, 이용될 수 있습니다. 이 연구에서는, 우리는 CTEPH 환자 대 건강한 기증자에서 고립된 PAECs의 혈전 생성 특성을 비교하는 이 프로토콜의 사용을 설명했습니다. 살아있는 혈전 형성은 히스타민 활성화 내피를 통해 건강한 과목에서 전혈의 관류에 의해 연구되었다, DOAC의 효과는 항 혈전제로 테스트하는 동안.

대표적인 결과에 도시된 바와 같이 상업적으로 이용 가능한 마이크로 채널을 사용하는 것 외에도, 맞춤형 마이크로 유체 채널의 도입은 혈전 형성에 대한 혈관 기하학 변화의 영향에 대한 연구를 가능하게 한다. 예를 들어, 분기점이나 협착에서 의 흐름이 감소하면 전단 응력증가및 혈소판^{활성화(36)가}증가한다. 그러나, 이러한 맞춤형 마이크로유체 채널의 상당한 제한은 2.3.2 단계에서 설명된 바와 같이 안정적인 단일레이어를 형성하기 위한 높은 세포 수의 요구 사항이다. 이것은 환자 유래 세포가 부족할 때 제한적인 인자를 제출할 수 있습니다. 시판되는 마이크로슬라이드의 강점은 표면영역이 세포 배양에 맞게 변형되고 성장 영역이 더 커서 EC가 컨실릭하고 안정적인 단층층을 형성할 수 있다는 것이다. 반면에, 더 큰 표면적으로 인해 더 큰 루멘이 생성됩니다. 방정식 1에따르면, 이것은 사용자 정의 된 미세 유체에서와 유사한 유량에 도달하기 위해 더 높은 혈액 볼륨을 필요로한다.

이 프로토콜의 개선은 실시간 EC 손실 또는 장벽 무결성의 변화를 조사하는 것입니다. 이 프로토콜의 EC 손상은 실험이 끝날 때만 측정됩니다. 라이브 트래킹의 경우, 예를 들어^37mCherryVE-cadherin으로 EC에 태그를 지정할 수 있습니다. 그러나, 이것은 효율적인 바이러스 형질과 고도로 최적화 된 프로토콜을 필요로 하므로, 전기 세포 기질 임피댄스 감지 (ECIS) 내피 무결성 및 장벽 기능을 연구하는 대안으로 사용될 수있다⁽³⁸⁾. 특수 ECIS 흐름 채널에 대한 관류를 통해 흐름 하에서 내피 장벽 무결성을 세로 모니터링할 수 있습니다. 이러한 특정 ECIS 기능을 사용하면 내피 장벽 특성 및 혈전 형성의 병렬 측정이 가능합니다. 병렬 EC 장벽 측정을 위한 대체 방법, 특히 사용자 정의 된 배열에서 형광 덱스트랜스의 사용을 포함, 이는 루멘에서 확산, EC 장벽 특성에 따라.

설명된 프로토콜의 한계는 IC가 인체에서 제거되고 조직 배양 플라스틱에 배양되어 뻣뻣하고 인공기판이 된다는 것입니다. 세포는 그들의 생물 물리학 환경에 적응합니다. 이것은 혈소판 활성화와 벽^강성(39)사이의 연관성이 있기 때문에 혈소판 활성화에 대한 내피 반응에 영향을 미칠 수 있다. 배양 플라스틱에 이러한 적응에도 불구하고, 세포는 혈액 관류의 5 분 후에 혈소판 접착 및 fibrin 증착의 다른 패턴을 발휘하는 대조군, CTEPH-PAEC 및 HUVEC와 같이 건강한 기증자에서 파생된 IC와 직접 비교에서 확인할 수 있는 질병 특정 특성을 유지합니다.

다른 프로토콜과는 달리, 이 시스템은 전혈을 사용하는 반면, 다른 시스템은 혈소판 및^{백혈구(19,,20,,21)와}같은 단일 혈액 성분과 EC 상호 작용을 연구한다. 둥근 혈관 기하학 및 부드러운 세포외 매트릭스를 가진 혈관 모형에 있는 내피 기능의 연구를 허용하는 더 진보된 미세 유체 모형이 개발되었습니다. 그러나, 이들은 HUVEC^{40,,41,,42로}최적화됩니다. 설명된 프로토콜의 참신은 전혈전과 결합된 1차 IC의 사용으로, 생체 내 에서 한 걸음 더 가까이 시투 혈전증의 모델링을 가져오는 것이다. 환자 유래 EC 및 환자 유래 혈액의 사용을 위한 프로토콜을 최적화한 결과 시험관 내질병 모델링을 더욱 최적화하여 개인화된 혈전 형성 및 약물 치료를 평가할 수 있습니다.

기술된 프로토콜은 환자 유래 세포에 대한 항응고 요법의 효과를 연구하기 위해 적용될 수 있다. 우리는 혈전 형성을 억제하기 위해 다비가트란을 사용했지만, 응고 폭포에서 인자 Xa를 직접 억제하는 리바록사반과 같은 다른 항응고제를 사용할 수 있습니다. 클로피도그렐 또는 아스피린과 같은 직접 혈소판 억제제는 혈소판이 IC에 결합하는 헤모스티스의 1차 단계에 작용하기 때문에 연구될 수 있습니다. 궁극적으로, 환자의 혈액과의 상호 작용에서 환자 특정 ECs의 혈전 생성 용량은 개별 환자에 대한 항 응고 치료의 개인적인 효과를 예측하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 특정 단백질의 녹다운은 추가 적인 기능 정보를 제공할 수 있습니다.

성공적인 관류 실험에 중요한 설명된 프로토콜에는 몇 가지 단계가 있습니다. 첫째, 1차 세포의 격리 중에 매우 순수한 EC 배양을 얻을 필요가 있다. 둘째, EC가 안정적인 컨실릭 모노레이어를 형성하는 것이 중요합니다. 그렇지 않은 경우, 전단 응력의 약간의 변화는 응고 캐스케이드의 내피 손상 및 활성화를 일으킬 수 있으며, 또는 혈소판은 지하 막에 결합을 시작할 수 있으며, 이는 거짓 양성 결과를 제공할 것이다. 셋째, 기포를 방지하는 것이 필수적이며, 이는 내피를 손상시키고 그 결과로 영향을 미칠 수 있기 때문에.

염화칼슘과 염화 마그네슘으로 정산 혈액을 재보정한 후, 즉시 관혈 실험을 시작하는 것이 중요하다. 회화는 혈소판 활성화 및 혈전 형성에 있는 급속한 반응을 유도하고, 견본에 있는 빠른 응고의 결과로.

결론적으로, 우리는 혈전증 도중 전체 혈액 내피 세포 상호 작용을 공부하기 위하여 고도로 다재다능한 프로토콜을 기술합니다.

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

우리는 플라즈마 단백질의 부서에서 얀 Voorberg 감사합니다, 산퀸 연구 및 랜드 스타이너 연구소, 암스테르담 UMC, 학술 의료 센터, 암스테르담, 네덜란드, 이 원고에 자신의 입력에 대한. 이 작품은 네덜란드 심장혈관 동맹 (DCVA) [2012-08, 2014-11]에 의해 지원되었다 파에드라와 다시 연결 컨소시엄뿐만 아니라 펄스 보조금 2018 파에드라 IMPACT 컨소시엄에 수여. 이러한 보조금에는 네덜란드 심장 재단, 네덜란드 대학 의료 센터 연맹, 네덜란드 건강 연구 개발 기구 및 네덜란드 왕립 과학 아카데미의 집단 기금이 포함됩니다. 또한, 이 작품은 고급 보조금 'VESCEL'프로그램에 따라 유럽 연구 위원회에 의해 지원되었다 (그랜트 번호: 669768). XDM은 네덜란드 암스테르담의 VU 대학 의료 센터에서 심장 혈관 연구 연구소 (ICaR-VU)의 연구 보조금에 의해 투자됩니다.