In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Presentamos un modelo de enfermedad vascular in vitro para investigar interacciones sanguíneas enteras con endotelio derivado del paciente. Este sistema permite el estudio de las propiedades trombogénicas de las células endoteliales primarias en diversas circunstancias. El método es especialmente adecuado para evaluar la trombogenicidad in situ y la terapia de anticoagulación durante diferentes fases de la coagulación.

La formación de coágulos sanguíneos implica interacciones complejas entre las células endoteliales, su matriz subyacente, varias células sanguíneas y proteínas. El endotelio es la fuente primaria de muchas de las principales moléculas hemostáticas que controlan la agregación plaquetaria, la coagulación y la fibrinólisis. Aunque el mecanismo de trombosis se ha investigado durante décadas, los estudios in vitro se centran principalmente en situaciones de daño vascular donde la matriz subendotelial se expone, o en interacciones entre células con componentes sanguíneos individuales. Nuestro método permite estudiar las interacciones entre toda la sangre y una red de células vasculares intacta y confluente.

Mediante la utilización de células endoteliales humanas primarias, este protocolo proporciona la oportunidad única de estudiar la influencia de las células endoteliales en la dinámica del trombo y proporciona información valiosa sobre la fisiopatología de la enfermedad trombótica. El uso de canales de flujo microfluídicos hechos a medida permite la aplicación de geometrías vasculares específicas de la enfermedad y modelan cambios vasculares morfológicos específicos. El desarrollo de un trombo se registra en tiempo real y cuantitativamente caracterizado por la adhesión plaquetaria y la deposición de fibrina. El efecto de la función endotelial en la dinámica alterada del trombo está determinado por el postanálisis a través de la tinción de inmunofluorescencia de moléculas específicas.

Los resultados representativos describen la configuración experimental, la recopilación de datos y el análisis de datos. Dependiendo de la pregunta de investigación, los parámetros para cada sección se pueden ajustar incluyendo el tipo de célula, las tasas de cizallamiento, la geometría del canal, la terapia farmacológica y los procedimientos de postanálisis. El protocolo se valida cuantificando la formación de trombos en el endotelio de la arteria pulmonar de pacientes con enfermedad tromboembólica crónica.

El endotelio forma la capa celular interna de los vasos sanguíneos y separa la sangre del tejido circundante. Se ha descrito como un órgano dinámico que regula activamente su microambiente y responde a estímulos externos¹. Debido a su contacto directo con la sangre que fluye, el endotelio es fundamental en el control de la hemostasia y la trombosis y es la fuente primaria de muchas de las principales moléculas reguladoras que controlan la agregación plaquetaria, la coagulación y la fibrinólisis^2. Las células endoteliales sanas y no inactivadas (EC) producen varias moléculas que contrarrestan la activación plaquetaria y previenen la coagulación y la formación de trombos para mantener el flujo sanguíneo, como la prostaciclina, la trombomotritina o el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI)^2,,3. Esto evita la adhesión de plaquetas, agregación plaquetaria y formación de trombos. La lesión o la activación de la pared del vaso da como resultado un fenotipo endotelial procoagulant que inicia la adhesión plaquetaria localizada y la formación de coágulos^2,4. Tras la activación endotelial, las plaquetas se adhieren al factor von Willebrand (VWF), una proteína multimérica liberada de ECs, o a sitios de unión expuestos de la matriz subendotelial subyacente. Posteriormente, los cambios moleculares en las plaquetas y la exposición al factor^tisular(TF) inician la activación del sistema de coagulación, lo que induce la formación de trombos por polimerización de fibrina^5,6. Juntos, el coágulo resultante proporciona la base para el cierre de la herida por re-endotelialización⁷. Las perturbaciones del sistema de coagulación pueden dar lugar a trastornos hemorrágicos, como la enfermedad de von Willebrand, la hemofilia o la trombosis, que a menudo resultan de un equilibrio pro y antitrombótico desregulado de la vía hemostatica endotelial^2,,3.

El proceso de hemostasia se produce tanto en circulación arterial como venosa. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la trombosis arterial y venosa son fundamentalmente diferentes. Mientras que la trombosis arterial, como se ve en la cardiopatía isquémica, es impulsada principalmente por la ruptura de una placa aterosclerótica en condiciones de alto estrés de cizallamiento, trombosis venosa se desarrolla principalmente en ausencia de lesión endotelial en una condición de éxtasis^8,,9,10. Un trombo venal profundo puede embolizarse y viajar hacia las arterias pulmonares, donde causa una embolia pulmonar. Esto puede dar lugar a obstrucciones vasculares crónicas que conducen a un deterioro significativo de las capacidades funcionales que podrían fomentar el desarrollo de enfermedades pulmonares chónicas, incluyendo el desarrollo de hipertensión pulmonar tromboembólica crónica (CTEPH)^11,12,13,14. La CTEPH se caracteriza por una presión pulmonar elevada debido a obstrucciones de las arterias pulmonares por material tromboembólico después de al menos tres meses de terapia de anticoagulación¹⁵. Además de las embolias pulmonares, se postula que el endotelio pulmonar proporciona un ambiente protrombótico en la CTEPH que facilita la trombosis in situ y las obstrucciones crónicas de las arterias pulmonares, causando el aumento de la presión arterial que en última instancia puede resultar en insuficiencia cardíaca, si no se trata^16,17.

En los últimos años, diversos estudios han llevado al desarrollo de ensayos para examinar la formación de trombos midiendo la función plaquetaria y la coagulación¹⁸. Sin embargo, la mayoría de ellos estudian la interacción de sangre entera con componentes de matriz extracelular individual como colágenos o fibrines, o función endotelial en interacción con componentes sanguíneos individuales, como la interacción endotelial-plaquetaria o endotelial-leucocitos^{19,,20,,21,,22}. Estos ensayos se realizan más comúnmente con células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC), ya que estas células se obtienen fácilmente. Sin embargo, los genes hemostáticos se expresan diferencialmente a través del árbol vascular, los tipos de vasos y los sistemas de órganos^23,24, lo que hace que el uso de HUVEC para representar células endoteliales implicadas en trombosis arterial o embolsias pulmonares problemático²³.

Además de la plasticidad EC, las alteraciones hemodinámicas específicas de la enfermedad y los cambios en la morfología vascular pueden promover la formación de trombos en el endotelio^{normal 25.} Las tasas de cizallamiento más altas, debido a la vasoconstricción local o a cambios en la geometría de los vasos, por ejemplo, pueden dar lugar a una formación aguda de trombos, causando una estenosis que acelera el cese del flujo sanguíneo²⁶. El uso de canales de flujo microingenieros hechos a medida permite diseñar específicamente geometrías vasculares que son representativas de la biología (patho). De esta manera, es posible estudiar el efecto de las fuerzas biomecánicas locales en la EC²⁷sana o enferma.

Existen terapias de anticoagulación disponibles para apuntar a diferentes fases y moléculas en la cascada de coagulación, que representan riesgos y beneficios particulares que pueden ser específicos de ciertos trastornos. El enfoque del modelado de enfermedades descrito en este documento es especialmente adecuado para probar los efectos de varias terapias de anticoagulación y antiplaquetarios en la dinámica del trombo.

El objetivo es presentar un modelo de trombosis que incluya ECs primarios, produciendo un modelo versátil adecuado para el análisis de diversas formas de trombosis dependiendo del tipo de ECs primarios utilizados. Como ilustración, utilizamos células endoteliales de la arteria pulmonar de pacientes con CTEPH en interacción con sangre humana entera que contiene todos los componentes involucrados en la formación de trombos (plaquetas, leucocitos, eritrocitos, proteínas de coagulación y cofactores). Este enfoque se puede aplicar en canales de flujo paralelos comerciales o en canales de flujo microfluídicos hechos a medida con un diseño vascular específico. Como tal, el modelo puede eventualmente ser utilizado en el estudio de la formación y resolución de trombos, para la evaluación de las respuestas inflamatorias en el modelado de enfermedades, para la terapia antiplaquetaria o anticoagulación, y en última instancia para la medicina personalizada.

Este estudio describe el aislamiento de las células endoteliales de la arteria pulmonar humana primaria. Para el aislamiento de otros tipos primarios de células endoteliales humanas, nos referimos a métodos publicados previamente, incluyendo células endoteliales microvasculares pulmonares^25,células endoteliales de venas umbilicales humanas²⁸, y colonia endotelial circulante de sangre formando células Figura 1A²⁹.

Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Ética Médica institucional del VU Medical Center Amsterdam, Países Bajos (METC VUmc, NL69167.029.19). El aislamiento de células primarias y la recolección de sangre de los seres humanos se realizaron después de obtener el consentimiento informado por escrito de conformidad con la Declaración de Helsinki.

1. Aislamiento y cultivo de células endoteliales arteriales pulmonares humanas primarias (PAEC)

1. Medio de células endoteliales completas calientes (CECM) complementado con 5% de suero bovino fetal (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina (P/S), 1% suplementos de crecimiento de células endoteliales (ECGS), y 1% aminoácidos no esenciales (NEAA), en un baño de agua a 37 oC. Esterilice las tijeras quirúrgicas, los fórceps y un bisturí con un esterilizador térmico de 120 oC o un 70% de etanol. Realice el aislamiento de PAEC en un armario de flujo laminar en condiciones estériles.
2. Recubrir un plato de cultivo celular de 60 mm de unión de células de alta afinidad (ver Tabla de Materiales)con 2 ml de fibronectina de 5 g/ml e incubar a 37oC durante al menos 15 min.
3. Obtener tejido de la arteria pulmonar (PA) de la cirugía(p. ej.,lobectomía o endarterectomía pulmonar), almacenar en un tampón de cordón frío de 4 oC (cloruro de potasio de 4 mM, cloruro de sodio de 140 mM, HEPES de 11 mM, 11 mM de D-glucosa y 1% P/S, pH a 7,3), y mantener el hielo hasta el aislamiento.
4. Aísle las células endoteliales del PA dentro de las 2 h después de la extracción del tejido. Tome el PA con fórceps y colócalo en un plato de Petri de 10 cm para lavar con PBS. Si el PA sigue siendo un anillo, corte la arteria pulmonar con tijeras. Tenga mucho cuidado de no tocar la capa más interna del recipiente con las herramientas, ya que el endotelio se daña y/o retira fácilmente.
5. Retire la fibronectina de la placa de cultivo celular y agregue 4 ml de cECM medio.
6. Tome el tejido PA con fórceps y colóquelo en el medio. Mientras tanto, raspa cuidadosamente la capa interna del recipiente en el medio con un bisturí. A menudo, las acumulaciones de lípidos se pueden ver en la pared del vaso. Trate de omitir estos, ya que afectarán el crecimiento de la célula.
7. Mantenga las células en cultivo hasta que comiencen a aparecer pequeñas colonias de células endoteliales.
8. Reemplace el medio cada dos días. Si los fibroblastos contaminan el cultivo, purifique con separación de células de afinidad magnética para CD144 con un kit, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales). Utilice el método de dos columnas para la purificación inicial y el método de una columna para cada purificación consecutiva. Generalmente, un cultivo se define puro cuando la citometría de flujo detecta ≤10% de las células contaminantes.
9. Dividir las células en proporciones de 1:3 a 1:4 hasta que se cultivan suficientes PAEC para uso experimental. Cuando los PAEC estén listos para usar, continúe con el siguiente paso.
10. Después de la purificación, las células endoteliales primarias deben caracterizarse por la presencia de marcadores específicos de la CE(por ejemplo,VE-cadherina, CD31, TIE2) y por la ausencia de células musculares lisas (α-SMA), marcadores de fibroblastos (vimentina) y epiteliales (citoqueratina)(Figura 1B).

2. Preparación de cámaras de flujo y monocapas PAEC

NOTA: Dependiendo de la hipótesis, utilice las cámaras de flujo disponibles comercialmente (véase Tabla de materiales y Figura 1C Opción A, paso 2.1 del protocolo) o una cámara de flujo microfluídica a medida(Figura 1C Opción B, paso 2.2 del protocolo).

1. Siembra celular de monocapas endoteliales en microdeslizos disponibles comercialmente
   NOTA: Las cámaras de flujo disponibles comercialmente son fáciles de usar y proporcionan un patrón de flujo laminar en todo el canal que se puede utilizar a altas velocidades de cizallamiento. Estos microdeslizos están diseñados para permitir corridas paralelas multicanal y proporcionar un perfil de flujo preciso y reproducible. Debido a que están optimizados para la microscopía invertida, es posible capturar imágenes fluorescentes de alta calidad. Además, varias dimensiones de las cámaras de flujo están disponibles en diferentes tamaños de canal o geometrías. Los canales de flujo de 6 pozos son preferidos para este ensayo porque estos microdeslizos tienen pequeñas dimensiones y permiten corridas multiparéla.
   1. Para recubrir un canal de un portaobjetos de flujo de 6 pocilnos (3,5 mm de ancho x 0,4 mm de altura x 17 mm de longitud) utilice 30 ml de gelatina de 0,1% por canal e incubar a 37 oC durante al menos 15 min.
   2. Para sembrar un canal, tripsize 10 cm² de PAC confluentes y gire hacia abajo a 300 x g durante 7 min a temperatura ambiente (RT).
   3. Suspenda los PAEC en 600 l de cECM y la pipeta 100 l (1,5 cm² ) de la suspensión celular en un canal. Esto cubre el microdeslizador a través de la acción capilar. Si va demasiado lento, se formarán burbujas de aire. Evite la formación de burbujas de aire mediante el uso de un poco más de fuerza al pipetear.
      NOTA: La densidad celular influye en el fenotipo endotelial. Un total de 1,5 cm² de células confluentes por canal es sobreconfluente, porque el canal tiene una superficie de 0,6 cm². Antes de iniciar el experimento, haga cultivo de estas células durante otros 6 días dentro de los canales hasta que alcancen la confluencia máxima.
   4. Añadir 50 l adicionales de cECM al canal para proporcionar un medio suficiente para la incubación durante la noche a 37 oC, 5% de CO₂. Cambie el medio al día siguiente para lavar las células no enlazadas.
   5. Mantener las células en cultivo durante 6 días a 37 oC, 5% de CO₂ para permitir que el PAEC forme una monocapa firme y confluente. Cambie el medio cada dos días con 150 ml de cECM.
   6. En el día 7, tratar el PAEC con 100 ml de histamina de 1 m en ECM y 1% FBS sin ningún otro aditivo durante 30 minutos antes del ensayo. El estímulo se puede elegir ad libitum. Por ejemplo, TNF-α se ha utilizado comúnmente como un activador inflamatorio.
2. Preparación de cámaras de flujo microfluídicas hechas a medida
   NOTA: Las cámaras de flujo personalizadas se adaptan a las necesidades del usuario porque las dimensiones y geometrías se pueden cambiar fácilmente a la preferencia. Por ejemplo, para imitar un recipiente más relevante fisiológicamente, se puede introducir una estenosis(Figura 1D). Este enfoque permite el uso de volúmenes sanguíneos muy pequeños como se ve en la enfermedad microvascular.
   1. Litografía suave de polidimetilsiloxano (PDMS) utilizando obleas con patrón
      1. Combine el agente de curado y el prepolímero de PDMS en un microbalance con una proporción de 1:10 y mezcle a fondo con un mezclador de laboratorio de uso general.
      2. Para eliminar las burbujas de aire resultantes, desgaste el PDMS en un desecador durante aproximadamente 1 h.
      3. Forrar un plato de petri de vidrio con papel de aluminio y añadir unas gotas de agua antes de colocar la oblea en el plato de Petri forrado. La oblea sirve como molde para el canal hecho a medida.
         NOTA: Las obleas o moldes son proporcionados por las instalaciones de la sala limpia. El fotorresistir negativo se modela sobre obleas para crear operaciones similares a canales salientes con las siguientes dimensiones típicas: 300 m de ancho x 270 m de altura x 14 mm de longitud.
      4. Vierta los PDMS desgasificación en la oblea colocada en un plato de Petri de vidrio.
      5. Degas el PDMS vertió sobre la oblea en un desecador durante 15 minutos adicionales para eliminar cualquier burbuja que pudiera haberse formado durante la fundición.
      6. Retire el plato de Petri que contiene el molde y PDMS del desecador y colóquelo en un horno de 60 oC durante un mínimo de 4 horas para cruzar el PDMS.
   2. Preparación de PDMS reticulados para la unión a diapositivas de vidrio
      1. Retire el molde y los PDMS reticulados del horno y muévase a una campana de flujo cruzado para un manejo sin polvo del PDMS.
      2. Elimine cualquier PDMS de la parte inferior del molde utilizando un bisturí y elimine la losa superior de los PDMS reticulados del molde.
      3. Alinee la losa PDMS con patrón expuesto con cinta adhesiva para evitar que las partículas de polvo entren en contacto con los canales PDMS.
      4. Corte los chips PDMS a tamaño y golpee entradas y salidas de 1 mm de diámetro mediante un punzón de biopsia.
   3. Esterilización y unión de canales microfluídicos PDMS y diapositivas de vidrio
      1. Limpie los portaobjetos de microscopía de vidrio enjuagando completamente con etanol seguido de un enjuague con alcohol isopropílico. Después de cada enjuague, seque bien los portaobjetos con una pistola de nitrógeno.
         NOTA: Alternativamente, se pueden utilizar resbalones de cubierta si el análisis se realiza con un microscopio confocal.
      2. Abra la cámara de plasma y cargue los portaobjetos de microscopía limpiados y los chips microfluídicos sin la cinta protectora.
      3. Cierre la cámara, purgue con nitrógeno durante 1 min y llene la cámara con aire filtrado hasta que se alcance una presión de 500 mTorr.
      4. Exponga los portaobjetos de vidrio y los chips PDMS al plasma durante 40 s utilizando una potencia de 50 W y una frecuencia de 5 kHz.
      5. Después de la exposición al plasma, unir inmediatamente los portaobjetos de vidrio y las virutas microfluídicas. Guarde los dispositivos en platos estériles de Petri.
3. Siembra celular de monocapas endoteliales en canales microfluídicos
   1. Recubrir el microcanal a medida pipeteando 10 ml de colágeno de 0,1 mg/ml Tipo I o 0,1% de gelatina por canal e incubar a 37oC durante 30 min.
   2. Para sembrar cuatro microcanales, tripsinlice 25 cm² de PAEC confluentes y gire hacia abajo a 300 x g durante 7 min en RT.
      NOTA: Solo un pequeño porcentaje de células se adhiere a la superficie. Por lo tanto, es necesario utilizar un exceso de células para lograr una monocapa confluente.
   3. Suspenda los PAEC en 20 ml de cECM y utilice 5 ml de suspensión celular para cada canal. Debido a las pequeñas dimensiones del canal, las fuerzas capilares llenarán el microdeslizo y evitarán la formación de burbujas de aire.
   4. Cambie el medio después de 3-4 h para lavar las células no enlazadas.
   5. Mantener las células en cultivo durante 6 días para permitir que el PAEC forme una monocapa firme y confluente. Debido al pequeño volumen, cambie el medio todos los días con 150 l de cECM. Deje la punta de la pipeta llena de medio en la entrada y coloque una punta vacía en la salida. Esto servirá como un reservorio que proporciona suficientes nutrientes y factores de crecimiento a las células y evitar que el deslizamiento se seque.
   6. El día 7, manchar los núcleos en las células vivas con Hoechst (1:5.000 en cECM) e incubar durante un máximo de 10 min a 37oC y 5% de CO₂.
   7. Lavar cuidadosamente 3x con cECM y tratar con 1 m de histamina en ECM + 1% FBS durante 30 minutos antes del ensayo. El estímulo se puede elegir ad libitum. Por ejemplo, TNF-α se ha utilizado comúnmente como un activador inflamatorio.
   8. Utilice conectores de acero inoxidable en ángulo de 1,27 mm de diámetro y 90o para conectar la salida de los chips PDMS al tubo.

3. Preparación de sangre entera humana

1. Extraiga sangre venosa de sujetos en un anticoagulante de citrato sódico de 0,109 M. Esto puede ser de sujetos sanos o enfermos que no reciben tratamiento de anticoagulación. Invierta suavemente los tubos para mezclar. La cantidad total de sangre necesaria para un experimento depende principalmente del caudal seleccionado. Con un caudal de 25 ml/h, en diapositivas ibidi de 6 pozos, un volumen total de 2 ml con un poco de exceso para llenar las tinas y el canal de flujo es suficiente.
2. Transfiera la sangre a un tubo de 50 ml y añada Calcein AM (1:10.000) para etiquetar fluorescentemente las células sanguíneas y Alexa488-fibrinógeno (15 g/ml) para conjugar fibrinógeno autólogo. Dejar incubar la sangre a 37oC durante 15 min para permitir una absorción completa.
3. Diluir la sangre 1:1 con tampón de recalcificación (154 mM de cloruro sódico, citrato de trisódico de 10,8 mM, cloruro de calcio de 2,5 mM y cloruro de magnesio de 2 mM) inmediatamente antes del inicio del experimento.
   NOTA: La hemodilución con un máximo del 50% no influyó en el tiempo de reacción de la coagulación³⁰. Además, la sangre humana puede contener virus y otros agentes. Por lo tanto, trabajar con muestras de sangre conlleva un riesgo de infección. Se recomienda utilizar las medidas de seguridad adecuadas y manipular el material con cuidado.

4. Montaje del sistema de flujo

1. Antes de conectar el tubo, enjuague los tubos de flujo con una jeringa de 20 ml llena de tampón de lavado (ácido cítrico de 36 mM, cloruro de sodio de 103 mM, cloruro de potasio de 5 mM, EDTA de 5 mM y albúmina sérica bovina de 0,35% wt/vol [BSA], pH a 6,5) para evitar la coagulación de la sangre en los tubos.
2. Utilice una jeringa nueva para llenar los tubos de flujo con tampón HEPES (132 mM de cloruro sódico, 20 mM HEPES, cloruro de potasio de 6 mM, cloruro de magnesio de 1 mM, 1% de BSA y 5,5 mM D-glucosa, pH a 7,4) y conéctelo cuidadosamente con un conector Luer en forma de codo al microdeslizador lleno de EC en medio. Al conectar los conectores a los microcanales, intente evitar la formación de burbujas de aire en la diapositiva. Las burbujas dañarán el endotelio e influirán en los resultados del experimento. Retire el tampón de lavado por completo y no deje que el tampón entre en contacto con las células, ya que esto inhibirá la coagulación.
3. Configure el sistema de flujo como se muestra en la figura 1E. Tome 2 ml de tampón de lavado en una jeringa de 20 ml y enjuague para evitar la coagulación cuando la sangre entre en la jeringa. Inserte la jeringa vacía en la bomba de la jeringa y conecte el tubo de salida con un conector Luer hembra a esta jeringa. Coloque el tubo de entrada en un recipiente que contenga la sangre humana preparada.
4. Encienda la bomba de la jeringa y calcule el caudal. Los perfiles de flujo siguen un patrón parabólico en altura. Suponiendo que la sangre actúa como un fluido newtoniano, utilice la siguiente fórmula para calcular el caudal.
   (Ecuación 1)
   Dónde
   • Estrés de cizallamiento
   η - viscosidad dinámica
   Q - caudal volumétrico
   h - Altura del canal
   w - Anchura del canal
   NOTA: Para el flujo arterial pulmonar con sangre en los microdeslizos comerciales de 6 canales con dimensiones rectangulares con 0,4 mm de altura y 3,5 mm de ancho, se utilizó un caudal volumétrico de 25 ml/h durante 5 min. Debido a las diferencias en las dimensiones de los canales de flujo personalizados, estas dinámicas también cambiarán. Ajuste las variables para asegurarse de que la tensión de cizallamiento es igual.
5. Defina el diámetro de la jeringa de 20 ml en 19,05 mm y ajuste el programa a Retirar. Tirar de la sangre a través del canal recubierto de células mediante la aplicación de una presión negativa garantizará tasas de cizallamiento constantes y un daño mínimo a la capa celular.

5. Configuración del microscopio para la adquisición de imágenes

1. Utilice un objetivo de 20x y coloque el microdeslizador en el escenario del microscopio fluorescente de contraste de fase invertido. Inicie el software del microscopio para mover el escenario en la dirección Z para centrarse en la monocapa celular.
2. Seleccione una región de interés (ROI) al principio, al medio y al final de cada canal de flujo. El principio y el final deben estar al menos a 3 mm de distancia de la entrada y salida del canal. Ajuste los filtros fluorescentes azul, verde y rojo con una potencia láser e intensidad de luz que muestre un fondo mínimo.

6. Perfusión de sangre entera sobre los PAEC

1. Después de que todo esté conectado como en la Figura 1E y el microscopio esté listo para la grabación, presione Iniciar para grabar un video. Empuje Iniciar en la bomba de la jeringa para perfunde la sangre sobre el endotelio.
2. Tan pronto como la sangre comience a fluir sobre el endotelio, adquiera imágenes con los canales activos preseleccionados y posiciones de ROI cada 15 s durante 5 minutos.
3. Después de 5 minutos de perfusión, termine de grabar y detenga la bomba de la jeringa. Desmontar la cámara de flujo y retirar con mucho cuidado el tubo. A menudo, se formará una burbuja de aire si esto se hace con demasiada fuerza. Trate de prevenir esto, porque esto eliminará el endotelio.

7. Fijación y postanálisis

NOTA: Para excluir la falsa adhesión plaquetaria positiva por daño endotelial debido al experimento de perfusión, es necesario caracterizar las células endoteliales para su formación de huecos y monocapa. Esto se puede hacer mediante la tinción regular de inmunofluorescencia para la cadherina VE.

1. Después de la perfusión y el desmontaje del tubo, lave el canal microfluídico con HEPES. Pipeta HEPES en el canal para que empuje la sangre a la salida. Retire el exceso con otra pipeta.
   1. Opcionalmente, lave el canal con PBS⁺⁺ (con cloruro de magnesio de 0,5 mM y cloruro de calcio de 0,9 mM) para evitar la precipitación de sobrenadante de proteínas. Esto reduce el fondo. Sin embargo, un paso de lavado adicional puede cambiar el comportamiento celular y la morfología que podrían influir en la toma de imágenes posteriores al análisis.
2. Retire el HEPES y fije el endotelio con plaquetas adheridas y la fibrina depositada pipeteando 37 oC calentado 4% de paraformaldehído (PFA) en el canal e incubar durante 15 minutos en RT.
   NOTA: Tenga mucho cuidado al fijar los microfluidos hechos a medida, ya que estos canales son aún más pequeños, lo que provoca mayores fuerzas de cizallamiento en el canal durante cada paso de manipulación.
3. Retire el PFA del canal y lávelo 3x con PBS. Los microdeslizos ya están listos para un protocolo de tinción estándar para caracterizar los marcadores de células endoteliales como VE-cadherin, CD31, P-selectin o integrinas, CD42b para plaquetas adherentes o CD45 para leucocitos.
4. Después de la tinción, tome al menos cinco imágenes con un microscopio confocal regular para caracterizar la colocación.

8. Análisis de imagen

1. Abra una imagen de ensayo de flujo que contenga plaquetas etiquetadas fluorescentemente o fibrina fluorescente en ImageJ. Arrastre la imagen de su elección a ImageJ.
2. La imagen se toma en color RGB. Para el análisis, se prefiere una imagen de 8 bits, así que transforme la imagen en 8 bits: Imagen Tipo de tipo ? 8 bits.
3. Para minimizar el fondo, resta con un paraboloides deslizante, donde una bola rodante calcula y resta localmente píxeles de fondo de la imagen original: Procesar ? Restar fondo ? Radio de bola rodante á 50 píxeles ? Paraboloides deslizantes.
   NOTA: El tamaño de la imagen se define en píxeles. Sin embargo, para medir el área, es necesario establecer la escala. Cuando las imágenes se toman con un objetivo de 20x con una apertura numérica de 0,45, el microscopio tiene una escala de 2 píxeles por m. La mayoría de las veces la información necesaria para establecer la escala se almacena en los metadatos de la imagen y puede ser utilizada automáticamente por ImageJ: Analizar . Establecer escala.
4. Establezca un umbral para definir las plaquetas adheridas o la fibrina depositada. Utilice el método Triángulo y el umbral se ajustará automáticamente: Imagen ? Ajustar ? Umbral.
5. Analice el área cubierta por las plaquetas o la fibrina con el comando Analizar partículas. Establezca el tamaño en 2-Infinity, ya que el tamaño mínimo de una plaqueta es de 2 m: Analizar Analizar partículas.
6. Los resultados proporcionarán el área total en el área total en el área², con el tamaño medio de los agregados en m² y el porcentaje de área cubierta.

Los resultados representativos se pueden dividir en tres partes, cada una de las cuales representa los pasos respectivos de configuración experimental, recopilación de datos y análisis de datos. Dependiendo de la pregunta de investigación, los parámetros para cada paso se pueden cambiar. Los datos presentados se aplican para estudiar la influencia del endotelio en la formación de trombos.

Configuración experimental
Está bien establecido que las células endoteliales son altamente heterogéneas en estructura y función, dependiendo de la ubicación y el tiempo, durante la salud y la enfermedad²³. Varias fuentes de células endoteliales se pueden utilizar para estudiar la interacción endotelial-sangre, que en este caso eran HUVECs y PAEC disponibles comercialmente (Figura 1A). Los HUVEC han sido los más utilizados en modelos de laboratorio, mientras que los PAEC son células aisladas derivadas del paciente de las arterias pulmonares. Además, existen protocolos bien establecidos para aislar las células endoteliales microvasculares (MVEC) de la circulación pulmonar o de las células formadoras de colonias endoteliales circulantes de sangre (ECFC)^25,,28,,29.

Después del aislamiento, las células endoteliales se caracterizaron por la tinción de VE-cadherina, CD31 y TIE2 para confirmar un fenotipo endotelial. La caracterización de la presencia de la SMA y la citoqueracina indicaba la ausencia de un fibroblasto o fenotipo similar a un epitelial(Figura 1B). Después de obtener una población altamente pura de ECs, se utilizaron células de paso 3-5 para sembrar un microdeslizo comercial o canales de flujo microfluídicos hechos a medida (Figura 1C). Mientras que los microdeslizos disponibles comercialmente son principalmente cámaras de flujo paralelas, o canales en forma de Y con parámetros definidos específicamente en altura o ángulo de bifurcación, el uso de diapositivas microfluídicas permite adaptar los parámetros experimentales a la geometría del vaso in vivo y la dinámica del flujo sanguíneo³¹. Sin embargo, los tamaños microfluídicos hechos a medida son más pequeños y tienden a limitar la propagación celular e inducir más muerte celular^32,,33. El uso de un excedente de células compensa el hecho de que sólo un pequeño porcentaje de células se adhieren. Esto se observó cuando se introdujo una estenosis, donde las células endoteliales mostraron un fenotipo más alargado en comparación con un canal microfluídico paralelo(Figura 1D). Las cámaras de flujo comercial tienen un área de superficie más grande a la que las células pueden unirse. Esto requiere menos números de celda para la siembra.

Para estudiar la interacción endotelial de células celulares y sangre, toda la sangre se perfundió sobre una monocapa endotelial. La sangre citrated se recogió el día del experimento e inmediatamente antes de la perfusión recalificada. Las células fueron estimuladas con histamina para inducir la liberación de VWF y la adhesión plaquetaria 30 min antes de la perfusión (Figura 1E)^34,35. Debido a las pequeñas dimensiones, los canales microfluídicos hechos a medida permitieron el uso de volúmenes sanguíneos más pequeños.

Recopilación de datos
Para investigar la formación de trombos en los PAEC, los glóbulos con etiqueta fluorescente Calcein AM-Red y la fibrina conjugada Alexa488 se perfundieron durante 5 minutos a 2,5 dyne/cm² (Figura 2A–C). Se cuantificaron las células sanguíneas adherentes y la fibrina depositada. Las imágenes se adquirieron cada 30 s y se cuantificaron con ImageJ. Era importante restar el fondo para eliminar la autofluorescencia de las plaquetas no adheridas. El algoritmo de triángulo para el umbral se ha utilizado para definir un fondo mínimo. Permitió la medición de pequeños agregados plaquetario(Figura 2D).

Se espera que, en condiciones no estimuladas, no hubo unión de plaquetas y fibrina al endotelio. Para promover la liberación de VWF y la unión plaquetaria, los PAEC fueron estimulados con histamina, lo que resultó en un aumento inmediato de la adhesión plaquetaria alcanzando una meseta después de 2,5 min. En este momento, las plaquetas comenzaron a secretar factores autocrinos que indujeron la agregación plaquetaria y la escisión de fibrinógeno en fibrina. La fibrina se depositó después de 3 min y formó un agregado estable con plaquetas después de 4 min(Figura 2E).

Para investigar si este efecto podría ser inhibido por un anticoagulante oral directo (DOAC), la sangre fue tratada con 10 nM dabigatran. Dabigatrán se añadió a la dilución de la sangre, donde inhibe el factor IIa en la vía de coagulación, y previno el escisión de fibrinógeno para formar fibras de fibrina. Cuando la sangre tratada con dabigatrán se perfundió sobre los PAC estimulados, la formación de coágulos podría inhibirse directamente principalmente retrasando la deposición de fibrina (Figura 2F).

Análisis de datos
Para estudiar la influencia de varias fuentes endoteliales en la formación de trombos, se analizaron los cambios celulares a 5 min de perfusión sanguínea. El endotelio se fijó y las plaquetas adherentes se etiquetaron con CD42b antes de la toma de imágenes bajo un microscopio confocal. Esto proporcionó un análisis detallado para la colocación de plaquetas y fibrina que podría indicar factores de coagulación disfuncionales en la sangre. La influencia de la EC en la formación de coágulos se determinó mediante tinción inmunofluorescente estándar. Se mantuvieron los contactos de células celulares endoteliales, como lo confirmó la tinción de VE-cadherina, lo que indica que los coágulos sanguíneos se formaron en la parte superior de la monocapa endotelial en lugar de en la matriz subyacente entre las brechas endoteliales (Figura 3). Además, el uso de diferentes fuentes celulares dio lugar a diferentes patrones de trombos que se forman en el endotelio. Los HUVEC son células endoteliales venosas y mostraron una adhesión plaquetaria limitada y una deposición de fibrina, mientras que los pacientes enfermos de PAEC primario de CTEPH mostraron una abundante adherencia plaquetaria y más deposición de fibrina en la estimulación de la histamina en comparación con el PAEC sano. Esto sugiere que el endotelio de los pacientes con TEPH muestra una mayor capacidad de respuesta a la vasoactivación que resulta en un aumento de la formación de trombos.

Figura 1: Descripción general esquemática del protocolo. (A) Varias fuentes y diferentes tipos de células endoteliales se aislaron y cultivaron para su uso en un canal de flujo microfluídico para experimentos de perfusión. Imágenes representativas de campo brillante de diferentes tipos de células endoteliales. Barra de escala a 50 m. (B) Las células aisladas se caracterizaron por tinción inmunofluorescente para confirmar un fenotipo endotelial. Barra de escala a 50 m. (C) Las celdas se pueden sembrar en diapositivas de flujo comercial o en canal microfluídico hecho a medida. (D) Imágenes representativas de campo brillante de HUVEC cultivadas en diferentes geometrías de canal. Barra de escala a 50 m. (E) Configuración experimental de experimentos de perfusión sanguínea. Se recogió sangre citrated, se diluyó con tampón salino y se perfundió sobre las células endoteliales con una bomba de jeringa. La vena pulmonar y umbilical de esta figura fueron modificadas de Servier Medical Art, licenciada bajo una Licencia Genérica Creative Common Attribution 3.0. http://smart.servier.com/ Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Adquisición de imágenes y cuantificación de la formación de trombos. (A) Imágenes representativas de lapso de tiempo de las plaquetas adelantadas con etiquetas Calcein AM-Red y fibrina conjugada Alexa488 a 1, 3 y 5 min después de la perfusión de sangre entera sobre LOS PAEC no estimulados (B) y sobre las PAC estimuladas por histamina. (C) Imágenes representativas de lapso de tiempo de adhesión plaquetaria y deposición de fibrina a 1, 3 y 5 minutos de perfusión con sangre entera incubada con dabigatrán perfundido sobre LOS PAEC estimulados por histamina. Barra de escala a 50 m. (D) Visión general esquemática de la cuantificación de imágenes en ImageJ. (E) Cuantificación de la adhesión plaquetaria y deposición de fibrina por cada 30 s en un endotelio estimulado por histamina no estimulada. (F) Cuantificación del efecto del dabigatrán en la formación de trombos cuantificado por adhesión plaquetaria y deposición de fibrina. Los datos se representan como ± SD, n a 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes confocales representativas de experimentos de flujo para caracterizar la formación de trombos en la adhesión plaquetaria y la deposición de fibrina en células endoteliales. Los contactos de células celulares endoteliales se caracterizaron por VE-cadherina y se midieron en PAEC de control, PAC CTEPH derivados del paciente y HUVEC. Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La coagulación es el resultado de la interacción compleja y controlada temporalmente entre el endotelio y los componentes sanguíneos. Este ensayo in vitro presenta un método para investigar las propiedades trombogénicas de las células endoteliales en tiempo real. Se pueden utilizar varios tipos de células endoteliales humanas primarias, facilitando la trombosis in situ de una manera específica del órgano y del paciente. En este estudio, ilustramos el uso de este protocolo comparando las propiedades trombogénicas de los PAEC aislados de donantes sanos frente a los pacientes con TEPH. La formación de trombos vivos se estudió por perfusión de sangre entera de sujetos sanos sobre el endotelio activado por histamina, mientras que el efecto de un DOAC se probó como un agente antitrombótico.

Además del uso de microcanales disponibles comercialmente, como se muestra en los resultados representativos, la introducción de los canales microfluídicos hechos a medida permite el estudio de la influencia de los cambios de geometría vascular en la formación de trombos. Por ejemplo, el flujo disminuye en un punto de rama o estenosis da como resultado un aumento en la tensión de cizallamiento y una mayor activación^{plaquetaria 36}. Sin embargo, una limitación significativa de estos canales microfluídicos hechos a medida es el requisito de números de celdas altos para formar una monocapa estable de ECs como se describe en el paso 2.3.2. Esto puede presentar un factor limitante cuando las células derivadas del paciente son escasas. Los puntos fuertes de los microdeslizos disponibles comercialmente son que las áreas superficiales se modifican para el cultivo celular y las áreas de crecimiento son más grandes, lo que permite a los CIE formar una monocapa confluente y estable. Por otro lado, una superficie más grande resultará en un lumen más grande. Según la Ecuación 1,esto requiere mayores volúmenes de sangre para alcanzar velocidades de flujo similares a las de los microfluídicos hechos a medida.

Una mejora de este protocolo podría ser investigar la pérdida de EC en vivo o los cambios en la integridad de la barrera. Los daños de la CE en este protocolo sólo se miden al final del experimento. Para el seguimiento en vivo, los ECs se pueden etiquetar con mCherry VE-cadherin, por ejemplo³⁷. Sin embargo, como esto necesitaría un protocolo altamente optimizado con transfección de virus eficiente, la detección de impedancia de sustrato de células eléctricas (ECIS) podría utilizarse como una alternativa para estudiar la integridad endotelial y la función de barrera³⁸. La perfusión sobre canales de flujo ECIS especiales permite la monitorización longitudinal de la integridad de la barrera endotelial bajo flujo. Estas características específicas de ECIS permiten mediciones paralelas de propiedades de barrera endotelial y formación de trombos. Las formas alternativas para las mediciones de barreras EC paralelas, especialmente en los arreglos a medida, incluyen el uso de dextrans fluorescente en el perfusado, que se difunden fuera del lumen, dependiendo de las propiedades de barrera de la CE.

Una limitación del protocolo descrito es que los EC se eliminan del cuerpo humano y se cultivan en plástico de cultivo de tejidos, que es un sustrato rígido y artificial. Las células se adaptan a su entorno biofísico. Esto podría afectar a la respuesta endotelial a la activación plaquetaria, ya que existe una asociación entre la activación plaquetaria y la rigidez de la pared^39. A pesar de estas adaptaciones a los plásticos de cultivo, las células mantienen características específicas de la enfermedad que se pueden identificar en comparación directa con las CE derivadas de donantes sanos como se muestra con el control, CTEPH-PAEC, y HUVEC que ejerció diferentes patrones de adhesión plaquetaria y deposición de fibrina después de 5 minutos de perfusión de sangre.

A diferencia de otros protocolos, este sistema utiliza sangre entera, mientras que otros estudian la interacción de la CE con un único componente sanguíneo como plaquetas y leucocitos^19,,20,,21. Se han desarrollado modelos microfluídicos más avanzados que permiten el estudio de la función endotelial en un modelo vascular con geometría de recipiente redondo y matriz extracelular suave. Sin embargo, estos están optimizados con HUVECs^40,,41,42. La novedad del protocolo descrito es el uso de ECs primarios combinados con sangre entera que acerca el modelado de la trombosis in situ un paso más cerca de las condiciones in vivo. Una vez optimizado el protocolo para el uso de ECs derivadas del paciente y la sangre derivada del paciente, optimiza aún más el modelado de enfermedades in vitro,lo que permite evaluar la formación personalizada de trombos y el tratamiento farmacológico.

El protocolo descrito se puede aplicar para estudiar el efecto de las terapias de anticoagulación en las células derivadas del paciente. Mientras que usamos dabigatrán para inhibir la formación de trombos, es posible utilizar otros anticoagulantes, como el rivaroxabán, que inhibe directamente el factor Xa en la cascada de coagulación. También se pueden estudiar inhibidores de plaquetas directas como clopidogrel o aspirina, ya que actúan en la fase primaria de la hemostasia, donde las plaquetas se unen a las CE. En última instancia, las capacidades trombogénicas de las ECs específicas del paciente en interacción con la propia sangre del paciente se pueden utilizar para predecir el efecto personal de la terapia de anticoagulación en el paciente individual. Además, un derribo de proteínas específicas puede proporcionar información funcional adicional.

Hay algunos pasos en el protocolo descrito que son críticos para un experimento de perfusión exitoso. En primer lugar, durante el aislamiento de las células primarias, es necesario obtener un cultivo de EC altamente puro. En segundo lugar, es importante que los ECs formen una monocapa confluente estable. Si este no es el caso, un ligero cambio en el estrés de cizallamiento puede causar daño endotelial y activación de la cascada de coagulación, o las plaquetas pueden comenzar a unirse a la membrana del sótano, lo que proporcionará resultados falsos positivos. En tercer lugar, es esencial prevenir las burbujas de aire, ya que pueden dañar el endotelio y así influir en los resultados.

Después de la recalcificación de la sangre citrated con cloruro de calcio y cloruro de magnesio, es importante iniciar inmediatamente el experimento de perfusión. La recalcificación induce una respuesta rápida en la activación plaquetaria y la formación de trombos, lo que resulta en una coagulación rápida en la muestra.

En conclusión, describimos un protocolo altamente versátil para estudiar interacciones de células endoteliales de sangre enteras durante la trombosis.

Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.

Agradecemos a Jan Voorberg, del Departamento de Proteínas de Plasma, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academic Medical Center, Amsterdam, Países Bajos, por su aportación en este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Dutch CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-11] otorgada a Phaedra y el consorcio Reconnect, así como la subvención Impulse 2018 otorgada al consorcio Phaedra IMPACT. Estas subvenciones incluyen financiación colectiva de la Fundación Holandesa del Corazón, la Federación Holandesa de Centros Médicos Universitarios, la Organización Neerlandesa para la Investigación y el Desarrollo de la Salud y la Real Academia neerlandesa de Ciencias. Además, este trabajo fue financiado por el Consejo Europeo de Investigación en el marco del programa de Subvenciones Avanzadas «VESCEL» (Número de subvención: 669768). XDM está financiado por una beca de investigación del Instituto de Investigación Cardiovascular (ICaR-VU) en el Vu University Medical Center, Amsterdam, Países Bajos.