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Presentamos un modelo de enfermedad vascular in vitro para investigar interacciones sanguíneas enteras con endotelio derivado del paciente. Este sistema permite el estudio de las propiedades trombogénicas de las células endoteliales primarias en diversas circunstancias. El método es especialmente adecuado para evaluar la trombogenicidad in situ y la terapia de anticoagulación durante diferentes fases de la coagulación.
La formación de coágulos sanguíneos implica interacciones complejas entre las células endoteliales, su matriz subyacente, varias células sanguíneas y proteínas. El endotelio es la fuente primaria de muchas de las principales moléculas hemostáticas que controlan la agregación plaquetaria, la coagulación y la fibrinólisis. Aunque el mecanismo de trombosis se ha investigado durante décadas, los estudios in vitro se centran principalmente en situaciones de daño vascular donde la matriz subendotelial se expone, o en interacciones entre células con componentes sanguíneos individuales. Nuestro método permite estudiar las interacciones entre toda la sangre y una red de células vasculares intacta y confluente.
Mediante la utilización de células endoteliales humanas primarias, este protocolo proporciona la oportunidad única de estudiar la influencia de las células endoteliales en la dinámica del trombo y proporciona información valiosa sobre la fisiopatología de la enfermedad trombótica. El uso de canales de flujo microfluídicos hechos a medida permite la aplicación de geometrías vasculares específicas de la enfermedad y modelan cambios vasculares morfológicos específicos. El desarrollo de un trombo se registra en tiempo real y cuantitativamente caracterizado por la adhesión plaquetaria y la deposición de fibrina. El efecto de la función endotelial en la dinámica alterada del trombo está determinado por el postanálisis a través de la tinción de inmunofluorescencia de moléculas específicas.
Los resultados representativos describen la configuración experimental, la recopilación de datos y el análisis de datos. Dependiendo de la pregunta de investigación, los parámetros para cada sección se pueden ajustar incluyendo el tipo de célula, las tasas de cizallamiento, la geometría del canal, la terapia farmacológica y los procedimientos de postanálisis. El protocolo se valida cuantificando la formación de trombos en el endotelio de la arteria pulmonar de pacientes con enfermedad tromboembólica crónica.
El endotelio forma la capa celular interna de los vasos sanguíneos y separa la sangre del tejido circundante. Se ha descrito como un órgano dinámico que regula activamente su microambiente y responde a estímulos externos1. Debido a su contacto directo con la sangre que fluye, el endotelio es fundamental en el control de la hemostasia y la trombosis y es la fuente primaria de muchas de las principales moléculas reguladoras que controlan la agregación plaquetaria, la coagulación y la fibrinólisis2. Las células endoteliales sanas y no inactivadas (EC) producen varias moléculas que contrarrestan la activación plaquetaria y previenen la coagulación y la formación de trombos para mantener el flujo sanguíneo, como la prostaciclina, la trombomotritina o el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI)2,,3. Esto evita la adhesión de plaquetas, agregación plaquetaria y formación de trombos. La lesión o la activación de la pared del vaso da como resultado un fenotipo endotelial procoagulant que inicia la adhesión plaquetaria localizada y la formación de coágulos2,4. Tras la activación endotelial, las plaquetas se adhieren al factor von Willebrand (VWF), una proteína multimérica liberada de ECs, o a sitios de unión expuestos de la matriz subendotelial subyacente. Posteriormente, los cambios moleculares en las plaquetas y la exposición al factortisular(TF) inician la activación del sistema de coagulación, lo que induce la formación de trombos por polimerización de fibrina5,6. Juntos, el coágulo resultante proporciona la base para el cierre de la herida por re-endotelialización7. Las perturbaciones del sistema de coagulación pueden dar lugar a trastornos hemorrágicos, como la enfermedad de von Willebrand, la hemofilia o la trombosis, que a menudo resultan de un equilibrio pro y antitrombótico desregulado de la vía hemostatica endotelial2,,3.
El proceso de hemostasia se produce tanto en circulación arterial como venosa. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la trombosis arterial y venosa son fundamentalmente diferentes. Mientras que la trombosis arterial, como se ve en la cardiopatía isquémica, es impulsada principalmente por la ruptura de una placa aterosclerótica en condiciones de alto estrés de cizallamiento, trombosis venosa se desarrolla principalmente en ausencia de lesión endotelial en una condición de éxtasis8,,9,10. Un trombo venal profundo puede embolizarse y viajar hacia las arterias pulmonares, donde causa una embolia pulmonar. Esto puede dar lugar a obstrucciones vasculares crónicas que conducen a un deterioro significativo de las capacidades funcionales que podrían fomentar el desarrollo de enfermedades pulmonares chónicas, incluyendo el desarrollo de hipertensión pulmonar tromboembólica crónica (CTEPH)11,12,13,14. La CTEPH se caracteriza por una presión pulmonar elevada debido a obstrucciones de las arterias pulmonares por material tromboembólico después de al menos tres meses de terapia de anticoagulación15. Además de las embolias pulmonares, se postula que el endotelio pulmonar proporciona un ambiente protrombótico en la CTEPH que facilita la trombosis in situ y las obstrucciones crónicas de las arterias pulmonares, causando el aumento de la presión arterial que en última instancia puede resultar en insuficiencia cardíaca, si no se trata16,17.
En los últimos años, diversos estudios han llevado al desarrollo de ensayos para examinar la formación de trombos midiendo la función plaquetaria y la coagulación18. Sin embargo, la mayoría de ellos estudian la interacción de sangre entera con componentes de matriz extracelular individual como colágenos o fibrines, o función endotelial en interacción con componentes sanguíneos individuales, como la interacción endotelial-plaquetaria o endotelial-leucocitos19,,20,,21,,22. Estos ensayos se realizan más comúnmente con células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC), ya que estas células se obtienen fácilmente. Sin embargo, los genes hemostáticos se expresan diferencialmente a través del árbol vascular, los tipos de vasos y los sistemas de órganos23,24, lo que hace que el uso de HUVEC para representar células endoteliales implicadas en trombosis arterial o embolsias pulmonares problemático23.
Además de la plasticidad EC, las alteraciones hemodinámicas específicas de la enfermedad y los cambios en la morfología vascular pueden promover la formación de trombos en el endotelionormal 25. Las tasas de cizallamiento más altas, debido a la vasoconstricción local o a cambios en la geometría de los vasos, por ejemplo, pueden dar lugar a una formación aguda de trombos, causando una estenosis que acelera el cese del flujo sanguíneo26. El uso de canales de flujo microingenieros hechos a medida permite diseñar específicamente geometrías vasculares que son representativas de la biología (patho). De esta manera, es posible estudiar el efecto de las fuerzas biomecánicas locales en la EC27sana o enferma.
Existen terapias de anticoagulación disponibles para apuntar a diferentes fases y moléculas en la cascada de coagulación, que representan riesgos y beneficios particulares que pueden ser específicos de ciertos trastornos. El enfoque del modelado de enfermedades descrito en este documento es especialmente adecuado para probar los efectos de varias terapias de anticoagulación y antiplaquetarios en la dinámica del trombo.
El objetivo es presentar un modelo de trombosis que incluya ECs primarios, produciendo un modelo versátil adecuado para el análisis de diversas formas de trombosis dependiendo del tipo de ECs primarios utilizados. Como ilustración, utilizamos células endoteliales de la arteria pulmonar de pacientes con CTEPH en interacción con sangre humana entera que contiene todos los componentes involucrados en la formación de trombos (plaquetas, leucocitos, eritrocitos, proteínas de coagulación y cofactores). Este enfoque se puede aplicar en canales de flujo paralelos comerciales o en canales de flujo microfluídicos hechos a medida con un diseño vascular específico. Como tal, el modelo puede eventualmente ser utilizado en el estudio de la formación y resolución de trombos, para la evaluación de las respuestas inflamatorias en el modelado de enfermedades, para la terapia antiplaquetaria o anticoagulación, y en última instancia para la medicina personalizada.
Este estudio describe el aislamiento de las células endoteliales de la arteria pulmonar humana primaria. Para el aislamiento de otros tipos primarios de células endoteliales humanas, nos referimos a métodos publicados previamente, incluyendo células endoteliales microvasculares pulmonares25,células endoteliales de venas umbilicales humanas28, y colonia endotelial circulante de sangre formando células Figura 1A29.
Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Ética Médica institucional del VU Medical Center Amsterdam, Países Bajos (METC VUmc, NL69167.029.19). El aislamiento de células primarias y la recolección de sangre de los seres humanos se realizaron después de obtener el consentimiento informado por escrito de conformidad con la Declaración de Helsinki.
1. Aislamiento y cultivo de células endoteliales arteriales pulmonares humanas primarias (PAEC)
2. Preparación de cámaras de flujo y monocapas PAEC
NOTA: Dependiendo de la hipótesis, utilice las cámaras de flujo disponibles comercialmente (véase Tabla de materiales y Figura 1C Opción A, paso 2.1 del protocolo) o una cámara de flujo microfluídica a medida(Figura 1C Opción B, paso 2.2 del protocolo).
3. Preparación de sangre entera humana
4. Montaje del sistema de flujo
5. Configuración del microscopio para la adquisición de imágenes
6. Perfusión de sangre entera sobre los PAEC
7. Fijación y postanálisis
NOTA: Para excluir la falsa adhesión plaquetaria positiva por daño endotelial debido al experimento de perfusión, es necesario caracterizar las células endoteliales para su formación de huecos y monocapa. Esto se puede hacer mediante la tinción regular de inmunofluorescencia para la cadherina VE.
8. Análisis de imagen
Los resultados representativos se pueden dividir en tres partes, cada una de las cuales representa los pasos respectivos de configuración experimental, recopilación de datos y análisis de datos. Dependiendo de la pregunta de investigación, los parámetros para cada paso se pueden cambiar. Los datos presentados se aplican para estudiar la influencia del endotelio en la formación de trombos.
Configuración experimental
Está bien establecido que las células endoteliales son altamente heterogéneas en estructura y función, dependiendo de la ubicación y el tiempo, durante la salud y la enfermedad23. Varias fuentes de células endoteliales se pueden utilizar para estudiar la interacción endotelial-sangre, que en este caso eran HUVECs y PAEC disponibles comercialmente (Figura 1A). Los HUVEC han sido los más utilizados en modelos de laboratorio, mientras que los PAEC son células aisladas derivadas del paciente de las arterias pulmonares. Además, existen protocolos bien establecidos para aislar las células endoteliales microvasculares (MVEC) de la circulación pulmonar o de las células formadoras de colonias endoteliales circulantes de sangre (ECFC)25,,28,,29.
Después del aislamiento, las células endoteliales se caracterizaron por la tinción de VE-cadherina, CD31 y TIE2 para confirmar un fenotipo endotelial. La caracterización de la presencia de la SMA y la citoqueracina indicaba la ausencia de un fibroblasto o fenotipo similar a un epitelial(Figura 1B). Después de obtener una población altamente pura de ECs, se utilizaron células de paso 3-5 para sembrar un microdeslizo comercial o canales de flujo microfluídicos hechos a medida (Figura 1C). Mientras que los microdeslizos disponibles comercialmente son principalmente cámaras de flujo paralelas, o canales en forma de Y con parámetros definidos específicamente en altura o ángulo de bifurcación, el uso de diapositivas microfluídicas permite adaptar los parámetros experimentales a la geometría del vaso in vivo y la dinámica del flujo sanguíneo31. Sin embargo, los tamaños microfluídicos hechos a medida son más pequeños y tienden a limitar la propagación celular e inducir más muerte celular32,,33. El uso de un excedente de células compensa el hecho de que sólo un pequeño porcentaje de células se adhieren. Esto se observó cuando se introdujo una estenosis, donde las células endoteliales mostraron un fenotipo más alargado en comparación con un canal microfluídico paralelo(Figura 1D). Las cámaras de flujo comercial tienen un área de superficie más grande a la que las células pueden unirse. Esto requiere menos números de celda para la siembra.
Para estudiar la interacción endotelial de células celulares y sangre, toda la sangre se perfundió sobre una monocapa endotelial. La sangre citrated se recogió el día del experimento e inmediatamente antes de la perfusión recalificada. Las células fueron estimuladas con histamina para inducir la liberación de VWF y la adhesión plaquetaria 30 min antes de la perfusión (Figura 1E)34,35. Debido a las pequeñas dimensiones, los canales microfluídicos hechos a medida permitieron el uso de volúmenes sanguíneos más pequeños.
Recopilación de datos
Para investigar la formación de trombos en los PAEC, los glóbulos con etiqueta fluorescente Calcein AM-Red y la fibrina conjugada Alexa488 se perfundieron durante 5 minutos a 2,5 dyne/cm2 (Figura 2A–C). Se cuantificaron las células sanguíneas adherentes y la fibrina depositada. Las imágenes se adquirieron cada 30 s y se cuantificaron con ImageJ. Era importante restar el fondo para eliminar la autofluorescencia de las plaquetas no adheridas. El algoritmo de triángulo para el umbral se ha utilizado para definir un fondo mínimo. Permitió la medición de pequeños agregados plaquetario(Figura 2D).
Se espera que, en condiciones no estimuladas, no hubo unión de plaquetas y fibrina al endotelio. Para promover la liberación de VWF y la unión plaquetaria, los PAEC fueron estimulados con histamina, lo que resultó en un aumento inmediato de la adhesión plaquetaria alcanzando una meseta después de 2,5 min. En este momento, las plaquetas comenzaron a secretar factores autocrinos que indujeron la agregación plaquetaria y la escisión de fibrinógeno en fibrina. La fibrina se depositó después de 3 min y formó un agregado estable con plaquetas después de 4 min(Figura 2E).
Para investigar si este efecto podría ser inhibido por un anticoagulante oral directo (DOAC), la sangre fue tratada con 10 nM dabigatran. Dabigatrán se añadió a la dilución de la sangre, donde inhibe el factor IIa en la vía de coagulación, y previno el escisión de fibrinógeno para formar fibras de fibrina. Cuando la sangre tratada con dabigatrán se perfundió sobre los PAC estimulados, la formación de coágulos podría inhibirse directamente principalmente retrasando la deposición de fibrina (Figura 2F).
Análisis de datos
Para estudiar la influencia de varias fuentes endoteliales en la formación de trombos, se analizaron los cambios celulares a 5 min de perfusión sanguínea. El endotelio se fijó y las plaquetas adherentes se etiquetaron con CD42b antes de la toma de imágenes bajo un microscopio confocal. Esto proporcionó un análisis detallado para la colocación de plaquetas y fibrina que podría indicar factores de coagulación disfuncionales en la sangre. La influencia de la EC en la formación de coágulos se determinó mediante tinción inmunofluorescente estándar. Se mantuvieron los contactos de células celulares endoteliales, como lo confirmó la tinción de VE-cadherina, lo que indica que los coágulos sanguíneos se formaron en la parte superior de la monocapa endotelial en lugar de en la matriz subyacente entre las brechas endoteliales (Figura 3). Además, el uso de diferentes fuentes celulares dio lugar a diferentes patrones de trombos que se forman en el endotelio. Los HUVEC son células endoteliales venosas y mostraron una adhesión plaquetaria limitada y una deposición de fibrina, mientras que los pacientes enfermos de PAEC primario de CTEPH mostraron una abundante adherencia plaquetaria y más deposición de fibrina en la estimulación de la histamina en comparación con el PAEC sano. Esto sugiere que el endotelio de los pacientes con TEPH muestra una mayor capacidad de respuesta a la vasoactivación que resulta en un aumento de la formación de trombos.
Figura 1: Descripción general esquemática del protocolo. (A) Varias fuentes y diferentes tipos de células endoteliales se aislaron y cultivaron para su uso en un canal de flujo microfluídico para experimentos de perfusión. Imágenes representativas de campo brillante de diferentes tipos de células endoteliales. Barra de escala a 50 m. (B) Las células aisladas se caracterizaron por tinción inmunofluorescente para confirmar un fenotipo endotelial. Barra de escala a 50 m. (C) Las celdas se pueden sembrar en diapositivas de flujo comercial o en canal microfluídico hecho a medida. (D) Imágenes representativas de campo brillante de HUVEC cultivadas en diferentes geometrías de canal. Barra de escala a 50 m. (E) Configuración experimental de experimentos de perfusión sanguínea. Se recogió sangre citrated, se diluyó con tampón salino y se perfundió sobre las células endoteliales con una bomba de jeringa. La vena pulmonar y umbilical de esta figura fueron modificadas de Servier Medical Art, licenciada bajo una Licencia Genérica Creative Common Attribution 3.0. http://smart.servier.com/ Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Adquisición de imágenes y cuantificación de la formación de trombos. (A) Imágenes representativas de lapso de tiempo de las plaquetas adelantadas con etiquetas Calcein AM-Red y fibrina conjugada Alexa488 a 1, 3 y 5 min después de la perfusión de sangre entera sobre LOS PAEC no estimulados (B) y sobre las PAC estimuladas por histamina. (C) Imágenes representativas de lapso de tiempo de adhesión plaquetaria y deposición de fibrina a 1, 3 y 5 minutos de perfusión con sangre entera incubada con dabigatrán perfundido sobre LOS PAEC estimulados por histamina. Barra de escala a 50 m. (D) Visión general esquemática de la cuantificación de imágenes en ImageJ. (E) Cuantificación de la adhesión plaquetaria y deposición de fibrina por cada 30 s en un endotelio estimulado por histamina no estimulada. (F) Cuantificación del efecto del dabigatrán en la formación de trombos cuantificado por adhesión plaquetaria y deposición de fibrina. Los datos se representan como ± SD, n a 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes confocales representativas de experimentos de flujo para caracterizar la formación de trombos en la adhesión plaquetaria y la deposición de fibrina en células endoteliales. Los contactos de células celulares endoteliales se caracterizaron por VE-cadherina y se midieron en PAEC de control, PAC CTEPH derivados del paciente y HUVEC. Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La coagulación es el resultado de la interacción compleja y controlada temporalmente entre el endotelio y los componentes sanguíneos. Este ensayo in vitro presenta un método para investigar las propiedades trombogénicas de las células endoteliales en tiempo real. Se pueden utilizar varios tipos de células endoteliales humanas primarias, facilitando la trombosis in situ de una manera específica del órgano y del paciente. En este estudio, ilustramos el uso de este protocolo comparando las propiedades trombogénicas de los PAEC aislados de donantes sanos frente a los pacientes con TEPH. La formación de trombos vivos se estudió por perfusión de sangre entera de sujetos sanos sobre el endotelio activado por histamina, mientras que el efecto de un DOAC se probó como un agente antitrombótico.
Además del uso de microcanales disponibles comercialmente, como se muestra en los resultados representativos, la introducción de los canales microfluídicos hechos a medida permite el estudio de la influencia de los cambios de geometría vascular en la formación de trombos. Por ejemplo, el flujo disminuye en un punto de rama o estenosis da como resultado un aumento en la tensión de cizallamiento y una mayor activaciónplaquetaria 36. Sin embargo, una limitación significativa de estos canales microfluídicos hechos a medida es el requisito de números de celdas altos para formar una monocapa estable de ECs como se describe en el paso 2.3.2. Esto puede presentar un factor limitante cuando las células derivadas del paciente son escasas. Los puntos fuertes de los microdeslizos disponibles comercialmente son que las áreas superficiales se modifican para el cultivo celular y las áreas de crecimiento son más grandes, lo que permite a los CIE formar una monocapa confluente y estable. Por otro lado, una superficie más grande resultará en un lumen más grande. Según la Ecuación 1,esto requiere mayores volúmenes de sangre para alcanzar velocidades de flujo similares a las de los microfluídicos hechos a medida.
Una mejora de este protocolo podría ser investigar la pérdida de EC en vivo o los cambios en la integridad de la barrera. Los daños de la CE en este protocolo sólo se miden al final del experimento. Para el seguimiento en vivo, los ECs se pueden etiquetar con mCherry VE-cadherin, por ejemplo37. Sin embargo, como esto necesitaría un protocolo altamente optimizado con transfección de virus eficiente, la detección de impedancia de sustrato de células eléctricas (ECIS) podría utilizarse como una alternativa para estudiar la integridad endotelial y la función de barrera38. La perfusión sobre canales de flujo ECIS especiales permite la monitorización longitudinal de la integridad de la barrera endotelial bajo flujo. Estas características específicas de ECIS permiten mediciones paralelas de propiedades de barrera endotelial y formación de trombos. Las formas alternativas para las mediciones de barreras EC paralelas, especialmente en los arreglos a medida, incluyen el uso de dextrans fluorescente en el perfusado, que se difunden fuera del lumen, dependiendo de las propiedades de barrera de la CE.
Una limitación del protocolo descrito es que los EC se eliminan del cuerpo humano y se cultivan en plástico de cultivo de tejidos, que es un sustrato rígido y artificial. Las células se adaptan a su entorno biofísico. Esto podría afectar a la respuesta endotelial a la activación plaquetaria, ya que existe una asociación entre la activación plaquetaria y la rigidez de la pared39. A pesar de estas adaptaciones a los plásticos de cultivo, las células mantienen características específicas de la enfermedad que se pueden identificar en comparación directa con las CE derivadas de donantes sanos como se muestra con el control, CTEPH-PAEC, y HUVEC que ejerció diferentes patrones de adhesión plaquetaria y deposición de fibrina después de 5 minutos de perfusión de sangre.
A diferencia de otros protocolos, este sistema utiliza sangre entera, mientras que otros estudian la interacción de la CE con un único componente sanguíneo como plaquetas y leucocitos19,,20,,21. Se han desarrollado modelos microfluídicos más avanzados que permiten el estudio de la función endotelial en un modelo vascular con geometría de recipiente redondo y matriz extracelular suave. Sin embargo, estos están optimizados con HUVECs40,,41,42. La novedad del protocolo descrito es el uso de ECs primarios combinados con sangre entera que acerca el modelado de la trombosis in situ un paso más cerca de las condiciones in vivo. Una vez optimizado el protocolo para el uso de ECs derivadas del paciente y la sangre derivada del paciente, optimiza aún más el modelado de enfermedades in vitro,lo que permite evaluar la formación personalizada de trombos y el tratamiento farmacológico.
El protocolo descrito se puede aplicar para estudiar el efecto de las terapias de anticoagulación en las células derivadas del paciente. Mientras que usamos dabigatrán para inhibir la formación de trombos, es posible utilizar otros anticoagulantes, como el rivaroxabán, que inhibe directamente el factor Xa en la cascada de coagulación. También se pueden estudiar inhibidores de plaquetas directas como clopidogrel o aspirina, ya que actúan en la fase primaria de la hemostasia, donde las plaquetas se unen a las CE. En última instancia, las capacidades trombogénicas de las ECs específicas del paciente en interacción con la propia sangre del paciente se pueden utilizar para predecir el efecto personal de la terapia de anticoagulación en el paciente individual. Además, un derribo de proteínas específicas puede proporcionar información funcional adicional.
Hay algunos pasos en el protocolo descrito que son críticos para un experimento de perfusión exitoso. En primer lugar, durante el aislamiento de las células primarias, es necesario obtener un cultivo de EC altamente puro. En segundo lugar, es importante que los ECs formen una monocapa confluente estable. Si este no es el caso, un ligero cambio en el estrés de cizallamiento puede causar daño endotelial y activación de la cascada de coagulación, o las plaquetas pueden comenzar a unirse a la membrana del sótano, lo que proporcionará resultados falsos positivos. En tercer lugar, es esencial prevenir las burbujas de aire, ya que pueden dañar el endotelio y así influir en los resultados.
Después de la recalcificación de la sangre citrated con cloruro de calcio y cloruro de magnesio, es importante iniciar inmediatamente el experimento de perfusión. La recalcificación induce una respuesta rápida en la activación plaquetaria y la formación de trombos, lo que resulta en una coagulación rápida en la muestra.
En conclusión, describimos un protocolo altamente versátil para estudiar interacciones de células endoteliales de sangre enteras durante la trombosis.
Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.
Agradecemos a Jan Voorberg, del Departamento de Proteínas de Plasma, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academic Medical Center, Amsterdam, Países Bajos, por su aportación en este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Dutch CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-11] otorgada a Phaedra y el consorcio Reconnect, así como la subvención Impulse 2018 otorgada al consorcio Phaedra IMPACT. Estas subvenciones incluyen financiación colectiva de la Fundación Holandesa del Corazón, la Federación Holandesa de Centros Médicos Universitarios, la Organización Neerlandesa para la Investigación y el Desarrollo de la Salud y la Real Academia neerlandesa de Ciencias. Además, este trabajo fue financiado por el Consejo Europeo de Investigación en el marco del programa de Subvenciones Avanzadas «VESCEL» (Número de subvención: 669768). XDM está financiado por una beca de investigación del Instituto de Investigación Cardiovascular (ICaR-VU) en el Vu University Medical Center, Amsterdam, Países Bajos.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
NaCl | Merck | 106404 | |
20 mL syringe | BD | 300613 | |
20X objective | Olympus | N1492900 | LUCPLFLN20XPH/0.45 |
2-Propanol (IPA) | Boom | 760514555000 | |
Aladdin Syringe Pump | Word Precision Instruments | AL-4000 | |
Alexa488-Fibrinogen | Invitrogen | F13191 | 15 ug/mL |
Alexa647-Goat anti Rabbit | Invitrogen | A21245 | 1:100 |
Biopsy punch 1 mm diameter | Ted Pella | 15110-10 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | |
Calcein AM-Red | Invitrogen | C3099 | 1:1000 |
CD42b-APC | Miltenyi Biotec | 130-100-208 | 1:100 |
Citric Acid | Merck | 100244 | |
Collagen Type I, rat tail | Corning | 354249 | 0.1 mg/mL |
Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish | Corning | 3295 | |
Cross-flow hood | Basan | ||
Desiccator | Duran | 2478269 | |
D-Glucose | Merck | 14431-43-7 | |
EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fibronectin Human Plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
Flow tubing | ibidi | 10831, 10841 | |
Gelatin | Merck | 104070 | 0.1% |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 1:1000 |
micron-Slide VI 0.4 flow chambers | ibidi | 80606 | |
ImageJ | NIH | v1.49 | |
KCl | Merck | 7447-40-7 | |
Lab oven | Quincy | 10GC | |
LS720 Fluorescent microscope | Etaluma | LS720 | |
Luer connector | ibidi | 10802, 10825 | Male elbow connectors, Female tube connectors |
MACS magnetic beads (anti-CD144) | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | 1:5 |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
Microscopy slides, 76 x 26 mm | Thermo Scientific | AAAA000001##12E | |
Negative photoresist, SU-8 | Microchem | ||
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Lonza | 13-114E | |
Paraformaldehyde (PFA) | Merck | 818715 | 4% PFA in PBS |
Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco | 15140-122 | 1% |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-094 | no calcium or magnesium |
Plasma chamber, CUTE | Femto Science | ||
Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 | Dow | 101697 | |
sodium citrate blood collection tubes | BD | 363048 | |
trisodium citrate | Merck | 106448 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-045 | |
VE-Cadherin (D87F2)-XP | Cell Signaling | 2500 | 1:300 |
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