Modello di malattia microfluidico in vitro per studiare le interazioni sangue-endoteliali intere e le dinamiche del coagulo di sangue in tempo reale

Presentiamo un modello di malattia vascolare in vitro per studiare le interazioni del sangue intero con l'endotelio derivato dal paziente. Questo sistema permette lo studio delle proprietà trombogeniche delle cellule endoteliali primarie in varie circostanze. Il metodo è particolarmente adatto per valutare in situ trombogenicità e terapia anticoagulante durante diverse fasi della coagulazione.

La formazione di coaguli di sangue comporta interazioni complesse tra le cellule endoteliali, la loro matrice sottostante, varie cellule del sangue, e proteine. L'endotelio è la fonte primaria di molte delle principali molecole emostatiche che controllano l'aggregazione delle piastrine, la coagulazione e la fibrinolisi. Anche se il meccanismo della trombosi è stato studiato per decenni, gli studi in vitro si concentrano principalmente su situazioni di danno vascolare in cui la matrice subendoteliale viene esposta, o sulle interazioni tra le cellule con singoli componenti del sangue. Il nostro metodo permette di studiare le interazioni tra sangue intero e una rete di cellule vascolari intatte e confluenti.

Utilizzando le cellule endoteliali umane primarie, questo protocollo offre l'opportunità unica di studiare l'influenza delle cellule endoteliali sulle dinamiche del trombo e fornisce preziose informazioni sulla fisiofisiologia della malattia trombotica. L'uso di canali di flusso microfluidico su base personalizzata consente l'applicazione di geometrie vascolari specifiche della malattia e cambiamenti vascolari morfologici specifici del modello. Lo sviluppo di un trombo è registrato in tempo reale e quantitativamente caratterizzato da adesione piastrine e deposizione di fibrina. L'effetto della funzione endoteliale nella dinamica alterata del trombo è determinato dalla postanalysis attraverso la colorazione dell'immunofluorescenza di molecole specifiche.

I risultati rappresentativi descrivono l'impostazione sperimentale, la raccolta dei dati e l'analisi dei dati. A seconda della domanda di ricerca, i parametri per ogni sezione possono essere regolati tra cui il tipo di cellula, i tassi di taglio, la geometria del canale, la terapia farmacologica e le procedure di postalisi. Il protocollo è convalidato quantificando la formazione di trombo sulla pulmoniale endotelio dell'arteria polmonare dei pazienti con malattia tromboembolica cronica.

L'endotelio forma lo strato cellulare interno dei vasi sanguigni e separa il sangue dal tessuto circostante. È stato descritto come un organo dinamico che regola attivamente il suo micro-ambiente e risponde agli stimoli esterni¹. A causa del suo contatto diretto con il sangue che scorre, l'endotelio è fondamentale nel controllo dell'emostasi e della trombosi ed è la fonte primaria di molte delle principali molecole regolatorie che controllano l'aggregazione delle piastrine, la coagulazione e la fibrinolisi². Le cellule endoteliali sane e non attivate (EC) producono diverse molecole che contrastano l'attivazione delle piastrine e impediscono la coagulazione e la formazione di trombosi per mantenere il flusso sanguigno, come la prostaciclina, la trombomodulina o l'inibitore del percorso del fattore tissutale (TFPI)^2,3. Ciò impedisce l'adesione di piastrine, aggregazione piastrine, e la formazione di trombo. Lesione o attivazione della parete del vaso si traduce in un fenotipo endoteliale procoagulant che avvia l'adesione delle piastrine localizzate e la formazione del^{coagulo 2,4}. Dopo l'attivazione endoteliale piastrine aderire a von Willebrand Factor (VWF), una proteina multimerica rilasciata da ECs, o ai siti di legame esposti della matrice subendoteliale sottostante. Successivamente, i cambiamenti molecolari nelle piastrine e l'esposizione al fattore tessuto (TF) avviano l'attivazione del sistema di coagulazione, che induce la formazione di trombo per polimerizzazione fibrina^5,6. Insieme, il coagulo risultante fornisce la base per la chiusura delle ferite mediante re-endotelializzazione⁷. Le perturbazioni del sistema di coagulazione possono provocare disturbi emorragici, come la malattia di von Willebrand, l'emofilia o la trombosi, che spesso derivano da un equilibrio pro-e antitrombotico disregolato del percorso emostatico endoteliale^2,3.

Il processo di emostasi si verifica sia nella circolazione arteriosa che venosa. Tuttavia, i meccanismi alla base della trombosi arteriosa e venosa sono fondamentalmente diversi. Mentre la trombosi arteriosa, come si vede nella cardiopatia ischemica, è per lo più guidata dalla rottura di una placca aterosclerotica in condizioni di alto stress di taglio, la trombosi venosa si sviluppa principalmente in assenza di lesioni endoteliali in una condizione di stasi^8,9,10. Un trombo venito profondo può embolizzare e viaggiare verso le arterie polmonari, dove provoca un'embolia polmonare. Ciò può provocare ostruzioni vascolari croniche che portano a significative capacità funzionali compromesse che potrebbero favorire lo sviluppo di malattie polmonari chonic tra cui lo sviluppo di ipertensione polmonare tromboembolica cronica (CTEPH)^11,12,13,14. Il CTEPH è caratterizzato da una pressione polmonare elevata dovuta a ostruzioni delle arterie polmonari da parte di materiale tromboembolico dopo almeno tre mesi di terapia anticoagulante¹⁵. Oltre all'emboli polmonare, è postulato che l'endotelio polmonare fornisca un ambiente protrombotico in CTEPH che facilita la trombosi in situ e le ostruzioni croniche delle arterie polmonari, causando l'aumento della pressione sanguigna che alla fine può provocare insufficienza cardiaca, se non trattata^16,17.

Negli ultimi anni, vari studi hanno portato allo sviluppo di saggi per esaminare la formazione di trombo misurando la funzione delle piastrine e la coagulazione¹⁸. Tuttavia, la maggior parte di loro o studiare l'interazione di sangue intero con singoli componenti di matrice extracellulare come collageni o fibrin, o funzione endoteliale in interazione con singoli componenti del sangue, come endoteliale-piastrine o interazione endoteliale-leucocato^19,20,21,22. Questi saggi sono più comunemente eseguiti con cellule endoteliali vene ombelicali umane (HUVEC), come queste cellule sono facilmente ottenute. Tuttavia, i geni emostatici sono espressi in modo differenziale tra l'albero vascolare, i tipi di vaso e i sistemi di organi^23,24, che fa uso di HUVEC per rappresentare le cellule endoteliali coinvolte nella trombosi arteriosa o nelle embolie polmonari problema²³.

Oltre alla plasticità comunitaria, le alterazioni emodinamiche specifiche della malattia e i cambiamenti nella morfologia vascolare possono promuovere la formazione di trombo al normale endotelio²⁵. Tassi di taglio più elevati, a causa della vasoconstriction locale o dei cambiamenti nella geometria del vaso, ad esempio, possono provocare la formazione di trombosi acuta, causando una stenosi che accelera la cessazione del flusso sanguigno²⁶. L'uso di canali di flusso microingegneri su base personalizzata consente di progettare specificamente geometrie vascolari rappresentative della biologia (pato). In questo modo, è possibile studiare l'effetto delle forze biomeccanici locali sulla CE^{27 sana o mata.}

Ci sono terapie anticoagulanti disponibili per il targeting di diverse fasi e molecole nella cascata di coagulazione, che tutti pongono rischi e benefici particolari che possono essere specifici per alcuni disturbi. L'approccio della modellazione della malattia descritto in questo documento è particolarmente adatto per testare gli effetti di varie terapie anticoagulanti e antiplatelet sulla dinamica del trombo.

L'obiettivo è quello di presentare un modello di trombosi che includa eC primarie, producendo un modello versatile adatto per l'analisi di varie forme di trombosi a seconda del tipo di ECs primario utilizzato. A prima illustrazione, abbiamo usato cellule endoteliali dell'arteria polmonare di pazienti affetti da CTEPH in interazione con sangue umano intero contenente tutti i componenti coinvolti nella formazione di trombi (piastrine, leucociti, erytrociti, proteine di coagulazione e cofattori). Questo approccio può essere applicato nei canali di flusso paralleli commerciali o in canali di flusso microfluidico su su cui su modelli con una progettazione vascolare specifica. Come tale, il modello può eventualmente essere utilizzato nello studio della formazione e risoluzione del trombo, per la valutazione delle risposte infiammatorie nella modellazione della malattia, per la terapia antiplatelet o anticoagulante e, infine, per la medicina personalizzata.

Questo studio descrive l'isolamento delle cellule endoteliali dell'arteria polmonare primaria. Per l'isolamento di altri tipi di cellule endoteliali umane primarie, ci riferiamo a metodi precedentemente pubblicati, tra cui le cellule endoteliali microvaricolari polmonari²⁵, le cellule endoteliali della vena ombelicale^{umana 28}e le cellule di formazione della colonia endoteliale circolante del sangue Figura 1A²⁹.

Questo studio è stato approvato dal Medical Ethical Review Board istituzionale del VU Medical Center di Amsterdam, Paesi Bassi (METC VUmc, NL69167.029.19). L'isolamento delle cellule primarie e la raccolta del sangue dei soggetti umani sono stati eseguiti dopo che il consenso scritto informato è stato ottenuto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki.

1. Isolamento e coltura delle cellule endoteliali arteriali polmonari primarie (PAEC)

1. Mezzo a cellule endoteliali complete calde (CECM) integrato con 5% di siero bovino fetale (FBS), 1% penicillina/streptomicina (P/S), 1% integratori per la crescita delle cellule endoteliali (ECGS) e 1% aminoacidi non essenziali (NEAA), in un bagno d'acqua a 37 C. Sterilizzare forbici chirurgiche, forbici e un bisturi con uno sterilizzatore termico di 120 gradi centigradi o etanolo al 70%. Eseguire l'isolamento della PAEC in un mobile di flusso laminare in condizioni sterili.
2. Rivestire una cella ad alta affinità che lega una coltura cellulare di 60 mm (vedi Tabella dei materiali) con 2 mL di fibronectina 5 g/mL e incubare a 37 gradi centigradi per almeno 15 minuti.
3. Ottenere il tessuto dell'arteria polmonare (PA) dalla chirurgia(ad esempio,la lobectomia o l'endarterectomia polmonare), conservare in tampone a cavo freddo 4 mM (4 mM cloruro di potassio, 140 mM di cloruro di sodio, 10 mM HEPES, 11 mM D-glucosio, e 1% P/S, pH - 7,3), e mantenere il ghiaccio fino all'isolamento.
4. Isolare le cellule endoteliali da PA entro 2 h dopo la rimozione dei tessuti. Prendere la PA con le forpe e metterla in un piatto Petri da 10 cm da lavare con PBS. Se la PA è ancora un anello, tagliare l'arteria polmonare aperta con le forbici. Fare molta attenzione a non toccare lo strato più interno del vaso con gli strumenti, in quanto l'endotelio è facilmente danneggiato e/o rimosso.
5. Togliere la fibronectina dal piatto di coltura cellulare e aggiungere 4 mL di mezzo cECM.
6. Prendere il tessuto PA con le forcelle e posizionarlo nel mezzo. Nel frattempo, raschiare con attenzione lo strato interno del vaso nel mezzo con un bisturi. Spesso, gli accumuli di lipidi possono essere visti nella parete del vaso. Cercate di ometterli, in quanto avranno un impatto sulla crescita cellulare.
7. Mantenere le cellule in coltura fino a quando piccole colonie di cellule endoteliali iniziano a comparire.
8. Sostituire il supporto a giorni diversi. Se i fibroblasti contaminano la coltura, purificarla con la separazione cellulare di affinità magnetica per CD144 con un kit, in conformità alle istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). Utilizzare il metodo a due colonne per la purificazione iniziale e il metodo a una colonna per ogni purificazione consecutiva. In genere, una coltura è definita pura quando la citometria del flusso rileva ≤10% cellule contaminanti.
9. Dividere le celle in rapporti da 1:3 a 1:4 fino a quando non vengono coltivati sufficienti PACE per un uso sperimentale. Quando i PACE sono pronti per l'uso, continuare con il passaggio successivo.
10. Dopo la purificazione, le cellule endoteliali primarie devono essere caratterizzate per la presenza di marcatori specifici EC(ad esempio, VE-cadherin, CD31, TIE2) e per l'assenza di cellule muscolari lisce (α-SMA), fibroblasti (vimentin) ed epiteliali (citokeratin) marcatori (Figura 1B).

2. Preparazione delle camere di flusso e dei monostrati PAEC

NOTA: A seconda dell'ipotesi, utilizzare le camere di flusso disponibili in commercio (vedere Tabella dei materiali e Figura 1C Opzione A, passaggio 2.1 del protocollo) o una camera di flusso microfluidica su cui è fatta(Figura 1C Opzione B, passaggio 2.2 del protocollo).

1. Semina cellulare di monostrati endoteliali in microscienze disponibili in modo commerciale
   NOTA: Le camere di flusso disponibili in commercio sono facili da usare e forniscono un modello di flusso laminare in tutto il canale che può essere utilizzato a velocità di taglio elevate. Queste micrososcenze sono progettate per consentire corse parallele multicanale e fornire un profilo di flusso accurato e riproducibile. Poiché sono ottimizzati per la microscopia invertita, è possibile catturare immagini fluorescenti di alta qualità. Inoltre, varie dimensioni delle camere di flusso sono disponibili in diverse dimensioni di canale o geometrie. I canali di flusso 6-well sono preferiti per questo saggio perché queste microslide hanno piccole dimensioni e consentono corse multiparallel.
   1. Per rivestire un canale di una diapositiva a flusso di 6 gradi (3,5 mm di larghezza x 0,4 mm di altezza x 17 mm di lunghezza) utilizzare 30 L dello 0,1% di gelatina per canale e incubare a 37 gradi centigradi per almeno 15 minuti.
   2. Per eseguire il seme di un canale, provare a eseguire il semina 10 cm² di PAIC confluenti e girare verso il basso a 300 x g per 7 min a temperatura ambiente (RT).
   3. Sospendere i PAEC in 600 L di cECM e pipette 100 L (1,5 cm² ) di sospensione cellulare in un canale. Questo copre la microsopertura attraverso l'azione capillare. Se sta andando troppo lento, bolle d'aria si formeranno. Evitare la formazione di bolle d'aria utilizzando un po 'più di forza durante il pipettamento.
      NOTA: La densità cellulare influenza il fenotipo endoteliale. Un totale di 1,5 cm² di cellule confluenti per canale è troppoconfluente, perché il canale ha una superficie di 0,6 cm². Prima di iniziare l'esperimento, coltura queste cellule per altri 6 giorni all'interno dei canali fino a raggiungere la massima confluenza.
   4. Aggiungere al canale altri 50 L di cECM per fornire un supporto sufficiente per l'incubazione notturna a 37 gradi centigradi, 5% CO₂. Cambiare il mezzo il giorno successivo per lavare via le celle non associate.
   5. Mantenere le cellule in coltura per 6 giorni a 37 gradi centigradi, 5% CO₂ per consentire al PAEC di formare un monostrato solido e confluente. Cambiare il mezzo a giorni in due giorni con 150 L di cECM.
   6. Al giorno 7, trattare la PAEC con 100 L di istamina 1 M in ECM e 1% FBS senza altri additivi per 30 minuti prima del saggio. Lo stimolo può essere scelto ad libitum. Per esempio, TNF-α è stato comunemente usato come attivatore infiammatorio.
2. Preparazione di camere di flusso microfluidiche su su base
   NOTA: Le camere di flusso personalizzate sono adattate alle esigenze dell'utente perché le dimensioni e le geometrie possono essere facilmente modificate in preferenza. Ad esempio, per imitare un recipiente più fisiologicamente rilevante, è possibile introdurre una stenosi (Figura 1D). Questo approccio consente l'uso di volumi di sangue molto piccoli come visto nella malattia microvascolare.
   1. Litigrafia morbida di polidimetilsiloxane (PDMS) utilizzando wafer a motivi modellati
      1. Combinare agente di polimerazione PDMS e prepolimero su un microequilibrio a un rapporto 1:10 e mescolare accuratamente con un mixer di laboratorio di uso generale.
      2. Per rimuovere le bolle d'aria risultanti, degas il PDMS in un desiccatore per circa 1 h.
      3. Foderare un piatto Petri di vetro con un foglio di alluminio e aggiungere alcune goccioline d'acqua prima di mettere il wafer nel piatto Petri foderato. Il wafer funge da stampo per il canale su cui su tanto.
         NOTA: I wafer o gli stampi sono forniti dalle strutture della camera pulita. Il fotoresist negativo è modellato su wafer per creare feature di canale sporgenti con le seguenti dimensioni tipiche: 300 m di larghezza x 270 m di altezza x 14 mm di lunghezza.
      4. Versare il PDMS degassed sul wafer posto in un piatto di vetro Petri.
      5. Degas il PDMS versato sul wafer in un desiccatore per un ulteriore 15 min per rimuovere eventuali bolle che potrebbero essersi formate durante la colata.
      6. Togliere il piatto Petri contenente lo stampo e il PDMS dal desiccatore e rla in forno a 60 gradi per un minimo di 4 h per collegare il PDMS.
   2. Preparazione del PDMS cross-linked per l'incollaggio ai vetrini di vetro
      1. Rimuovere lo stampo e il PDMS incrociato dal forno e passare a un cofano a flusso incrociato per la gestione senza polvere del PDMS.
      2. Rimuovere qualsiasi PDMS dal fondo dello stampo utilizzando un bisturi e rimuovere la lastra superiore del PDMS incrociato dallo stampo.
      3. Fogliate con nastro adesivo a nastro adesivo per evitare che eventuali particelle di polvere esovenino a contatto con i canali PDMS.
      4. Tagliare i trucioli PDMS a dimensioni e punzonare insenature e prese di diametro 1 mm utilizzando un punzone biopsia.
   3. Sterilizzazione e incollaggio di canali microfluidico PDMS e vetrini di vetro
      1. Pulire i vetrini in microscopia mediante risciacquo accuratamente con etanolo seguito da un risciacquo di alcool isopropile. Dopo ogni risciacquo, asciugare accuratamente i vetrini con una pistola azotata.
         NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare le distinte di copertura se l'analisi viene effettuata utilizzando un microscopio confocale.
      2. Aprire la camera al plasma e caricare i vetrini di microscopia puliti e i trucioli microfluidi senza il nastro protettivo.
      3. Chiudere la camera, epurare con azoto per 1 min, e riempire la camera con aria filtrata fino a quando non viene raggiunta una pressione di 500 mTorr.
      4. Esporre i vetrini di vetro e i chip PDMS al plasma per 40 s utilizzando una potenza di 50 W e una frequenza di 5 kHz.
      5. Dopo l'esposizione al plasma, legare immediatamente i vetrini e i chip microfluidi. Conservare i dispositivi in piatti Petri sterili.
3. Semina cellulare di monostrati endoteliali nei canali microfluidico
   1. Rivestire il microcanale su misura mediante pipettamento 10 L di collagene 0,1 mg/mL di tipo I o 0,1% di gelatina per canale e incubare a 37 gradi centigradi per 30 min.
   2. Per seminare quattro microcarici, provare 25 cm² di PAIC confluenti e girare verso il basso a 300 x g per 7 min a RT.
      NOTA: solo una piccola percentuale di celle aderisce alla superficie. Pertanto, è necessario utilizzare un eccesso di cellule per ottenere un monostrato confluente.
   3. Sospendere i PAIC in 20 L di cECM e utilizzare 5 L di sospensione cellulare per ogni canale. A causa delle piccole dimensioni del canale, le forze capillari riempiranno la microsoce e impediranno la formazione di bolle d'aria.
   4. Cambiare il mezzo dopo 3-4 h per lavare le cellule non associate.
   5. Mantenere le cellule in coltura per 6 giorni per consentire alla PAEC di formare un monostrato solido e confluente. A causa del piccolo volume, cambiare il mezzo ogni giorno con 150 L di cECM. Lasciare la punta della pipetta riempita con mezzo nell'ingresso e mettere una punta vuota nella presa. Questo servirà come serbatoio fornendo nutrienti sufficienti e fattori di crescita per le cellule e impedire lo scivolo di asciugarsi.
   6. Il giorno 7, macchiare i nuclei nelle cellule vive con Hoechst (1:5.000 in cECM) e incubare per un massimo di 10 min a 37 gradi centigradi e 5% CO₂.
   7. Lavare con cura 3x con cECM e trattare con 1 istamina di M in ECM - 1% FBS per 30 min prima del saggio. Lo stimolo può essere scelto ad libitum. Per esempio, TNF-α è stato comunemente usato come attivatore infiammatorio.
   8. Utilizzare connettori in acciaio inossidabile angolati di 1,27 mm di diametro 90 per collegare l'uscita dei chip PDMS ai tubi.

3. Preparazione del sangue umano intero

1. Disegnare sangue venoso da soggetti in 0,109 M citrato di sodio anticoagulante. Questo può essere da soggetti sani o maati che non ricevono il trattamento anticoagulante. Invertire delicatamente i tubi per mescolare. La quantità totale di sangue necessaria per un esperimento dipende principalmente dalla velocità di flusso selezionata. Con una velocità di 25 mL/h, in ibidi diapositive 6-well, un volume totale di 2 mL con un po 'di eccesso per riempire vasche e canale di flusso è sufficiente.
2. Trasferire il sangue in un tubo di 50 mL e aggiungere Calcein AM (1:10,000) alle cellule del sangue fluorescenti e Alexa488-fibrinogen (15 g/mL) per coniugare fibrinogeno autologo. Lasciare incubare il sangue a 37 gradi centigradi per 15 minuti per consentire un completo assorbimento.
3. Diluire il sangue 1:1 con tampone di ricalcolo (154 mM di cloruro di sodio, 10,8 mM di citrato trisodio, 2,5 mM di cloruro di calcio e cloruro di magnesio 2 mM) immediatamente prima dell'inizio dell'esperimento.
   NOTA: L'emodiluzione con un massimo del 50% non ha influenzato il tempo di reazione alla^{coagulazione 30}. Inoltre, il sangue umano può contenere virus e altri agenti. Lavorare con campioni di sangue, quindi, comporta un rischio di infezione. Si consiglia vivamente di utilizzare misure di sicurezza appropriate e di maneggiare il materiale con cura.

4. Assemblaggio del sistema di flusso

1. Prima di collegare il tubo, sciacquare i tubi di flusso con una siringa da 20 mL riempita con tampone di lavaggio (36 mM di acido citrico, cloruro di sodio da 103 mM, cloruro di potassio 5 mM, 5 mM EDTA e 0,35% di albume di siero wt/vole bovino [BSA], pH - 6,5) per evitare la coagulazione del sangue nei tubi.
2. Utilizzare una nuova siringa per riempire i tubi di flusso con buffer HEPES (132 mM cloruro di sodio, 20 mM HEPES, cloruro di potassio 6 mM, 1 mM cloruro di magnesio, 1% BSA, e 5,5 mM D-glucosio, pH - 7.4) e collegarlo con attenzione con un connettore Luer a forma di gomito al microsoce riempito con EC in media. Mentre si collegano i connettori ai microcarsi canali, cercare di impedire la formazione di eventuali bolle d'aria nel scivolo. Le bolle danneggeranno l'endotelio e influenzeranno i risultati dell'esperimento. Rimuovere completamente il buffer di lavaggio e non lasciare che il buffer entrare in contatto con le cellule, in quanto questo inibirà la coagulazione.
3. Impostare il sistema di flusso come illustrato nella Figura 1E. Prendere 2 mL di tampone di lavaggio in una siringa da 20 mL e risciacquare per evitare la coagulazione quando il sangue entra nella siringa. Inserire la siringa vuota nella pompa della siringa e collegare il tubo di uscita con un connettore Luer femmina a questa siringa. Mettere il tubo di ingresso in un contenitore contenente il sangue umano preparato.
4. Accendere la pompa della siringa e calcolare la velocità di flusso. I profili di flusso seguono un modello parabolico in altezza. Supponendo che il sangue agisca come un fluido newtoniano, utilizzare la seguente formula per calcolare la frequenza di flusso.
   (Equazione 1)
   Dove
   - sollecitazione di taglio
   η - viscosità dinamica
   Q - velocità di flusso volumetrica
   h - altezza del canale
   w - larghezza del canale
   NOTA: Per il flusso arteriosa polmonare con sangue nelle microscienze commerciali a 6 canali con dimensioni rettangolari con altezza 0,4 mm e larghezza 3,5 mm, è stata utilizzata una velocità di flusso volumetrica di 25 mL/h per 5 min. A causa delle differenze nelle dimensioni dei canali di flusso su cui sono stati fatti su modelli, anche queste dinamiche cambieranno. Regolare le variabili per assicurarsi che la sollecitazione di taglio sia uguale.
5. Definire il diametro della siringa da 20 mL a 19,05 mm e impostare il programma su Ritira. Tirare il sangue attraverso il canale rivestito di cellule mediante l'applicazione di una pressione negativa garantirà tassi di taglio costanti e danni minimi allo strato cellulare.

5. Impostazione del microscopio per l'acquisizione di immagini

1. Utilizzare un obiettivo 20x e posizionare la microsocea sullo stage del microscopio fluorescente a contrasto di fase invertita. Avviare il software al microscopio per spostare lo stage nella direzione z per concentrarsi sul monostrato cellulare.
2. Selezionare un'area di interesse (ROI) all'inizio, al centro e alla fine di ogni canale di flusso. L'inizio e la fine devono essere di almeno 3 mm di distanza dall'ingresso e dalla presa del canale. Impostare i filtri fluorescenti blu, verde e rosso con una potenza laser e un'intensità di luce che mostrano uno sfondo minimo.

6. Perfusione di sangue intero su PACIC

1. Dopo che tutto è collegato come in Figura 1E e il microscopio è pronto per la registrazione, spingere Start per registrare un video. Spingere Start sulla pompa della siringa per esaminare il sangue sull'endotelio.
2. Non appena il sangue inizia a scorrere sopra l'endotelio, acquisire immagini con i canali attivi preselezionati e posizioni ROI ogni 15 s per 5 min.
3. Dopo 5 minuti di perfusione, terminare la registrazione e arrestare la pompa di siringa. Smontare la camera di flusso e rimuovere con molta attenzione il tubo. Spesso, una bolla d'aria si formerà se questo viene fatto con troppa forza. Cercate di evitare questo, perché questo dorficheranno via l'endotelio.

7. Fissazione e post-analisi

NOTA: Per escludere l'adesione alla piastrine falsa positiva mediante danni endoteliali dovuti all'esperimento di perfusione, è necessario caratterizzare le cellule endoteliali per la loro formazione di gap e monostrato. Questo può essere fatto da colorazione immunofluorescenza regolare per VE-cadherin.

1. Dopo la perfusione e lo smontaggio del tubo, lavare il canale microfluidico con HEPES. Pipette HEPES nel canale in modo che spingerà il sangue alla presa. Rimuovere l'eccesso con un'altra pipetta.
   1. Se lo si desidera, lavare il canale con^PBS (con cloruro di magnesio da 0,5 mM e cloruro di calcio da 0,9 mM) per prevenire la precipitazione del supernante proteico. In questo modo si riduce lo sfondo. Tuttavia, un passaggio di lavaggio aggiuntivo può cambiare il comportamento cellulare e la morfologia che potrebbero influenzare l'imaging post-analisi.
2. Togliere l'HEPES e fissare l'endotelio con piastrine aderenti e la fibrina depositata mediante pipettamento 37 gradi centigradi riscaldata 4% paraformaldeide (PFA) nel canale e incubare per 15 minuti a RT.
   NOTA: Prestare particolare attenzione quando si fissano i microfluidica su cui sono fatti su modelli, poiché questi canali sono ancora più piccoli, il che causa forze di taglio più elevate nel canale durante ogni fase di movimentazione.
3. Rimuovere il PFA dal canale e lavare 3x con PBS. Le microsomee sono ora pronte per un protocollo di colorazione standard per caratterizzare marcatori cellulari endoteliali come VE-cadherin, CD31, P-selectin o integrins, CD42b per piastrine aderenti o CD45 per leucociti.
4. Dopo la colorazione, prendi almeno cinque immagini con un normale microscopio confocale per caratterizzare la colocalizzazione.

8. Analisi delle immagini

1. Aprire un'immagine di analisi del flusso contenente piastrine etichettate fluorescente o fibrina fluorescente in ImageJ. Trascinare l'immagine scelta su ImageJ.
2. L'immagine viene scattata in colore RGB. Per l'analisi, è preferibile un'immagine a 8 bit, quindi trasforma l'immagine in 8 bit: Immagine . Proprietà Type . 8 bit.
3. Per ridurre al minimo lo sfondo, sottrarre con un paraboloide scorrevole, in cui una palla di rotolamento calcola localmente e sottrae i pixel di sfondo dall'immagine originale: Processo . Sottrarre Sfondo Raggio della sfera rotante : 50 pixel Paraboloide scorrevole.
   NOTA: le dimensioni dell'immagine sono definite in pixel. Tuttavia, per misurare l'area, è necessario impostare la scala. Quando le immagini vengono scattate con un obiettivo 20x con un'apertura numerica di 0,45, il microscopio ha una scala di 2 pixel per m. La maggior parte del tempo le informazioni necessarie per impostare la scala vengono memorizzate nei metadati dell'immagine e possono essere utilizzate automaticamente da ImageJ: Analyze Imposta scala.
4. Impostare una soglia per definire piastrine aderenti o fibrina depositata. Utilizzare il metodo Triangolo e la soglia si adatterà automaticamente: Immagine Regolare la proprietà Soglia.
5. Analizzare l'area coperta dalle piastrine o dalla fibrina con il comando Analizza particelle. Impostare la dimensione a 2-Infinity, in quanto la dimensione minima di una piastrine è di 2 m: Analizza Analizza particelle.
6. I risultati forniranno l'area totale in m², con una dimensione media degli aggregati in m² e la percentuale di superficie coperta.

I risultati rappresentativi possono essere suddivisi in tre parti, ognuna delle quali rappresenta le rispettive fasi di configurazione sperimentale, raccolta dei dati e analisi dei dati. A seconda della domanda di ricerca, i parametri per ogni passo possono essere modificati. I dati presentati vengono applicati per studiare l'influenza dell'endotelio sulla formazione di trombi.

Configurazione sperimentale
È ben noto che le cellule endoteliali sono altamente eterogenee nella struttura e nella funzione, a seconda della posizione e del tempo, durante la salute e la malattia²³. Varie fonti di cellule endoteliali possono essere utilizzate per studiare l'interazione endoteliale-sangue, che in questo caso erano disponibili in mercato HUVEC e PAC (Figura 1A). Gli HUVEC sono stati i più comunemente utilizzati nei modelli di laboratorio, mentre i PAIC sono cellule isolate derivate dal paziente dalle arterie polmonari. Inoltre, esistono protocolli ben consolidati disponibili per isolare le cellule endoteliali microvascolari (MVEC) dalla circolazione polmonare o dalle cellule endoteliali che formano la colonia endoteliale circolante (ECFC)^25,28,29.

Dopo l'isolamento, le cellule endoteliali sono state caratterizzate da colorazione VE-cadherin, CD31 e TIE2 per confermare un fenotipo endoteliale. La caratterizzazione per la presenza di SMA e citokeratin indicava l'assenza di un fenotipo fibroblasta o epiteliale (Figura 1B). Dopo aver ottenuto una popolazione altamente pura di EC, le cellule di passaggio da 3 a 5 sono state utilizzate per seminare una microslide commerciale o canali di flusso microfluidico su su (Figura 1C). Mentre le microsocrapie disponibili in commercio sono principalmente camere di flusso parallele, o canali a forma di Y con parametri specificamente definiti in altezza o angolo di biforcazione, l'uso di vetrini microfluidico consente di adattare i parametri sperimentali alla geometria dei vasi in vivo e alla dinamica del flusso sanguigno³¹. Tuttavia, le dimensioni microfluidiche su base su impostazioni sono più piccole e tendono a limitare la diffusione delle cellule e a indurre più^{morte cellulare 32,33}. Utilizzando un surplus di cellule compensa il fatto che solo una piccola percentuale di cellule aderisce. Questo è stato osservato quando è stata introdotta una stenosi, dove le cellule endoteliali hanno mostrato un fenotipo più allungato rispetto a un canale microfluidico parallelo (Figura 1D). Le camere di flusso commerciali hanno una superficie più grande a cui le cellule possono legarsi. Ciò richiede un numero inferiore di numeri di cella per il seeding.

Per studiare l'interazione endoteliale tra cellule e sangue, il sangue intero è stato perfuso su un monostrato endoteliale. Il sangue citrato è stato raccolto il giorno dell'esperimento e immediatamente prima della perfusione ricalcolata. Le cellule sono state stimolate con istamina per indurre il rilascio di VWF e l'adesione alle piastrine 30 min prima della perfusione (Figura 1E)^34,35. A causa delle piccole dimensioni, i canali microfluidi su scala hanno permesso l'uso di volumi di sangue più piccoli.

Raccolta dati
Per studiare la formazione di trombo su PAECs, Calcein AM-Rosso fluorescentemente etichettato cellule del sangue e Alexa488-coniugato fibrin sono stati perfusi per 5 min a 2,5 dina/cm² (Figura 2A–C). Le cellule del sangue aderenti e la fibrina depositata sono state quantificate. Le immagini sono state acquisite ogni 30 s e quantificate con ImageJ. Era importante sottrarre lo sfondo per eliminare l'autofluorescenza delle piastrine non aderenti. L'algoritmo triangolare per la soglia è stato utilizzato per definire uno sfondo minimo. Ha consentito la misurazione di aggregati di piccole piastrine (Figura 2D).

Previsto, in condizioni non stimolate, non vi era alcun legame di piastrine e fibrina all'endotelio. Per promuovere il rilascio di VWF e l'associazione delle piastrine, i PAIC sono stati stimolati con l'istamina, che ha portato ad un aumento immediato dell'adesione delle piastrine raggiungendo un altopiano dopo 2,5 min. A quel tempo, le piastrine iniziarono a seciare i fattori autocrini che indusse l'aggregazione delle piastrine e la scissione del fibrinogeno in fibrina. Fibrin è stato depositato dopo 3 min e formato un aggregato stabile con piastrine dopo 4 min (Figura 2E).

Per indagare se questo effetto potrebbe essere inibito da un anticoagulante orale diretto (DOAC), il sangue è stato trattato con 10 nM dabigatran. Dabigatran è stato aggiunto alla diluizione del sangue, dove inibisce il fattore IIa nel percorso di coagulazione, e ha impedito alla scissione del fibrinogeno di formare fibre di fibrina. Quando il sangue trattato da dabigatran è stato perfuso su PAIC stimolato, la formazione di coaguli potrebbe essere direttamente inibita principalmente ritardando la deposizione di fibrina (Figura 2F).

Analisi dei dati
Per studiare l'influenza di varie fonti endoteliali sulla formazione di trombo, sono stati analizzati i cambiamenti cellulari su 5 min di perfusione di sangue. L'endotelio è stato fissato e le piastrine aderenti sono state etichettate con CD42b prima dell'imaging al microscopio confocale. Ciò ha fornito un'analisi dettagliata per la colocalizzazione di piastrine e fibrina che potrebbero indicare fattori di coagulazione disfunzionali nel sangue. L'influenza della CE nella formazione dei coaguli è stata determinata dalla colorazione immunofluorescente standard. I contatti endoteliali tra cellule cellulari sono stati mantenuti, come confermato dalla colorazione VE-cadherin, indicando che i coaguli di sangue si sono formati sopra il monostrato endoteliale piuttosto che sulla matrice sottostante tra le lacune endoteliali (Figura 3). Inoltre, l'uso di diverse fonti cellulari ha provocato diversi modelli di trombmbi che si formano sull'endotelio. Gli HUVEC sono cellule endoteliali venose e hanno mostrato una limitata adesione alle piastrine e deposizione di fibrina, mentre la PAEC primaria maestra da pazienti affetti da CTEPH ha mostrato un'abbondante adesione alle piastrine e una maggiore deposizione di fibrina sulla stimolazione dell'istamina rispetto alla PAEC sana. Ciò suggerisce che l'endotelio dei pazienti affetti da CTEPH mostra una maggiore reattività alla vasoattivazione che si traduce in una maggiore formazione di trombi.

Figura 1: panoramica schematica del protocollo. (A) Varie fonti e diversi tipi di cellule endoteliali sono stati isolati e ristrutturati per l'utilizzo in un canale di flusso microfluidico per esperimenti di perfusione. Immagini rappresentative di campi luminosi di diversi tipi di cellule endoteliali. La barra della scala - 50 m . (B) Le cellule isolate sono state caratterizzate da colorazione immunofluorescente per confermare un fenotipo endoteliale. Barra della scala - 50 m. (C) Le celle possono essere testate in diapositive di flusso commerciali o in un canale microfluidico su cui è possibile eseguire il seeding. (D) Rappresentante immagini di campo luminoso di HUVEC coltivate in diverse geometrie di canale. Barra della scala - 50 m. (E) Configurazione sperimentale degli esperimenti di perfusione di sangue. Il sangue citrato è stato raccolto, diluito con tampone salino, e perfuso su cellule endoteliali con una pompa di siringa. La vena polmonare e ombelicale in questa figura è stata modificata da Servier Medical Art, concessa in licenza con licenza generica Creative Common Attribution 3.0. http://smart.servier.com/ Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Acquisizione di immagini e quantificazione della formazione di trombi. (A) Immagine in time-lapse rappresentativa delle piastrine etichettate Calcein AM-Red aderenti e depositata fibrina coniugata alexa488 a 1, 3 e 5 minuti dopo la perfusione di sangue intero su PAIC non stimolati (B) e su PAIC stimolati dall'istamina. (C) Immagini in time-lapse rappresentative dell'adesione alle piastrine e della deposizione di fibrina a 1, 3 e 5 minuti di perfusione con sangue intero incubato con dabigatran perfuso su PAIC stimolati dall'istamina. Barra della scala : 50 m. (D) Panoramica schematica della quantificazione dell'immagine in ImageJ. (E) Quantificazione dell'adesione alle piastrine e deposizione di fibrina per ogni 30 s su un endotelio stimolato e istamina non stimolato. (F) Quantificazione dell'effetto del dabigatran sulla formazione di trombo quantificato dall'adesione alle piastrine e dalla deposizione di fibrina. I dati sono rappresentati come ± SD, n e 3. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagini confocali rappresentative di esperimenti di flusso per caratterizzare la formazione di trombo nell'adesione delle piastrine e nella deposizione di fibrina sulle cellule endoteliali. I contatti endoteliali tra cellule cellulari sono stati caratterizzati da VE-cadherin e misurati in PAIC di controllo, CTEPH PAIC derivati dal paziente e HUVEC. Barra della scala : 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La coagulazione è il risultato dell'interazione complessa e controllata tempormente tra l'endotelio e i componenti del sangue. Questo saggio in vitro presenta un metodo per studiare le proprietà trombogeniche delle cellule endoteliali in tempo reale. Possono essere utilizzati vari tipi di cellule endoteliali umane primarie, facilitando la trombosi in situ in un organo e in modo specifico del paziente. In questo studio, abbiamo illustrato l'uso di questo protocollo confrontando le proprietà trombogeniche dei PAIC isolati dai donatori sani rispetto ai pazienti CTEPH. La formazione di trombo vivo è stata studiata per la perfusione di sangue intero da soggetti sani rispetto all'endotelio attivato dall'istamina, mentre l'effetto di un DOAC è stato testato come agente antitrombotico.

Oltre all'uso di microcandoli disponibili in mercato, come mostrato nei risultati rappresentativi, l'introduzione dei canali microfluidici su base su base consente lo studio dell'influenza dei cambiamenti della geometria vascolare sulla formazione dei trombi. Ad esempio, la diminuzione del flusso in un punto di diramazione o stenosi comporta un aumento della sollecitazione di taglio e un aumento dell'attivazione delle^{piastrine 36}. Tuttavia, una limitazione significativa di questi canali microfluidici su cui su modelli è il requisito di numeri di cellule elevati per formare un monostrato stabile di EC, come descritto al punto 2.3.2. Ciò può presentare un fattore limitante quando le cellule derivate dal paziente sono scarse. I punti di forza delle microastrazioni disponibili in mercato sono che le superfici vengono modificate per la coltura cellulare e le aree di crescita sono più grandi, consentendo così agli EIc di formare un monostrato confluente e stabile. D'altra parte, una superficie più grande si tradurrà in un lume più grande. Secondo l'equazione 1, ciò richiede volumi di sangue più elevati per raggiungere flussi simili a quello della microfluidica su cui su base.

Un miglioramento di questo protocollo potrebbe essere quello di studiare la perdita di CE in tempo reale o i cambiamenti nell'integrità delle barriere. I danni comunitari nel presente protocollo sono misurati solo alla fine dell'esperimento. Per il monitoraggio in tempo reale, ECs può essere contrassegnato con mCherry VE-cadherin, ad esempio³⁷. Tuttavia, poiché ciò avrebbe bisogno di un protocollo altamente ottimizzato con una trasmissione di virus efficiente, l'ECIS (Electric Cell-substrate Impedance Sensing) potrebbe essere utilizzato come alternativa allo studio dell'integrità endoteliale e della funzione di^{barriera 38}. La perfusione su speciali canali di flusso ECIS consente il monitoraggio longitudinale dell'integrità delle barriere endoteliali in corso. Queste caratteristiche specifiche di ECIS consentono misurazioni parallele delle proprietà delle barriere endoteliali e della formazione di trombo. Le modalità alternative per le misurazioni parallele delle barriere CE, in particolare negli array su misura, includono l'uso di dextrans fluorescente nel profumo, che si diffondono dal lumen, a seconda delle proprietà della barriera COMUNITARIA.

Una limitazione del protocollo descritto è che gli EIc vengono rimossi dal corpo umano e colturati sulla plastica di coltura tissurica, che è un substrato rigido e artificiale. Le cellule si adattano al loro ambiente biofisico. Ciò potrebbe influire sulla risposta endoteliale all'attivazione delle piastrine, in quanto esiste un'associazione tra l'attivazione delle piastrine e la rigidità^{della parete 39}. Nonostante questi adattamenti alla plastica di coltura, le cellule mantengono caratteristiche specifiche della malattia che possono essere identificate in confronto diretto con gli EC derivati da donatori sani come mostrato con il controllo, CTEPH-PAEC e HUVEC che hanno esercitato diversi modelli di adesione alle piastrine e deposizione di fibrina dopo 5 minuti di perfusione di sangue.

A differenza di altri protocolli, questo sistema utilizza sangue intero, mentre altri studiano l'interazione CE con un singolo componente del sangue come piastrine e leucociti^19,20,21. Sono stati sviluppati modelli microfluidici più avanzati che consentono lo studio della funzione endoteliale in un modello vascolare con una geometria rotonda del vaso e una matrice extracellulare morbida. Tuttavia, questi sono ottimizzati con HUVECs^40,41,42. La novità del protocollo descritto è l'uso di EC primari combinati con sangue intero portando la modellazione della trombosi in situ un passo più vicino alle condizioni in vivo. L'ottimizzazione del protocollo per l'uso di EC derivati dal paziente e sangue derivato dal paziente ottimizza ulteriormente la modellazione della malattia in vitro,consentendo la valutazione della formazione personalizzata di trombo e del trattamento farmacologico.

Il protocollo descritto può essere applicato per studiare l'effetto delle terapie anticoagulanti sulle cellule derivate dal paziente. Mentre abbiamo usato il dabigatran per inibire la formazione di trombi, è possibile utilizzare altri anticoagulanti, come rivaroxaban, che inibisce direttamente il fattore Xa nella cascata di coagulazione. Inibitori a piastrine dirette come clopidogrel o aspirina possono essere studiati, in quanto agiscono sulla fase primaria dell'emostasi in cui le piastrine si legano agli EC. In definitiva, le capacità trombogeniche dei VC specifici del paziente in interazione con il sangue del paziente possono essere utilizzate per prevedere l'effetto personale della terapia anticoagulante sul singolo paziente. Inoltre, un knockdown di proteine specifiche può fornire ulteriori informazioni funzionali.

Ci sono alcuni passaggi nel protocollo descritto che sono fondamentali per un esperimento di perfusione di successo. In primo luogo, durante l'isolamento delle cellule primarie, è necessario ottenere una coltura CE altamente pura. In secondo luogo, è importante che gli EIc formino un monostrato confluente stabile. Se questo non è il caso, un leggero cambiamento nella sollecitazione di taglio può causare danni endoteliali e l'attivazione della cascata di coagulazione, o piastrine possono iniziare a legarsi alla membrana seminterrato, che fornirà risultati falsi positivi. In terzo luogo, è essenziale prevenire le bolle d'aria, in quanto possono danneggiare l'endotelio e quindi influenzare i risultati.

Dopo il ricalcolo del sangue citrato con cloruro di calcio e cloruro di magnesio, è importante avviare immediatamente l'esperimento di perfusione. Il ricalcolo induce una risposta rapida nell'attivazione delle piastrine e nella formazione di trombi, con conseguente coagulazione rapida nel campione.

In conclusione, descriviamo un protocollo altamente versatile per studiare intere interazioni tra cellule endoteliali del sangue durante la trombosi.

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamo Jan Voorberg del Dipartimento di Proteine plasmatiche, Sanquin Research e Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academic Medical Center, Amsterdam, Paesi Bassi, per il suo contributo in questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Dutch CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-11] assegnata al Phaedra e al consorzio Reconnect, nonché dalla sovvenzione Impulse 2018 assegnata al consorzio Phaedra IMPACT. Queste sovvenzioni includono finanziamenti collettivi da parte della Dutch Heart Foundation, della Federazione olandese dei centri medici universitari, dell'Organizzazione olandese per la ricerca e lo sviluppo della salute e della Royal Netherlands Academy of Sciences. Inoltre, questo lavoro è stato finanziato dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito del programma Advanced Grant "VESCEL" (numero di sovvenzione: 669768). XDM è finanziato da una sovvenzione di ricerca dell'Institute for CardioVascular Research (ICaR-VU) presso il VU University Medical Center di Amsterdam, Paesi Bassi.