В пробирке микрофлюидных заболеваний Модель для изучения всей крови эндотелиальных взаимодействий и динамики сгустков крови в режиме реального времени

Мы представляем модель сосудистых заболеваний in vitro для исследования взаимодействия всей крови с эндотелием, полученным пациентом. Эта система позволяет изучать тромбогенные свойства первичных эндотелиальных клеток при различных обстоятельствах. Метод особенно подходит для оценки тромбогенности и антикоагуляционной терапии на различных стадиях коагуляции.

Формирование тромбов включает в себя сложные взаимодействия между эндотелиальными клетками, их основной матрицей, различными клетками крови и белками. Эндотелий является основным источником многих основных гемостатических молекул, которые контролируют агрегацию тромбоцитов, коагуляцию и фибринолиз. Хотя механизм тромбоза был исследован в течение десятилетий, в пробирке исследования в основном сосредоточены на ситуациях повреждения сосудов, где субендотелиальной матрицы подвергается воздействию, или на взаимодействия между клетками с одиночными компонентами крови. Наш метод позволяет изучать взаимодействия между целой кровью и нетронутой, сливаемой сосудистой клеточной сетью.

Используя первичные эндотелиальные клетки человека, этот протокол предоставляет уникальную возможность изучить влияние эндотелиальных клеток на динамику тромбов и дает ценную информацию о патофизиологии тромботических заболеваний. Использование заказных каналов микрофлюидного потока позволяет использовать специфические для заболеваний сосудистые геометрии и моделировать специфические морфологические сосудистые изменения. Развитие тромба регистрируется в режиме реального времени и количественно характеризуется адгезией тромбоцитов и осаждением фибрина. Влияние эндотелиальной функции в измененной динамике тромба определяется потанализом через иммунофлуоресценцию окрашивания конкретных молекул.

Репрезентативные результаты описывают экспериментальную установку, сбор данных и анализ данных. В зависимости от исследовательского вопроса, параметры для каждого раздела могут быть скорректированы, включая тип клетки, скорость снора, геометрию канала, медикаментозную терапию и процедуры постанализа. Протокол подтверждается количественной оценкой образования тромба на эндотелии легочной артерии пациентов с хроническим тромбоэмболическим заболеванием.

Эндотелий образует внутренний клеточный слой кровеносных сосудов и отделяет кровь от окружающих тканей. Он был описан как динамический орган, который активно регулирует свою микро-среду и реагирует на внешние раздражители¹. Из-за прямого контакта с проточной кровью, эндотелий имеет решающее значение в борьбе с гемостазом и тромбозом и является основным источником многих основных регуляторных молекул, которые контролируют агрегацию тромбоцитов, коагуляцию и фибринолиз². Здоровые, неактивированные эндотелиальные клетки (EC) производят несколько молекул, которые противодействуют активации тромбоцитов и предотвращают образование коагуляции и тромбов для поддержания кровотока, таких как простациклин, тромбомодулин или ингибитор фактора ткани (TFPI)^2,3. Это предотвращает адгезию тромбоцитов, агрегацию тромбоцитов и образование тромбоцитов. Травма или активация стенки сосуда приводит к прокоагулянт эндотелиального фенотипа, который инициирует локализованную адгезию тромбоцитов^{и образование сгустка 2,,4}. При эндотелиальной активации тромбоциты придерживаются фактора фон Виллебранда (VWF), мультимерного белка, высвобождаемого из ЭК, или подвергаются воздействию связывающих участков лежащей в основе субендотелиальной матрицы. Впоследствии молекулярные изменения тромбоцитов и воздействие фактора ткани (TF) инициируют активацию системы коагуляции, которая вызывает образование тромбов путем^{полимеризации фибрина 5,,6.} Вместе полученный сгусток обеспечивает основу для замыкания ран путем повторной эндотелиализации^7. Возмущения системы коагуляции могут привести к нарушениям кровотечения, таким как болезнь фон Виллебранда, гемофилия или тромбоз, которые часто являются результатом дисрегулируемого про- и антитромботического баланса эндотелиального гемостаного^{пути 2,3}.

Процесс гемостаз происходит как в артериальной, так и венозной циркуляции. Однако механизмы, лежащие в основе артериального и венозного тромбоза, принципиально отличаются. В то время как артериальный тромбоз, как видно из ишемической болезни сердца, в основном обусловлен разрывом атеросклеротической бляшки в условиях высокого стресса стрижки, венозный тромбоз в основном развивается при отсутствии эндотелиальной травмы в^{состоянии застоя 8,9,10}. Тромб глубоких вен может эмболизироваться и путешествовать к легочным артериям, где он вызывает легочную эмболию. Это может привести к хроническим сосудистым обструкциям, что приведет к значительному нарушению функциональных возможностей, которые могут способствовать развитию хронических заболеваний легких, включая развитие хронической тромбоэмболической легочной гипертензии (КТЭФ)^{11,,12,,13,,14.} CTEPH характеризуется повышенным давлением легких из-за препятствий легочных артерий тромбоэмболическим материалом после по крайней мере трех месяцев антикоагуляционной^{терапии 15}. В дополнение к эмболии легких, постулируется, что легочный эндотелий обеспечивает протромботической среде в CTEPH, что облегчает тромбоз на месте и хронические препятствия легочных артерий, вызывая увеличение артериального давления, что в конечном итоге может привести к сердечной недостаточности,^{если не лечить 16,17}.

За последние годы, различные исследования привели к развитию анализов для изучения формирования тромбоцитов путем измерения функции тромбоцитов и свертывания¹⁸. Тем не менее, большинство из них либо изучить взаимодействие всей крови с одним внеклеточных компонентов матрицы, как коллагены или фибрины, или эндотелиальной функции во взаимодействии с одиночными компонентами крови, таких как эндотелиально-тромбоцитов или эндотелиально-лейкоцитов^{взаимодействия 19,20,21,22}. Эти анализы чаще всего выполняются с пуповинной вены эндотелиальных клеток (HUVEC), так как эти клетки легко получить. Тем не менее, гемостатические гены дифференциально выражены через сосудистое дерево,^{типы сосудов}и систем органов 23^,24, что делает использование HUVECs представлять эндотелиальные клетки, участвующие в артериальном тромбозе или легочной эмболии^{проблематично 23}.

В дополнение к пластичность ЕС, болезнеспецифические гемодинамические изменения и изменения в сосудистой морфологии могут способствовать образованию тромба при нормальном^{эндотелии 25}. Более высокие показатели стрижки, из-за местной сосудосуживающих или изменения геометрии сосудов, например, может привести к острой тромбообразования, вызывая стеноз, который ускоряет прекращение^{кровотока 26}. Использование специально изготовленных каналов микроинженерных потоков позволяет специально проектировать сосудистые геометрии, которые являются репрезентативными для (пато)биологии. Таким образом, можно изучить влияние местных биомеханических сил на здоровую или больной ЭК^27.

Существуют антикоагуляционные методы лечения, доступные для ориентации различных фаз и молекул в каскаде коагуляции, которые представляют особые риски и преимущества, которые могут быть специфичны для определенных расстройств. Подход к моделированию заболеваний, описанный в настоящем документе, особенно подходит для проверки влияния различных антикоагуляционных и антитромбоцитатурных методов лечения на динамику тромбов.

Цель состоит в том, чтобы представить модель тромбоза, которая включает в себя первичные ЭК, что дает универсальную модель, подходящую для анализа различных форм тромбоза в зависимости от типа используемых первичных ЭК. В качестве иллюстрации мы использовали эндотелиальные клетки легочной артерии пациентов CTEPH во взаимодействии с всей человеческой кровью, содержащей все компоненты, участвующие в формировании тромбоцитов (тромбоциты, лейкоциты, эритроциты, свертываемые белки и кофакторы). Этот подход может применяться в коммерческих параллельных каналах потока или в специально изготовленных каналах микрофлюидных потоков с определенной сосудистой конструкцией. Таким образом, модель может в конечном итоге быть использована в изучении формирования тромба и разрешения, для оценки воспалительных реакций в моделировании заболеваний, для антитромбоцита или антикоагуляционной терапии, и в конечном счете для персонализированной медицины.

Это исследование описывает изоляцию первичных эндотелиальных клеток легочной артерии человека. Для изоляции других первичных типов эндотелиальных клеток человека, мы ссылаемся на ранее опубликованные методы, в том числе легочных микрососудистых^{эндотелиальных клеток 25}, человека пупочной вены^{эндотелиальных клеток 28}, и кровь циркулирующих эндотелиальной колонии формирования клеток Рисунок 1A²⁹.

Это исследование было одобрено институциональным медицинским этическим советом медицинского обзора Медицинского центра VU Амстердам, Нидерланды (METC VUmc, NL69167.029.19). Изоляция первичных клеток и сбор крови людей были проведены после получения письменного информированного согласия в соответствии с Хельсинкской декларацией.

1. Изоляция и культура первичных легочных артериальных эндотелиальных клеток человека (PAEC)

1. Теплая полная эндотелиальная клеточная среда (cECM) дополнена 5% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 1% пенициллина/стрептомицина (P/S), 1% эндотелиальных добавок роста клеток (ECGS) и 1% несущественных аминокислот (NEAA), в водяной бане при 37 градусах Цельсия. Стерилизовать хирургические ножницы, типсы и скальпель либо с 120 градусов тепла стерилизатор или 70% этанола. Выполните изоляцию PAEC в шкафу ламинарного потока в стерильных условиях.
2. Пальто высокой сродства ячейки связывания 60 мм клеточной культуры блюдо (см. Таблица материалов )с 2 мл 5 мкг / мл фибронектина и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, по крайней мере 15 мин.
3. Получить легочной артерии (PA) тканиотхирургии (например, лобэктомии или легочной эндартерэктомии), хранить в 4 градусов по Цельсию холодного шнура буфера (4 мМ хлорида калия, 140 мМ хлорида натрия, 10 мМ HEPES, 11 мМ D-глюкозы, и 1% P / S, pH No 7,3), и держать на льду.
4. Изолировать эндотелиальные клетки от ПА в течение 2 ч после удаления тканей. Возьмите PA с типсами и положить его в 10 см Петри блюдо для мытья с PBS. Если ПА по-прежнему кольцо, вырезать легочной артерии открытыми ножницами. Будьте очень осторожны, чтобы не коснуться внутреннего слоя сосуда с инструментами, как эндотелий легко повреждены и / или удалены.
5. Удалите фибронектин из блюда клеточной культуры и добавьте 4 мл среды cECM.
6. Возьмите ткани ПА с типсами и поместите его в среду. Между тем, осторожно соскребать внутренний слой сосуда в среду скальпелем. Часто, скопления липидов можно увидеть в стенке сосуда. Попробуйте опустить их, так как они будут влиять на прорастание клеток.
7. Держите клетки в культуре до тех пор, пока не начнут появляться небольшие колонии эндотелиальных клеток.
8. Замените носитель через день. Если фибробласты загрязняют культуру, очистите ее магнитным сродством клеточного разделения для CD144 с комплектом, в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Используйте метод двух столбца для первоначальной очистки и метод одно столбца для каждой последовательной очистки. Как правило, культура определяется чистой, когда поток цитометрии обнаруживает ≤10% загрязняющих клеток.
9. Разделение ячеек в соотношении 1:3 к 1:4 до тех пор, пока достаточное количество PAECs не будет выращено для экспериментального использования. Когда PAECs будут готовы к использованию, продолжайте следующий шаг.
10. После очищения первичные эндотелиальные клетки необходимо охарактеризовать наличиемe.g.специфических маркеров ЭК (например, VE-кадерин, CD31, TIE2) и отсутствием гладких мышечных клеток (α-SMA), фибробластов (виментин) и эпителиальных (цитокератиновых) маркеров(рисунок 1B).

2. Подготовка потокообразующихся камер и монослой PAEC

ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от гипотезы используйте либо коммерчески доступные камеры потока (см. таблицу материалов и рисунок 1C Option A,шаг 2.1 протокола), либо специально изготовленную камеру микрофлюидного потока(рисунок 1C Option B, шаг 2.2 протокола).

1. Сотовый посев эндотелиальных монослой в коммерчески доступных микросхиды
   ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступные камеры потока просты в использовании и обеспечивают ламинарный поток по всему каналу, который может быть использован с высокой скоростью стрижки. Эти микрослиды предназначены для обеспечения многоканального параллельного прогона и обеспечения точного и воспроизводимого профиля потока. Поскольку они оптимизированы для перевернутой микроскопии, можно захватить высококачественные флуоресцентные изображения. Кроме того, различные размеры камер потока доступны в различных размерах каналов или геометрии. Каналы потока 6-хорошо предпочтительны для этого анализа, потому что эти микросциды имеют небольшие размеры и позволяют многопаральные трассы.
   1. Для покрытия одного канала 6-ну скольжения потока (3,5 мм шириной х 0,4 мм высотой х 17 мм длиной) используйте 30 МКЛ 0,1% желатина на канал и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, по крайней мере 15 мин.
   2. Чтобы посеять один канал, трипсинизировать 10^{см 2} стеченных PAECs и спина вниз на 300 х г в течение 7 мин при комнатной температуре (RT).
   3. Приостановить PAECs в 600 МКЛ cECM и пипетки 100 йл (1,5 см 2 )^{клеточной} подвески в одном канале. Это покрывает микрослейд через капиллярные действия. Если он идет слишком медленно, воздушные пузыри будут образовываться. Избегайте образования пузырьков воздуха, используя немного больше силы при трубе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность клеток влияет на эндотелиальный фенотип. В общей сложности 1,5^{см 2} стеченных клеток на канал является сверхтеканием, потому что канал имеет площадь поверхности 0,6^{см 2}. Перед началом эксперимента, культура этих клеток в течение еще 6 дней в пределах каналов, пока они не достигнут максимального слияния.
   4. Добавьте к каналу еще 50 МКЛ cECM, чтобы обеспечить достаточную среду для ночной инкубации при 37 градусах Цельсия, 5% CO_2. Изменение среды на следующий день, чтобы смыть несвехие клетки.
   5. Держите клетки в культуре в течение 6 дней при 37 градусов по Цельсию, 5% CO_2, чтобы позволить PAEC сформировать твердый, слияние монослой. Изменение среды через день с 150 йл cECM.
   6. На 7-й день, лечить PAEC с 100 МКЛ 1 МК гистамина в ECM и 1% FBS без каких-либо других добавок в течение 30 мин до анализа. Стимулом можно выбрать ad libitum. Например, TNF-α обычно используется в качестве воспалительного активатора.
2. Подготовка изготовленных на заказ микрофлюидных камер потока
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пользовательские камеры потока адаптированы к потребностям пользователя, потому что размеры и геометрия могут быть легко изменены на предпочтения. Например, для имитации более физиологически релевантного сосуда может быть введен стеноз(рисунок 1D). Такой подход позволяет использовать очень небольшие объемы крови, как это видно при микрососудистых заболеваниях.
   1. Мягкая литография полидиметилсилоксана (PDMS) с использованием узорчатых пластин
      1. Комбинат PDMS лечения агента и преполимер на микробалансе в соотношении 1:10 и тщательно перемешать с общим назначением лабораторного смесителя.
      2. Чтобы удалить полученные пузырьки воздуха, дегазации PDMS в desiccator примерно 1 ч.
      3. Линия стеклянной чашки Петри с алюминиевой фольгой и добавить несколько капель воды, прежде чем поместить в выстроились Петри блюдо. Вафля служит формой для изготовленного на заказ канала.
         ПРИМЕЧАНИЕ: или формы предоставляются чистой комнате объектов. Отрицательный фоторезистер узорчатый на для создания выступающих каналов, как функции со следующими типичными размерами: 300 мкм шириной х 270 мкм высотой х 14 мм длиной.
      4. Налейте дегазированную PDMS на пластину, помещенную в стеклянную чашку Петри.
      5. Дега PDMS вылил на пластину в desiccator еще 15 минут, чтобы удалить любые пузырьки, которые могли бы образовывались во время литья.
      6. Удалите чашку Петри, содержащую плесень и PDMS из desiccator и поместите его в духовку 60 градусов по Цельсию в течение как минимум 4 ч, чтобы перевязать PDMS.
   2. Подготовка кросс-связанных PDMS для связи со стеклянными слайдами
      1. Удалите плесень и перекрестные PDMS из духовки и перейти к перекрестному потоку капот для пыли свободной обработки PDMS.
      2. Удалите любые PDMS из нижней части формы с помощью скальпеля и удалить верхнюю плиту перекрестного PDMS из формы.
      3. Линия подвергаются узорчатые плиты PDMS с клейкой лентой, чтобы предотвратить любые частицы пыли, чтобы войти в контакт с каналами PDMS.
      4. Вырезать PDMS чипов до размера и удар 1 мм диаметром входов и точек с помощью биопсии удар.
   3. Стерилизация и склеивание микрофлюидных каналов PDMS и стеклянных слайдов
      1. Чистая стеклянная микроскопия слайды путем тщательного полоскания этанолом следуют изопропил спирта промыть. После каждого полоскания тщательно высушите горки азотной пушкой.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, крышки скользит могут быть использованы, если анализ проводится с помощью конфокального микроскопа.
      2. Откройте плазменную камеру и загрузите очищенные микроскопические слайды и микрофлюидные чипы без защитной ленты.
      3. Закройте камеру, очистив азотом в течение 1 мин, и заполните камеру фильтрованным воздухом до тех пор, пока давление 500 mTorr не будет достигнуто.
      4. Выставить стеклянные слайды и чипы PDMS в плазму для 40 с с использованием мощности 50 Вт и частоты 5 кГц.
      5. После воздействия плазмы, немедленно связать стеклянные слайды и микрофлюидные чипы. Храните устройства в стерильных чашках Петри.
3. Сотовый посев эндотелиальных монослой в микрофлюидных каналах
   1. Пальто на заказ микроканал путем пипетки 10 йл 0,1 мг / мл коллагена типа I или 0,1% желатина на канал и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
   2. Чтобы посеять четыре микроканали, трипсинизировать 25^{см 2} из стеченных PAECs и спина вниз на 300 х г в течение 7 мин на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лишь небольшой процент ячеек будет прилипать к поверхности. Поэтому для достижения стечения монослоя необходимо использовать избыток клеток.
   3. Приостановить PAECs в 20 МКЛ cECM и использовать 5 МКЛ клеточной подвески для каждого канала. Из-за небольших размеров канала, капиллярные силы заполнят микросделку и предотвращают образование пузырьков воздуха.
   4. Изменение среды после 3-4 ч для мытья неограниченных клеток.
   5. Держите клетки в культуре в течение 6 дней, чтобы позволить PAEC сформировать фирму, слияние монослой. Из-за небольшого объема, изменить средний каждый день с 150 йл cECM. Оставьте наконечник пипетки заполнены среды в входе и положить пустой кончик в розетке. Это будет служить в качестве резервуара, обеспечивая достаточно питательных веществ и факторов роста клеток и предотвратить слайд от высыхания.
   6. На 7-й день, пятно ядер в живых клетках с Hoechst (1:5,000 в cECM) и инкубировать в течение максимум 10 мин при 37 градусов по Цельсию и 5% CO₂.
   7. Тщательно мыть 3x с cECM и лечить с 1 мкм гистамина в ECM 1% FBS в течение 30 минут до анализа. Стимулом можно выбрать ad libitum. Например, TNF-α обычно используется в качестве воспалительного активатора.
   8. Используйте 1,27 мм диаметром 90 "угловой разъемы из нержавеющей стали для подключения розетки чипов PDMS к трубам.

3. Подготовка всей крови человека

1. Нарисуйте венозную кровь из испытуемых в 0.109 M антикоагулянт цитрата натрия. Это может быть от здоровых или больных субъектов, которые не получают антикоагуляции лечения. Аккуратно инвертировать трубки для смешивания. Общее количество крови, необходимое для эксперимента, в основном зависит от выбранной скорости потока. При скорости потока 25 мл/ч, в ibidi 6-хорошо слайды, общий объем 2 мл с небольшим избытком, чтобы заполнить ванны и канал потока достаточно.
2. Передача крови в 50 мл трубки и добавить Calcein AM (1:10,000) флуоресцентно этикетки клеток крови и Alexa488-фибриноген (15 мкг / мл) для конъюгировать аутологичный фибриноген. Пусть кровь инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное поглощение.
3. Разбавить кровь 1:1 буфером перекалибровки (154 мЧ хлорида натрия, 10,8 мМ тристрия, хлорида кальция 2,5 мМ и хлорида магния 2 мМ) непосредственно перед началом эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гемодилюция с максимум 50% не повлияла на время реакции коагуляции³⁰. Кроме того, человеческая кровь может содержать вирусы и другие агенты. Поэтому работа с образцами крови сопряжена с риском заражения. Настоятельно рекомендуется использовать надлежащие меры безопасности и обращаться с материалом с осторожностью.

4. Сборка системы потока

1. Перед подключением трубки, промыть трубки потока с 20 мл шприц заполнены мыть буфера (36 мМ лимонной кислоты, 103 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида калия, 5 мМ EDTA, и 0,35% wt/vol бычьего альбумин сыворотки (BSA), pH 6,5) для предотвращения свертывания крови в трубках.
2. Используйте новый шприц для заполнения трубок потока буфером HEPES (132 мМ хлорида натрия, 20 мМ HEPES, 6 мМ хлорида калия, 1 мм хлорида магния, 1% BSA и 5,5 мМ D-глюкозы, рН 7,4) и тщательно соединить его с локтеобразным разъемом Luer к микрослиду, заполненному ЕС в среде. Прикрепляя разъемы к микроканалу, постарайтесь предотвратить образование пузырьков воздуха на слайде. Пузыри повесят эндотелий и повлияют на результаты эксперимента. Удалите буфер мытья полностью и не позволяйте буферу в контакте с клетками, так как это будет препятствовать свертыванию.
3. Настройка системы потока, как показано на рисунке 1E. Возьмите 2 мл буфера мытья в 20 мл шприца и промыть, чтобы предотвратить свертывание крови, когда кровь попадает в шприц. Вставьте пустой шприц в шприц-насос и соедините розетку с женским разъемом Luer к этому шприцу. Поместите входную трубку в контейнер, содержащий подготовленную человеческую кровь.
4. Включите шприц-насос и рассчитайте скорость потока. Профили потока следуют параболическим узором по высоте. Предполагая, что кровь действует как ньютоновская жидкость, используйте следующую формулу для расчета скорости потока.
   (Уравнение 1)
   Где
   - стресс от стрижки
   η и динамическая вязкость
   - скорость объема потока
   h - высота канала
   w - ширина канала
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для легочного артериального потока с кровью в коммерческих микросхемах 6 каналов с прямоугольными размерами высотой 0,4 мм и шириной 3,5 мм объем потока 25 мл/ч использовался в течение 5 мин. Из-за различий в размерах заказных каналов потока, эта динамика также изменится. Отрегулируйте переменные, чтобы убедиться, что стресс стрижки равен.
5. Определите диаметр шприца 20 мл до 19,05 мм и установите программу снятия. Тяговая кровь через канал с покрытием клеток путем применения отрицательного давления будет гарантировать постоянную скорость стрижки и минимальный ущерб клеточному слою.

5. Настройка микроскопа для получения изображений

1. Используйте цель 20x и поместите микрослид на стадию перевернутого фазового контрастного флуоресцентного микроскопа. Запустите программное обеспечение микроскопа, чтобы переместить сцену в направлении Q, чтобы сосредоточиться на монослой клетке.
2. Выберите область интереса (ROI) в начале, середине и конце каждого канала потока. Начало и конец должны быть не менее 3 мм от входной и розетки канала. Установите синие, зеленые и красные флуоресцентные фильтры с лазерной мощностью и интенсивностью света, которая показывает минимальный фон.

6. Перфузия всей крови над PAECs

1. После того, как все связано, как на рисунке 1E и микроскоп готов к записи, нажмите Начало записи видео. Нажмите Начните на шприц насос для окаймливания крови над эндотелием.
2. Как только кровь начинает течь над эндотелием, приобретайте изображения с заранее выбранными активными каналами и позициями рентабельности инвестиций каждые 15 с в течение 5 минут.
3. После 5 минут перфузии, закончить запись и остановить шприц насоса. Разобрать камеру потока и очень тщательно удалить трубки. Часто, пузырь воздуха сформирует если это сделано с too much силой. Постарайтесь предотвратить это, потому что это смоет эндотелий.

7. Фиксация и пост-анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы исключить ложноположительную адгезию тромбоцитов путем эндотелиального повреждения в результате эксперимента перфузии, необходимо охарактеризовать эндотелиальные клетки для их образования разрыва и монослой. Это может быть сделано путем регулярного окрашивания иммунофлюоресценции для VE-кадерин.

1. После перфузии и разборки труб, промыть микрофлюидный канал с HEPES. Pipette HEPES в канал так, что он будет толкать кровь к розетке. Удалите излишки с другой пипетки.
   1. Дополнительно промыть канал с^{помощью} PBS (с хлоридом магния 0,5 мМ и хлоридом кальция 0,9 мМ) для предотвращения осадков белкового супернатанта. Это уменьшает фон. Тем не менее, дополнительный шаг мытья может изменить клеточное поведение и морфологию, которые могут повлиять на пост-анализ изображений.
2. Удалите HEPES и исправить эндотелий с прилипшими тромбоцитами и хранение фибрина путем пипетки 37 градусов по Цельсию нагревается 4% параформальдегид (PFA) в канал и инкубировать в течение 15 минут на RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте особенно осторожны при фиксации заказной микрофлюиды, поскольку эти каналы еще меньше, что вызывает более высокие силы стрижки в канале во время каждого шага обработки.
3. Удалите PFA из канала и мыть 3x с PBS. Микрослиды теперь готовы к стандартному протоколу окрашивания для характеристики эндотелиальных клеточных маркеров, таких как VE-кадерин, CD31, P-селетин или интегрны, CD42b для адептов тромбоцитов, или CD45 для лейкоцитов.
4. После окрашивания, принять по крайней мере пять изображений с регулярным конфокальный микроскоп, чтобы охарактеризовать колокализации.

8. Анализ изображений

1. Откройте изображение анализа потока, содержащее либо флуоресцентно помеченные тромбоциты, либо флуоресцентный фибрин в ImageJ. Перетащите изображение выбора в ImageJ.
2. Изображение взято в цвете RGB. Для анализа предпочтительнее 8-битное изображение, поэтому превратите изображение в 8-битное: Изображение Тип (тип) 8-битный.
3. Чтобы свести к минимуму фон, вычесть с раздвижным параболоидом, где подвижного шара локально вычисляет и вычитает фоновые пиксели из исходного изображения: Процесс Вычитание Фон Радиус подвижного шара - 50 пикселей Раздвижные параболоиды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер изображения определяется в пикселях. Однако для измерения площади необходимо установить шкалу. Когда изображения сделаны с целью 20x с численным отверстием 0.45, микроскоп имеет маштаб 2 пикселей в мкм. Большую часть времени необходимая информация для настройки шкалы хранится в метаданных изображения и может автоматически использоваться ImageJ: Analyze Установить шкалу.
4. Установите порог для определения прилипающихся тромбоцитов или отложенного фибрина. Используйте метод Треугольника, и порог будет автоматически корректироваться: Изображение Отрегулируйте Порог.
5. Проанализируйте область, покрытую тромбоцитами или фибрином, с помощью команды Analyze Particles. Размер набора на 2-Infinity, так как минимальный размер тромбоцита составляет 2 мкм: Анализ Анализ частиц.
6. Результаты обеспечат общую площадь в^{мкм 2}, со средним размером агрегатов в^{мкм 2} и процентной доли охваченной области.

Репрезентативные результаты можно разделить на три части, каждая из которых представляет соответствующие этапы экспериментальной настройки, сбора данных и анализа данных. В зависимости от исследовательского вопроса параметры каждого шага могут быть изменены. Представленные данные применяются для изучения влияния эндотелия на образование тромбов.

Экспериментальная настройка
Хорошо известно, что эндотелиальные клетки очень неоднородны по структуре и функции, в зависимости от местоположения и времени, во время здоровья и^{болезни 23}. Различные источники эндотелиальных клеток могут быть использованы для изучения эндотелиально-кровяного взаимодействия, которые в данном случае были коммерчески доступны HUVECs и PAECs(рисунок 1A). HUVECs были наиболее часто используемых в лабораторных моделях, в то время как PAECs являются пациентом полученных изолированных клеток из легочных артерий. Кроме того, существуют устоявшиеся протоколы, доступные для изоляции микрососудистых эндотелиальных клеток (MVEC) из легочной циркуляции или кровообращения эндотелиальной колонии, образующей клетки (ECFC)^25,28,29.

После изоляции эндотелиальные клетки характеризовались VE-кадерином, CD31 и окрашиванием TIE2 для подтверждения эндотелиального фенотипа. Характеристика наличия ЗСМА и цитокератина указывает на отсутствие фибробласта или эпителиального фенотипа(рисунок 1B). После получения очень чистой популяции ЭК, прохождение 3-5 клеток были использованы для семян либо коммерческих микросхем или заказных каналов микрофлюидного потока(рисунок 1C). В то время как коммерчески доступные микросвидые в основном параллельные камеры потока, или Y-образные каналы с специально определенными параметрами в высоту или угол бифуркации, использование микрофлюидных слайдов позволяет адаптировать экспериментальные параметры к геометрии виво сосуда и динамике^{кровотока 31}. Тем не менее, на заказ микрофлюидных размеров меньше и, как правило, ограничивают распространение клеток и вызвать больше^{смерти клеток 32,33}. Использование избытка клеток компенсирует тот факт, что лишь небольшой процент клеток будет придерживаться. Это наблюдалось, когда стеноз был введен, где эндотелиальные клетки показали более удлиненный фенотип по сравнению с параллельным микрофлюидным каналом(рисунок 1D). Коммерческие камеры потока имеют большую площадь поверхности, что клетки могут связываться с. Это требует меньшего количества клеток для посева.

Для изучения эндотелиального взаимодействия клеток и крови, целая кровь была пронизана эндотелиальной монослой. Цитированная кровь была собрана в день эксперимента и непосредственно перед перекалибровыванием перфузии. Клетки стимулировались гистамином, чтобы вызвать высвобождение VWF и адгезию тромбоцитов за 30 минут до перфузии(рисунок 1E)^34,35. Из-за небольших размеров, изготовленные на заказ микрофлюидные каналы позволяли использовать меньшие объемы крови.

Сбор данных
Для исследования образования тромбов на PAECs, Calcein AM-Red флуоресцентно помечены клетки крови и Alexa488-спряженный фибрин были пролиты в течение 5 мин при 2,5 дине/см² (рисунок 2A-C). Приверженцы клеток крови и отложенного фибрина были количественно. Изображения были приобретены каждые 30 с и количественно с ImageJ. Важно вычесть фон, чтобы устранить аутофторесценцию неохваченных тромбоцитов. Алгоритм треугольника для порогового значения используется для определения минимального фона. Это позволило измерить небольшие агрегаты тромбоцитов(рисунок 2D).

Ожидается, что при нестифюсированных условиях не было связывания тромбоцитов и фибрина с эндотелием. Для содействия выпуску VWF и связывания тромбоцитов, PAECs были стимулированы с гистамином, что привело к немедленному увеличению адгезии тромбоцитов достижения плато после 2,5 мин. В это время тромбоциты начали выделяет аутокринные факторы, которые индуцируют агрегацию тромбоцитов и расщепление фибриногена в фибрин. Фибрин был отложен через 3 мин и сформировал стабильный агрегат с тромбоцитами через 4 мин(рисунок 2E).

Для исследования того, может ли этот эффект быть ингибируется прямым пероральным антикоагулянтом (DOAC), кровь лечилась 10 нМ дабигатраном. Дабигатран был добавлен в разбавление крови, где он подавляет фактор IIa в пути свертывания, и предотвратить расщепление фибриногена для формирования фибринов. Когда dabigatran-обработанная кровь была perfused над стимулированными PAECs, образование сгустка смогло сразу быть ингибировано главным образом путем задерживать осаждениеfibrin (рисунок 2F).

Анализ данных
Для изучения влияния различных эндотелиальных источников на образование тромбов были проанализированы клеточные изменения при перфузии крови 5 мин. Эндотелий был зафиксирован и адепт тромбоциты были помечены CD42b до изображения под конфокальные микроскопы. Это обеспечило детальный анализ для colocalization тромбоцитов и фибрина которые смогли показать дисфункциональные факторы свертывания в крови. Влияние ЭК на образование тромбов определялось стандартным иммунофлуоресцентным окрашиванием. Эндотелиальные контакты клеток-клеток были сохранены, что подтверждается VE-кадерин окрашивания, что свидетельствует о том, что сгустки крови образуются на верхней части эндотелиального монослойного, а не на основной матрицы между эндотелиальными зазорами (Рисунок 3). Кроме того, использование различных источников клеток привело к различным моделям тромбии формирования на эндотелии. HUVECs венозных эндотелиальных клеток и показали ограниченное адгезии тромбоцитов и фибрина осаждения, в то время как больные первичной PAEC от пациентов CTEPH показали обильные адгезии тромбоцитов и более фибриновой осаждения на стимуляции гистамина по сравнению со здоровым PAEC. Это говорит о том, что эндотелий пациентов CTEPH показывает более высокую отзывчивость к вазоактивации, что приводит к увеличению образования тромбов.

Рисунок 1: Схематический обзор протокола. (A) Различные источники и различные типы эндотелиальных клеток были изолированы и культурны для использования в канале микрофлюидного потока для экспериментов перфузии. Представитель brightfield изображения различных типов эндотелиальных клеток. Шкала бар 50 мкм. (B) Изолированные клетки характеризовались иммунофлуоресцентного окрашивания для подтверждения эндотелиального фенотипа. Шкала бар 50 мкм. (C) Клетки могут быть посеяны в коммерческих слайдов потока или заказных микрофлюидных каналов. (D) Представитель brightfield изображения HUVEC, выращенные в различных геометриях канала. Шкала бар 50 мкм. ( E )Экспериментальнаяустановка экспериментов перфузии крови. Соцированная кровь была собрана, разбавлена солевым буфером и пролита эндотелиальными клетками шприцевым насосом. Легкие и пуповины в этой фигуре были изменены из Сервье медицинского искусства, лицензированных в соответствии с Creative Common Атрибуции 3.0 Общие лицензии. http://smart.servier.com/ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Приобретение изображений и количественная оценка образования тромбов. (A) Представитель замедленной визуализации придерживались Calcein AM-красный помечены тромбоциты и хранение Alexa488-конъюгированных фибрина на 1, 3, и 5 мин после всей переливания крови над нестимулированныхPAECs( B ) и более гистамина стимулировали PAECs. C)Представительные покадровые изображения адгезии тромбоцитов и фибринов в 1, 3 и 5 мин перфузии с цельной кровью, инкубированной дабигатраном, пронизанной гистаминами, стимулируемыми ПАЭКами. Шкала бар 50 мкм. (D) Схематический обзор количественной оценки изображения в ImageJ. (E) Количественная оценка адгезии тромбоцитов и фибрина осаждения на каждые 30 с на unstimulated и гистамина стимулировали эндотелия. (F)Количественная оценка влияния дабигатрана на образование тромбов, количественное количество тромбоцитов и осаждение фибрина. Данные представлены как среднее ± SD, n No 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Репрезентативные конфокальные изображения экспериментов потока для характеристики образования тромбоцитов и фибринового осаждения на эндотелиальных клетках. Эндотелиальные контакты клеток-клеток характеризовались VE-кадерином и измерялись в контрольных PAECs, производных от пациентов КТЭФ PAECs и HUVEC. Масштабная планка 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Коагуляция является результатом сложного и временно контролируемого взаимодействия между эндотелием и компонентами крови. Этот анализ in vitro представляет собой метод исследования тромбогенных свойств эндотелиальных клеток в режиме реального времени. Различные типы первичных эндотелиальных клеток человека могут быть использованы, облегчая тромбоз на месте в органе и пациента конкретных образом. В этом исследовании мы проиллюстрировали использование этого протокола, сравнивая тромбогенные свойства ПАУЦ, изолированных от здоровых доноров, по сравнению с пациентами CTEPH. Формирование живого тромба изучалось путем перфузии цельной крови здоровых испытуемых над эндотелием, активированным гистамином, в то время как эффект DOAC был протестирован как антитромботический агент.

Помимо использования коммерчески доступных микроканалов, как показано в репрезентативных результатах, внедрение заказных микрофлюидных каналов позволяет изучить влияние изменений сосудистой геометрии на образование тромбов. Например, уменьшение потока в точке ветви или стеноз приводит к увеличению стресса стрижки и больше активации тромбоцитов³⁶. Тем не менее, значительное ограничение этих заказных микрофлюидных каналов является требование высоких номеров клеток, чтобы сформировать стабильный монослой ECs, как описано в шаге 2.3.2. Это может представлять граничающее фактор, когда клетки, полученные пациентом, являются дефицитными. Сильные стороны коммерчески доступных микросхем в том, что поверхностные области модифицируются для клеточной культуры, а области роста больше, что позволяет ЭК образовывать сотый и стабильный монослой. С другой стороны, большая площадь поверхности приведет к большему люмену. Согласно Equation 1, это требует более высоких объемов крови, чтобы достичь аналогичных скоростей потока, как в заказной микрофлюиды.

Улучшение этого протокола может быть для расследования живых потерь ЕС или изменения в целостности барьера. Ущерб ЕС в этом протоколе измеряется только в конце эксперимента. Для отслеживания в реальном времени, ECs могут быть помечены с mCherry VE-кадерин, например³⁷. Однако, поскольку это потребуется очень оптимизированный протокол с эффективной трансфекции вируса, Электрические клетки-субстрат Impedance зондирования (ECIS) могут быть использованы в качестве альтернативы для изучения эндотелиальной целостности и барьерной функции³⁸. Перфузия по специальным каналам потока ECIS позволяет продольный мониторинг эндотелиальной барьерной целостности под потоком. Эти специфические функции ECIS позволяют проводить параллельные измерения эндотелиальных барьерных свойств и образования тромбов. Альтернативные способы параллельных измерений барьера ЕС, особенно в специально изготовленных массивах, включают использование флуоресцентного дектранса в перфусате, который рассеивается из люмена, в зависимости от барьерных свойств ЕС.

Ограничение описанного протокола заключается в том, что ЭК удаляются из организма человека и культуриются на пластике культуры тканей, который является жестким искусственным субстратом. Клетки адаптируются к своей биофизической среде. Это может повлиять на эндотелианую реакцию на активацию тромбоцитов, так как существует связь между активацией тромбоцитов и жесткостью^{стенок 39.} Несмотря на эти адаптации к культуре пластмассы, клетки держать болезни конкретных характеристик, которые могут быть определены в прямом сравнении с ЭК, полученных от здоровых доноров, как показано с контролем, CTEPH-PAEC, и HUVEC, которые оказывают различные модели ссадины тромбоцитов и фибрина осаждения после 5 мин перфузии крови.

В отличие от других протоколов, эта система использует всю кровь, в то время как другие изучают взаимодействие ЕС с одним компонентом крови, таким как тромбоциты^{и лейкоциты 19,20,21}. Разработаны более продвинутые микрофлюидные модели, позволяющие изучать эндотелиальную функцию в сосудистой модели с геометрией круглого сосуда и мягкой внеклеточной матрицей. Тем не менее, они оптимизированы с HUVECs^40,41,42. Новизна описанного протокола заключается в использовании первичных эквалайзеров в сочетании с целой кровью, что приближает моделирование тромбоза на месте на один шаг к условиям in vivo. Оптимизировал протокол для использования полученных пациентом ЭК и крови пациентов дополнительно оптимизирует моделирование заболеваний в пробирке,что позволяет оценить персонализированное образование тромбов и медикаментозное лечение.

Описанный протокол может быть применен для изучения влияния антикоагуляционной терапии на клетки, полученные пациентом. В то время как мы использовали дабигатран для ингибирования образования тромбов, можно использовать другие антикоагулянты, такие как ривароксабан, который непосредственно подавляет фактор Xa в каскаде коагуляции. Ингибиторы прямой тромбоцитов, такие как клопидогрель или аспирин, также могут быть изучены, так как они действуют на основной фазе гемостазы, где тромбоциты связываются с ЭК. В конечном счете, тромбогенные возможности конкретных эквалайзеров пациента во взаимодействии с собственной кровью пациента могут быть использованы для прогнозирования личного эффекта антикоагуляционной терапии на отдельного пациента. Кроме того, нокдаун конкретных белков может обеспечить дополнительную функциональную информацию.

Есть некоторые шаги в описаном протоколе, которые имеют решающее значение для успешного эксперимента перфузии. Во-первых, во время изоляции первичных клеток необходимо получить очень чистую культуру ЕС. Во-вторых, важно, чтобы ЭК образуют стабильный стеченный монослой. Если это не так, небольшое изменение в стрессе стрижки может привести к эндотелиальному повреждению и активации каскада коагуляции, или тромбоциты могут начать связываться с мембраной подвала, что даст ложноположительные результаты. В-третьих, важно предотвратить пузырьки воздуха, так как они могут повредить эндотелий и тем самым повлиять на результаты.

После перекалибровки цитированных крови хлоридом кальция и хлоридом магния важно немедленно начать эксперимент по перфузии. Перекалибвание вызывает быструю реакцию на активацию тромбоцитов и образование тромбов, что приводит к быстрой свертываемости в образце.

В заключение, мы описываем очень универсальный протокол для изучения целых кровенозно-эндотелиальных клеточных взаимодействий во время тромбоза.

Авторы заявляют об отсутствие конфликта интересов.

Мы благодарим Яна Вурберга из Кафедры плазменных белков, Лаборатории исследований Санкина и Ландштайнера, Амстердам UMC, Академический медицинский центр, Амстердам, Нидерланды, за его вклад в эту рукопись. Эта работа была поддержана Голландским кардиососудистым альянсом (DCVA) (2012-08, 2014-11), присужденным консорциуму Phaedra и Reconnect, а также грантом Impulse 2018, предоставленным консорциуму Phaedra IMPACT. Эти гранты включают коллективное финансирование Голландского фонда сердца, Голландской федерации университетских медицинских центров, Нидерландской организации по исследованиям и разработкам в области здравоохранения и Королевской нидерландской академии наук. Кроме того, эта работа финансировалась Европейским исследовательским советом в рамках программы Advanced Grant 'VESCEL' (номер гранта: 669768). XDM финансируется за счет научно-исследовательского гранта Института кардиососудистых исследований (ICaR-VU) в Медицинском центре Университета VU, Амстердам, Нидерланды.