全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

患者由来の内皮との全血相互作用を調べるインビトロ血管疾患モデルを紹介する。このシステムは、様々な状況下での原発性内皮細胞の血栓形成特性の研究を可能にする。この方法は、凝固の異なる段階でのその際の血栓性および抗凝固療法において評価するのに特に適している。

血栓の形成は、内皮細胞、その基礎となるマトリックス、様々な血液細胞、およびタンパク質との間の複雑な相互作用を伴う。内皮は、血小板凝集、凝固、および線維化を制御する主要な止血分子の多くの主要な供給源である。血栓症のメカニズムは何十年も前から調べられてきたが、 インビトロ 研究では、主に、下皮系マトリックスが露出する血管損傷の状況、または単一の血液成分との細胞間の相互作用に焦点を当てている。我々の方法は全血と無傷の、コンフルエントな血管細胞ネットワークとの間の相互作用を研究することを可能にする。

原発性ヒト内皮細胞を利用することにより、このプロトコルは、血栓動態に対する内皮細胞の影響を研究するユニークな機会を提供し、血栓性疾患の病態生理学に関する貴重な洞察を提供する。カスタムメイドのマイクロ流体流路を使用することで、疾患固有の血管形状の適用とモデル特定の形態学的血管変化を可能にします。血栓の発達は、血小板付着およびフィブリン沈着によってリアルタイムかつ定量的に特徴づけられる。変性血栓動態における内皮機能の効果は、特定の分子の免疫蛍光染色による事後分析によって決定される。

代表的な結果は、実験のセットアップ、データ収集、およびデータ分析を記述します。研究の質問に応じて、細胞タイプ、せん断率、チャネル幾何学、薬物療法、および後分析手順を含む、すべてのセクションのパラメータを調整することができます。このプロトコルは、慢性血栓塞栓症患者の肺動脈内皮上の血栓形成を定量化することによって検証される。

内皮は血管の内部細胞層を形成し、周囲の組織から血液を分離する。マイクロ環境を積極的に調節し、外部刺激に応答する動的器官として説明されている^。血液を流れる血液との直接的な接触のために、内皮は止血および血栓症の制御において極めて重要であり、血小板凝集、凝固、および線維化を制御する主要な調節分子の多くの主要な供給源^{である2。}健康な非活性化された内皮細胞(EC)は、血小板活性化を打ち消し、血球の血凝固および血栓形成を防止する複数の分子を産生し、プロスタサイクリン、トロンボモジュリン、または組織因子経路阻害剤(TFPI)2、3などの血流を維持する。^2,3これにより、血小板の付着、血小板凝集、血栓形成を防ぐことができます。血管壁の損傷または活性化は、局所的な血小板付着および血塊形成を開始する前凝固性内皮表現型^22,44をもたらす。内皮活性化血小板がフォン・ヴィルブランド因子(VWF)に付着すると、ICから放出される多量体タンパク質、または下層内皮マトリックスの露出結合部位に付着する。続いて、血小板の分子変化および組織因子への曝露(TF)は、凝固系の活性化を開始し、フィブリン重合^55、66によって血栓形成を誘導する。一緒に、得られた血栓は再内皮化による創傷閉鎖の基礎を提供^する7。凝固系の摂動は、フォン・ヴィレブラント病、血友病、または血栓症などの出血性疾患をもたらし、しばしば内皮血性経路^22,33の調節不秩序な前血栓および抗血栓バランスに起因する。

止血のプロセスは、動脈循環と静脈循環の両方で起こる。しかし、動脈血栓症と静脈血栓症の根底にあるメカニズムは根本的に異なります。動脈血栓症は虚血性心疾患に見られるように、主に高剪断ストレスの条件下でアテローム硬化性プラークの破裂によって駆動されるが、静脈血栓症は、主に、stasis^{88、9、109,10}の状態で内皮損傷の不在のときに発症する。深部静脈血栓は肺動脈に向かって塞栓して進み、そこで肺塞栓症を引き起こす。これは、慢性血栓塞栓性肺高血圧症(CTEPH)11、12、13、14の発症を含む、chonic肺疾患の発症を促進する可能性のある有意な機能能力^11,12,の障害につながる慢性血管閉塞をもたらす可能性がある。^13,14CTEPHは、血栓塞栓性物質による肺動脈の閉塞による肺圧の上昇を特徴とする¹⁵の抗凝固療法の少なくとも3ヶ月後である。肺塞栓症に加えて、肺内皮は、肺動脈の皮血栓症および慢性閉塞を促進するCTEPHにおけるプロトロンボメティック環境を提供し、最終的に心不全を引き起こす血圧の上昇を引き起こし^、16,17,17を治療しないと仮定される。

過去数年間、血小板機能と凝固¹⁸を測定して血栓形成を調べるアッセイの開発に至った。しかし、それらのほとんどは、コラーゲンまたはフィブリンのような単一の細胞外マトリックス成分との全血の相互作用を研究するか、または内皮血小板または内皮-白血球相互作用^{19、20、21、22}のような単一の血液成分と相互作用する内皮^19,機能を研究する。^,21,22これらのアッセイは、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)で最も一般的に行われ、これらの細胞は容易に得られる。しかしながら、血行抑制遺伝子は、血管樹、血管型、および器官系^23,24,24を横切って差動発現し、これは、HUVECを用いて動脈血栓症または肺塞栓症に関与する内皮細胞を表すことを問題のある²³にする。

EC可塑性に加えて、疾患特異的血行力学的変化および血管形態の変化は、正常な内皮²⁵における血栓形成を促進することができる。より高い剪断速度は、局所的な血管収縮または血管形状の変化に起因して、例えば、急性血栓形成をもたらし、血流の停止を促進する狭窄を引き起こす^26。カスタムメイドのマイクロエンジニアリングされた流路を使用することで、(patho)生物学を代表する血管形状を具体的に設計することができます。このようにして、健康または疾患を有するEC²⁷に対する局所生物力の影響を研究することができる。

凝固カスケードには異なる相や分子を標的とする抗凝固療法があり、これらはすべて特定の障害に特有の特定のリスクと利点をもたらします。本論文で説明する疾患モデリングのアプローチは、血栓動態に及ぼす様々な抗凝固療法および抗血小板療法の効果をテストするのに特に適している。

目的は、プライマリICを含む血栓症のモデルを提示し、使用されるプライマリICの種類に応じて様々な形態の血栓症の分析に適した汎用性の高いモデルを生み出す。図として、CTEPH患者の肺動脈内皮細胞を、血栓形成に関与するすべての成分(血小板、白血球、赤血球、凝固タンパク質、補因子)を含む全ヒト血液との相互作用に使用した。このアプローチは、商用の並列流路または特定の血管設計を備えたカスタムメイドのマイクロ流体流路に適用できます。したがって、モデルは最終的に血栓形成と分解能の研究、疾患モデリングにおける炎症反応の評価、抗血小板または抗凝固療法、そして最終的には個別化医療に使用することができる。

この研究は、原発性ヒト肺動脈内皮細胞の単離を記述する。他の初次ヒト内皮細胞タイプの単離については、肺微小血管内皮細胞^25、ヒト臍静脈内皮細胞^28、および血液循環内皮コロニー形成細胞図1A29を含む、以前に公表された方法を参照^する。

この研究は、オランダのアムステルダムにある機関医学倫理審査委員会(METC VUmc、NL69167.029.19)によって承認されました。ヒト被験者の初回細胞隔離および採血は、ヘルシンキ宣言に従って書面によるインフォームド・コンセントが得られた後に行われた。

1. 初発ヒト肺動脈内皮細胞(PAEC)の分離と培養

1. 暖かい完全な内皮細胞培地(cECM)は、5%胎児ウシ血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)、1%内皮細胞増殖サプリメント(ECGS)、および1%非必須アミノ酸(NEAA)を37°Cの水浴中に添加した。手術用ハサミ、鉗子、メスを120°Cの熱滅菌器または70%エタノールで殺菌します。滅菌条件下で層流キャビネット内でPAECの分離を行います。
2. 高親和性の細胞結合60mm細胞培養皿( 材料表を参照)に2mLのフィブロネクチンを2 mL塗布し、37°Cで少なくとも15分間インキュベートします。
3. 手術(例えば、ロボ摘出術または肺内膜切除術)から肺動脈(PA)組織を得て、4°Cのコールドコードバッファー(4 mM塩化カリウム、140mM塩化ナトリウム、10mM HEPES、11 mM Dグルコース、および1%P/S、pH=7.3)に保存し、分離するまで氷上に保ちます。
4. 組織除去後2時間以内にPAから内皮細胞を単離する。鉗子でPAを取り、PBSで洗うために10センチペトリ皿に入れてください。PAがまだリングである場合は、はさみで開いた肺動脈を切り開きます。内皮は容易に損傷を受けたり、取除かれるので、器の最も内側の層に工具で触れないように注意してください。
5. 細胞培養皿からフィブロネクチンを取り出し、4 mLのcECM培地を加える。
6. 鉗子とPAティッシュを取り、媒体に置く。一方、慎重にメスで媒体に容器の内層を掻き取ります。しばしば、脂質蓄積は血管壁に見ることができる。細胞の成長に影響を与えるため、これらを省略してみてください。
7. 内皮細胞の小さなコロニーが出現し始めるまで、培養中の細胞を保持します。
8. 1日おきに培地を交換してください。繊維芽細胞が培養物を汚染する場合は、メーカーの指示に従ってCD144用磁気親和性細胞分離をキットで精製する( 材料表を参照)。最初の精製には2カラム法、連続した精製ごとに1カラム法を使用します。一般に、培養物は、フローサイトメトリーが≤10%汚染細胞を検出すると純粋に定義される。
9. 実験用に十分なPAICが成長するまで、1:3~1:4の比率で細胞を分割します。PAECs を使用する準備ができたら、次の手順に進みます。
10. 精製後、一次内皮細胞はEC特異的マーカー(例えば、VE-カドヘリン、CD31、TIE2)の存在、平滑筋細胞(α-SMA)、線維芽細胞(ビメンチン)、上皮マーカー(サイトケラチン)の存在を特徴付ける必要がある(図1B)。

2. フローチャンバとPAEC単層の調製

注: 仮説に応じて、市販の流れチャンバー( 材料表 および 図1CオプションA、プロトコルのステップ2.1を参照)またはカスタムメイドのマイクロ流体フローチャンバー(図1CオプションB、 プロトコルのステップ2.2)のいずれかを使用します。

1. 市販マイクロスライドにおける内皮単層の細胞播種
   注:市販の流れチャンバは使いやすく、高いせん断率で使用できるチャネル全体に層流パターンを提供する。これらのマイクロスライドは、マルチチャンネルの並列実行を可能にし、正確で再現可能なフロープロファイルを提供するように設計されています。反転顕微鏡に最適化されているため、高品質の蛍光画像を取り込めます。さらに、流れチャンバの様々な次元は異なったチャネルサイズまたは幾何学で利用できる。これらのマイクロスライドは小さい次元を有し、多対的な実行を可能にするので、このアッセイのために6-ウェルの流れチャネルが好ましい。
   1. 6ウェルフロースライド(3.5 mm幅x 0.4 mm高さx 17 mmの長さ)の1チャンネルをコーティングするには、1チャンネルあたり0.1%のゼラチンを30 μL使用し、37°Cで少なくとも15分間インキュベートします。
   2. 1つのチャネルをシードするには、コンフルエントPAIcの10 cm² をトリプシン化し、室温(RT)で7分間300 x g でスピンダウンします。
   3. PAECsを600 μLのcECMおよびピペット100 μL(1.5 cm²⁾ のセル懸濁液1チャンネルで中断します。これは毛管の行為によってマイクロスライドをカバーする。遅すぎると気泡が形成されます。ピペットの際にもう少し力を使って気泡の形成を避けてください。
      注: 細胞密度は内皮表現型に影響を与えます。チャネルの表面積は 0.6 cm² であるため、チャネルあたりのコンフルエント セルの合計 1.5 cm²は過剰に対応します。実験を開始する前に、これらの細胞を最大合流に達するまでチャネル内でさらに6日間培養する。
   4. さらに50 μLのcECMをチャネルに加えて、37°C、5%CO2で一晩インキュベーション₂に十分な培地を提供します。次の日に培地を変更して、非結合細胞を洗い流します。
   5. 細胞を37°C、5%CO2で6日間培養し、PAECがしっかりとコンフルエントな単層を形成できるようにします。 1日おきに150 μLのcECMで交換してください。
   6. 7日目に、PaECをECMで1μMヒスタミンの100μL、1%FBSで、アッセイ前に30分間他の添加剤を使用せずに治療してください。刺激は 、アドリビタムを選択することができます。例えば、TNF-αは、炎症活性化剤として一般的に使用されてきた。
2. カスタムメイドのマイクロ流体流室の調製
   注:カスタムメイドのフローチャンバーは、寸法と形状を簡単に好みに変更できるため、ユーザーのニーズに合わせて調整されます。例えば、より生理学的に関連する血管を模倣するために、狭窄を導入することができる(図1D)。このアプローチは、微小血管疾患に見られるように非常に小さな血液量の使用を可能にする。
   1. パターン化されたウエハーを用いたポリジメチルシロキサン(PDMS)のソフトリソグラフィ
      1. PDMS硬化剤とプリポリマーをマイクロバランス上で1:10比で組み合わせ、汎用ラボミキサーと十分に混合します。
      2. 得られた気泡を除去するために、約1時間デシケータでPDMSを脱気する。
      3. ガラスペトリ皿にアルミホイルを並べ、並んだペトリ皿にウエハーを入れる前に水滴を数滴加えます。ウエハはカスタムメイドのチャネルのモールドとして機能します。
         注意:ウエハースまたはモールドはクリーンルーム施設によって提供されます。負のフォトレジストはウェーハにパターン化され、300 μm 幅 x 270 μm の高さ x 14 mm の長さの突出したチャネルのような特徴を作成します。
      4. ガラスペトリ皿に入れたウエハーに脱気PDMSを注ぎます。
      5. PDMSがデシケータのウエハーに注ぎ込んだデシケーターは、鋳造中に形成された可能性のある気泡を除去するためにさらに15分間注いだ。
      6. デシケータからカビとPDMSを含むペトリ皿を取り出し、60°Cのオーブンに最低4時間置いてPDMSをクロスリンクします。
   2. ガラススライドへの接合のための架橋PDMSの調製
      1. 金型と架橋PDMSをオーブンから取り外し、PDMSのダストフリーハンドリングのためにクロスフローフードに移動します。
      2. メスを使用して金型の底面から PDMS を取り外し、クロスリンク PDMS の上部スラブを金型から取り外します。
      3. 露出したパターンの PDMS スラブに粘着テープを貼り付けて、PDMS チャネルに接触するほこりの粒子を防ぎます。
      4. PDMSチップをサイズにカットし、生検パンチを使用して直径1mmの入口と出口をパンチします。
   3. PDMSマイクロ流体チャネルおよびガラススライドの殺菌と接着
      1. きれいなガラス顕微鏡は、エタノールで十分に洗いすり、続いてイソプロピルアルコールリンスを行うことによってスライドします。それぞれの洗い物の後、十分に窒素銃でスライドを乾燥させます。
         注:また、コンフォーカル顕微鏡を使用して分析を行う場合は、カバースリップを使用することもできます。
      2. プラズマチャンバを開き、保護テープなしで、洗浄された顕微鏡スライドとマイクロ流体チップをロードします。
      3. チャンバーを閉じ、窒素で1分間パージし、500 mTorrの圧力に達するまで濾過空気でチャンバーを満たします。
      4. 50 W のパワーと 5 kHz の周波数を使用して、40 s のプラズマにガラス スライドと PDMS チップを公開します。
      5. プラズマに曝露した後、すぐにガラススライドとマイクロ流体チップを結合します。滅菌ペトリ皿にデバイスを保存します。
3. マイクロ流体チャネルにおける内皮単層の細胞播種
   1. 10 μLの0.1 mg/mLコラーゲンタイプIまたは0.1%ゼラチンを1チャンネルあたり10μLにピペットしてカスタムメイドのマイクロチャネルをコーティングし、37°Cで30分間インキュベートします。
   2. 4つのマイクロチャネルをシードするには、25 cm² のコンフルエントPAECsをトリプシン化し、RTで7分間300 x g でスピンダウンします。
      注: サーフェスに接着するセルは、ごく一部です。したがって、コンフルエント単層を達成するために過剰な細胞を使用する必要がある。
   3. PAECsを20 μLのcECMで中断し、各チャンネルに5μLのセルサスペンションを使用します。チャネル寸法が小さいため、毛細管の力がマイクロスライドを満たし、気泡の形成を防ぎます。
   4. 3~4時間後に培地を交換して、非結合細胞を洗浄します。
   5. 細胞を培養に6日間保持し、PAECがしっかりとしたコンフルエント単層を形成できるようにします。少量のため、150 μL の cECM で毎日メディアを交換します。入口にミディアムで充填されたピペットチップを残し、出口に空の先端を入れます。これは、細胞に十分な栄養素と成長因子を提供する貯水池として機能し、スライドが乾燥するのを防ぎます.
   6. 7日目に、Hoechst(cECMで1:5,000)を用いて生細胞中の核を染色し、37°Cおよび5%CO2で最大10分間インキュベートする₂。
   7. cECMで3倍丁寧に洗浄し、ECMで1μMヒスタミン+1%FBSで30分間、アッセイ前に処理します。刺激は 、アドリビタムを選択することができます。例えば、TNF-αは、炎症活性化剤として一般的に使用されてきた。
   8. PDMSチップの出口をチューブに接続するには、直径1.27mm 90°の角度付きステンレス鋼コネクタを使用します。

3. 全血の準備

1. 0.109 M クエン酸抗凝固剤の被験者から静脈血を引き出す。これは、抗凝固治療を受けていない健康または病気の被験者からすることができます.チューブをそっと反転して混ぜます。実験に必要な血液の総量は、主に選択した流量に依存します。25 mL/hの流量で、ibidi 6ウェルスライドでは、浴槽と流路を満たすために少し過剰で2mLの総体積で十分です。
2. 血液を50 mLチューブに移し、カルセインAM(1:10,000)を加えて血液細胞とAlexa488-fibrinogen(15μg/mL)を蛍光的に標識し、自家フィブリノーゲンをコンジュゲートします。血液を37°Cで15分間インキュベートし、完全な吸収を可能にします。
3. 血液1:1を再石灰化バッファー(154 mM塩化ナトリウム、10.8 mM クエン酸三ナトリウム、2.5 mM 塩化カルシウム、2 mM塩化マグネシウム)で希釈して実験開始する直前に行います。
   注:最大50%の血液希釈は凝固反応時間³⁰に影響を与えませんでした。さらに、ヒトの血液は、ウイルスおよび他の薬剤を含むことができる。したがって、血液サンプルを使用すると、感染のリスクが伴います。適切な安全対策を講じ、材料の取り扱いを慎重に行うことを強くお勧めします。

4. フローシステムの組み立て

1. チューブを接続する前に、洗浄バッファー(36 mMクエン酸、103 mM塩化ナトリウム、5 mM塩化カリウム、5 mM EDTA、および0.35%wt/volウシ血清アルブミン[BSA]、pH = 6.5)で満たされた20 mLシリンジでフローチューブを洗い流します。
2. 新しいシリンジを使用して、フローチューブにHEPESバッファー(132 mM塩化ナトリウム、20 mM HEPES、6 mM塩化カリウム、1mM塩化マグネシウム、1%BSA、および5.5 mM Dグルコース、pH = 7.4)を充填し、肘型のルアーコネクタを慎重にEC培地で満たされたマイクロスライドに接続します。マイクロチャネルにコネクタを取り付けながら、スライド内の気泡の形成を防ぐようにしてください。気泡は、内皮を損傷し、あなたの実験の結果に影響を与えます.洗浄バッファーを完全に取り除き、細胞と接触させないでください。
3. 図 1Eに示すように、フロー システムを設定します。血液が注射器に入った時に凝固を防ぐために20 mLのシリンジおよび洗い流しの洗浄緩衝液の2 mLを取る。空のシリンジをシリンジポンプに挿入し、このシリンジにメスのLuerコネクタで出口チューブを接続します。準備したヒトの血液を含む容器に入口管を入れる。
4. シリンジポンプのスイッチを入れ、流量を計算します。フロー プロファイルは、高さの放物線パターンに従います。血液がニュートン流体として作用すると仮定して、流量を計算するために次の式を使用します。
   (方程式1)
   どこ
   τ = せん断応力
   η = 動的粘度
   Q = 体積流量
   h = チャネルの高さ
   w = チャネル幅
   注:0.4 mmの高さおよび3.5 mmの幅の長方形の次元の商業6チャネルマイクロスライドの血を伴う肺動脈流動のために、25 mL/hの容積流量は5分のために使用された。カスタムメイドのフロー チャネルの寸法の違いにより、これらのダイナミクスも変更されます。変数を調整して、せん断応力が等しいことを確認します。
5. 20 mL シリンジの直径を 19.05 mm に定義し、プログラムを 「退出」に設定します。負圧の適用によって細胞コーティングされたチャネルを通して血液を引っ張ることは一定のせん断率および細胞層への最低の損傷を保証する。

5. 画像取得用の顕微鏡の設定

1. 20倍の目的を使用し、マイクロスライドを反転相コントラスト蛍光顕微鏡のステージに配置します。顕微鏡ソフトを起動し、Z方向にステージを移動し、細胞単層に焦点を合わせます。
2. 各フロー チャネルの先頭、中間、および終了で、対象地域 (ROI) を選択します。開始と終了は、チャネルの入口と出口から少なくとも3 mm離れている必要があります。青色、緑色、赤色の蛍光フィルターに、最小限の背景を示すレーザーパワーと光強度を設定します。

6. PAIC上の全血の灌流

1. 図1Eのようにすべてが接続され、顕微鏡が録画の準備ができたら、スタートを押してビデオを録画します。注射器ポンプで開始を押して、内皮の上に血液を浸透させます。
2. 血液が内皮の上を流れ始めるとすぐに、あらかじめ選択された活性チャネルとROI位置を5分間15sごとに画像を取得する。
3. 5分の灌流の後、録音を終了し、注射器ポンプを停止します。流れチャンバを分解し、非常に慎重にチューブを取り外します。多くの場合、これがあまりにも多くの力で行われると、気泡が形成されます。これは、内皮を洗い流すので、これを防ぐためにしてみてください。

7. 固定および分析後

注:灌流実験による内皮損傷による偽陽性血小板付着を排除するには、その隙間形成および単層のために内皮細胞を特徴付ける必要があります。これはVE-カドヘリンの規則的な免疫蛍光染色によって行うことができる。

1. チューブの灌流と分解の後、HEPESでマイクロ流体チャネルを洗浄します。ピペットHEPESは、血液を出口に押し込むためにチャネルに入ります。別のピペットで余分なものを取り除きます。
   1. 必要に応じて、PBS⁺⁺ でチャネルを洗浄し(0.5 mM塩化マグネシウムと0.9 mM塩化カルシウム)タンパク質上清の沈殿を防ぎます。これにより、背景が減少します。しかし、余分な洗浄ステップは、分析後のイメージングに影響を与える可能性のある細胞の挙動と形態を変える可能性があります。
2. HEPESを取り出し、37°Cのパラホルムアルデヒド(PFA)をチャネルにピペットしてフィブリンを付着させた血小板と堆積させた後、エンドセリウムを取り出し、RTで15分間インキュベートします。
   注: これらのチャネルはさらに小さいため、カスタムメイドのマイクロ流体を固定する際には、各処理手順においてチャネルのせん断力が高くなるので、特に注意してください。
3. PFAをチャネルから取り出し、PBSで3倍洗います。マイクロスライドは、VE-カドヘリン、CD31、Pセレクチンまたはインテグリン、付着血小板用CD42b、白血球用CD45などの内皮細胞マーカーを特徴付ける標準的な染色プロトコルの準備が整いました。
4. 染色後、通常の共焦点顕微鏡で少なくとも5つの画像を撮影し、共局在化を特徴付けます。

8. 画像解析

1. ImageJで蛍光標識された血小板または蛍光フィブリンのいずれかを含むフローアッセイ画像を開きます。選択した画像を ImageJ にドラッグします。
2. 画像は RGB カラーで撮影されます。解析には、8ビット画像が推奨されるため、画像を8ビットに変換する: Image | タイプ | 8ビット。
3. 背景を最小限に抑えるには、スライド式放物線で減算し、ローリングボールがローカルで元の画像からバックグラウンドピクセルを計算して減算します。背景を減算する |ローリングボール半径= 50ピクセル|スライディングパラボロイド.
   注: 画像サイズはピクセル単位で定義されます。ただし、面積を測定するには、スケールを設定する必要があります。0.45の数値開口で20倍の目的で画像を撮影すると、顕微鏡はμm当たり2ピクセルのスケールを持ちます。ほとんどの場合、縮尺を設定するために必要な情報はイメージのメタデータに保存され、ImageJ: 分析 | スケールを設定します。
4. 付着した血小板または付着したフィブリンを定義するしきい値を設定します。三角形の方法を使用すると、しきい値が自動的に調整されます: イメージ | 調整 | しきい値:
5. [パーティクルを解析]コマンドを使用して、血小板またはフィブリンで覆われた領域を解析します。血小板の最小サイズは2μmであるため、2-無限大にサイズを設定する:分析|パーティクルの解析:
6. 結果は、μm²の総計値の平均サイズと被覆面積の割合をμm² で合計面積を提供します。

代表的な結果は、実験のセットアップ、データ収集、およびデータ分析のそれぞれのステップを表す3つの部分に分けることができます。研究課題に応じて、各ステップのパラメータを変更できます。提示されたデータは、血栓形成に対する内皮の影響を研究するために適用される。

実験用セットアップ
内皮細胞は、場所や時間に応じて、健康と病気²³の間に、構造と機能において非常に不均一であることを確立されています。内皮細胞の様々な供給源は、内皮と血液相互作用を研究するために使用することができ、この場合、HUVECおよびPAICを市販した(図1A)。HUVECは実験室モデルで最も一般的に使用されてきたが、PAICは肺動脈から患者由来の単離細胞である。さらに、肺循環または血液循環内皮コロニー形成細胞(ECFC)25、28、29から微小血管内皮細胞(MVEC)を単離するために利用可能な確立されたプロトコル^25,28,29がある。

単離後、内皮細胞は、内皮表現型を確認するためにVE-カドヘリン、CD31、およびTIE2染色によって特徴付けた。αSMAおよびサイトケラチンの存在に対する特徴は、線維芽細胞または上皮様表現型の存在を示した(図1B)。非常に純粋なECsの集団を得た後、3〜5細胞を通過して、商業マイクロスライドまたはカスタムメイドのマイクロ流体流路を播種した(図1C)。市販のマイクロスライドは主に平行流室、または高さまたは分岐角で明確に定義されたパラメータを有するY字型チャネルであるが、マイクロ流体スライドを用いると、実験パラメータを生体内血管形状および血流ダイナミクス³¹に適応させることができる。しかし、カスタムメイドのマイクロ流体サイズは小さく、細胞の広がりを制限し^、より多くの細胞死を誘導する傾向がある^32,33.細胞の余剰を使用すると、細胞のほんの一部しか付着しなさないだろうという事実を補います。これは、狭窄が導入されたときに観察され、そこで内皮細胞は、平行なマイクロ流体チャネルと比較してより細長い表現型を示した(図1D)。商業流れチャンバは細胞が結合できるより大きい表面積を有する。これにより、シード処理に必要なセル数が少なくなります。

内皮細胞と血液の相互作用を研究するために、全血を内皮単層に浸透させた。浸出した血液は、実験の日と灌流の直前に回収された。細胞は、VWF放出および血小板付着を30分灌流前に誘導するためにヒスタミンで刺激した(図1E)34,35。^34,35Figure 1E寸法が小さいため、カスタムメイドのマイクロ流体チャネルは、より小さな血液量の使用を可能にしました。

データ収集
PAECs上の血栓形成を調査するために、Calcein AM-赤色蛍光標識血液細胞およびAlexa488-共役フィブリンを2.5 dyne/cm²で5分間灌流した(図2A–C)。接着性血液細胞および沈着したフィブリンを定量した。画像は30s毎に取得し、ImageJで定量化した。非接着血小板の自己蛍光を排除するために、背景を減算することが重要であった。しきい値の三角形アルゴリズムは、最小限の背景を定義するために使用されています。小さな血小板凝集体の測定を可能にした(図2D)。

予想されるが、非刺激条件下では、内皮に血小板およびフィブリンの結合はなかった。VWFの放出および血小板結合を促進するために、PAICはヒスタミンで刺激され、2.5分後に血小板付着が直ちに高原に達した。このとき、血小板は、血小板凝集およびフィブリノーゲン切断をフィブリンに誘導するオートクリン因子を分泌し始めた。フィブリンを3分後に沈着させ、4分後に血小板で安定した凝集体を形成した(図2E)。

この効果が直接経口抗凝固剤(DOAC)によって阻害される可能性があるかどうかを調べるため、血液を10 nMダビガトランで治療した。ダビガトランを血液希釈に添加し、そこで凝固経路における因子IIaを阻害し、フィブリン線維を形成するフィブリノーゲンの切断を阻止した。ダビガトラン処理血液が刺激PAICに浸透した場合、血栓形成は主にフィブリン沈着を遅らせることによって直接阻害され得る(図2F)。

データ分析
血栓形成に対する様々な内皮源の影響を調べ、5分の輸血時の細胞変化を分析した。内皮を固定し、共焦点顕微鏡下でイメージングする前に付着血小板をCD42bで標識した。これは、血液中の機能不全凝固因子を示す可能性のある血小板およびフィブリンの共局在化のための詳細な分析を提供した。血栓形成におけるECの影響は、標準免疫蛍光染色法によって決定された。内皮細胞接触は維持され、VEカドヘリン染色によって確認されたように、内皮間隙間の基底行列ではなく、内皮単層の上に形成された血栓を示す(図3)。さらに、異なる細胞源を用いることによって、内皮上に血栓形成の異なるパターンが生じる。HUVECは静脈内皮細胞であり、限られた血小板付着およびフィブリン沈着を示したが、CTEPH患者からの疾患原発PAECは健康なPAECと比較してヒスタミン刺激に対して豊富な血小板付着およびより多くのフィブリン沈着を示した。これは、CTEPH患者の内皮が血管活性化に対する応答性が高く、血栓形成の増加を示すことを示唆している。

図1:プロトコルの概略図(A)様々なソースおよび異なるタイプの内皮細胞を単離し、灌流実験用のマイクロ流体流路で使用するために培養した。異なるタイプの内皮細胞の代表的な明視野画像。スケールバー=50μm(B)分離細胞は、内皮表現型を確認する免疫蛍光染色によって特徴付けた。Bスケールバー= 50 μm(C)セルは、市販のフロースライドまたはカスタムメイドのマイクロ流体チャネルのいずれかにシードすることができます。(D) 異なるチャネル形状で成長したHUVECの代表的な明視野画像。スケールバー= 50 μm(E) 輸血実験の実験クエンセレートした血液を採取し、生理食塩水緩衝液で希釈し、注射器ポンプで内皮細胞を透過させた。この図の肺と臍帯は、創造的な共通の帰属3.0一般的なライセンスの下でライセンスされたServierメディカルアートから変更されました。http://smart.servier.com/この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:血栓形成の画像取得と定量化(A)接着したカルセインAM-Red標識血小板の代表的なタイムラプスイメージングと、非刺激PAECs(B)上の全血灌流後1、3、および5分でAlexa488-共役フィブリンを堆積Bさせ、ヒスタミン刺激PAIC上に。(C) ヒスタミン刺激PAIC上に浸透したダビガトランを介して全血を注入した1、3、および5分間の灌流における血小板付着およびフィブリン沈着の代表的なタイムラプス画像。スケールバー = 50 μm(D) ImageJにおける画像定量の概略図。(E)非刺激およびヒスタミン刺激内皮上の30s毎の血小板付着およびフィブリン沈着の定量化。(F)血小板付着およびフィブリン沈着によって定量化された血栓形成に対するダビガトランの効果の定量化。データは、SD、n = 3±平均として表されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:内皮細胞上の血小板付着およびフィブリン沈着における血栓形成を特徴付けるフロー実験の代表的な共焦点像。 内皮細胞接触はVEカドヘリンによって特徴付け、対照PAECs、患者由来CTEPH PAICおよびHUVECで測定された。スケールバー= 50 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

凝固は、内皮と血液成分の間の複雑で時間的に制御された相互作用の結果である。この インビトロ アッセイは、内皮細胞の血栓形成特性をリアルタイムで調べる方法を提示する。様々なタイプの原発ヒト内皮細胞を使用することができ、臓器および患者特異的な方法 でのその際 の血栓症を容易にする。本研究では、健常ドナーとCTEPH患者から分離されたPAECsの血栓原性特性を比較するこのプロトコルの使用を示した。生血栓形成は、ヒスタミン活性化内皮上の健康な被験者からの全血の灌流によって研究されたが、DOACの効果は抗血栓剤として試験された。

市販のマイクロチャネルの使用に加えて、代表的な結果に示すように、カスタムメイドのマイクロ流体チャネルの導入は、血栓形成に対する血管幾何学的変化の影響の研究を可能にする。例えば、分岐点または狭窄で流れが減少すると、せん断応力が増加し、より多くの血小板活性化³⁶が生じる。しかし、これらのカスタムメイドのマイクロ流体チャネルの重要な制限は、ステップ2.3.2で説明したように、ECsの安定した単層を形成するために高い細胞数の要件です。これは、患者由来細胞が不足している場合に制限要因を提示する可能性があります。市販のマイクロスライドの強みは、細胞培養のために表面積が改変され、成長領域が大きくなり、それによりECsがコンフルエントで安定した単層を形成できることである。一方、表面積が大きいと、大きなルーメンが生じてしまう。 式1によると、これはカスタムメイドのマイクロ流体と同様の流量に達するためにより高い血液量を必要とします。

このプロトコルの改善は、ライブECの損失やバリアの完全性の変化を調査することです。このプロトコルにおけるEC損傷は、実験の最後にのみ測定される。ライブトラッキングの場合、ICにはmCherry VE-cadherin(例えば³⁷⁾でタグ付けできます。しかし、これは効率的なウイルストランスフェクションを伴う高度に最適化されたプロトコルを必要とするため、電気セル基板インピーダンスセンシング(ECIS)は、内皮の完全性およびバリア機能³⁸を研究する代替手段として使用することができる。特殊なECIS流路上の灌流により、フロー下での内皮バリア完全性の縦方向モニタリングが可能です。これらの特定のECIS機能により、内皮バリア特性と血栓形成の並列測定が可能です。特にカスタムメイドアレイにおける並列ECバリア測定の代替方法として、ECバリア特性に応じて、内腔から拡散するペルフューザート内の蛍光デックストランスの使用が挙げられます。

記載されたプロトコルの制限は、VCが人体から取り除かれ、組織培養プラスチック上で培養され、硬く人工的な基質であることである。細胞は生物物理学環境に適応します。血小板活性化と壁剛性³⁹との関連があるので、血小板活性化に対する内皮応答に影響を与える可能性がある。これらの培養プラスチックへの適応にもかかわらず、細胞は、5分の輸血後に血小板付着およびフィブリン沈着の異なるパターンを発揮した対照、CTEPH-PAEC、およびHUVECと示すように、健康なドナー由来のECと直接比較して同定できる疾患特異的特性を維持する。

他のプロトコルとは対照的に、このシステムは全血を使用し、他のシステムは血小板および白血球^{19、20、2120}のような単一の血液成分とのEC相互作用^を21研究する。¹⁹円形血管形状と軟質細胞外マトリックスを用いた血管モデルにおける内皮機能の研究を可能にする、より高度な微小流体モデルが開発されている。ただし、これらは HUVECs^{40、 41,、42}で最適化^{されています}。The novelty of the described protocol is the use of primary ECs combined with whole blood bringing the modelling of in situ thrombosis one step closer to in vivo conditions.患者由来のECsおよび患者由来の血液の使用のための議定書を最大限に活用した、より、疾患のモデル化をvitroで最適化し、個別の血栓形成および薬物治療の評価を可能にする。

記載されたプロトコルは、患者由来細胞に対する抗凝固療法の効果を研究するために適用することができる。ダビガトランを用いて血栓形成を阻害する一方で、凝固カスケードで因子Xaを直接阻害するリバロキサバンなどの他の抗凝固剤を使用することが可能である。クロピドグレルやアスピリンのような直接血小板阻害剤も同様に研究することができ、これらは血小板がECsに結合する止血症の一次相に作用する。最終的には、患者自身の血液と相互作用する患者特異的なECの血栓原性能力を使用して、個々の患者に対する抗凝固療法の個人的な影響を予測することができる。さらに、特定のタンパク質のノックダウンは、追加の機能情報を提供することができます。

説明されたプロトコルには、灌流実験を成功させるために重要ないくつかのステップがあります。まず、原細胞の単離の間に、高度に純粋なEC培養を得る必要がある。第二に、ACが安定したコンフルエント単層を形成することが重要である。そうでなく、せん断応力のわずかな変化が内皮損傷および凝固カスケードの活性化を引き起こす可能性があり、血小板が原始膜に結合し始め、偽陽性の結果をもたらす。第三に、気泡が内皮に損傷を与え、結果に影響を与える可能性があるので、気泡を防ぐことが不可欠です。

塩化カルシウムと塩化マグネシウムでクケイトされた血液を再石灰化した後、直ちに灌流実験を開始することが重要である。再石灰化は血小板の活性化および血栓形成において迅速な応答を誘発し、サンプル中に速い凝固をもたらす。

結論として、血栓症中の全血内皮細胞相互作用を研究するための非常に汎用性の高いプロトコルを記述する。

著者らは利益相反を宣言しない。

私たちは、プラズマタンパク質学科、サンキン研究ランドシュタイナー研究所、アムステルダムUMC、アカデミックメディカルセンター、アムステルダム、オランダ、この原稿に彼の入力に感謝します。この作品は、パエドラと再接続コンソーシアムに授与されたオランダの心臓血管同盟(DCVA)[2012-08、2014-11]とパエドラIMPACTコンソーシアムに授与されたインパルス助成金2018によって支えられました。これらの助成金には、オランダ心臓財団、オランダ大学医療センター連盟、オランダ保健研究開発機構、オランダ王立科学アカデミーによる団体資金が含まれます。さらに、この研究は、高度な助成金'VESCEL'プログラム(グラント番号:669768)の下で欧州研究評議会によって資金提供されました。XDMは、オランダのアムステルダムにあるVU大学医療センターの心臓血管研究研究所(ICaR-VU)の研究助成金を受けています。