면역 세포 자극을 위한 인간 S100A12 및 그 이온 유도 올리고머의 정화

본 프로토콜은 인간 단핵구 자극 분석법에 대한 재조합 태그 없는 칼슘 결합 단백질 S100A12 및 이온 유도 올리고머에 대한 정제 방법을 기술한다.

본 프로토콜에서, 우리는 면역 세포 자극을 위한 대장균 배양으로부터 인간 칼슘 결합 단백질 S100A12 및 이온 유도 올리고머를 정제하는 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 대한 단백질 사전 정제및 소수성 상호작용 컬럼의 후속 연마 단계를 포함하는 2단계 크로마토그래피 전략을 기반으로 합니다. 이 전략은 관리 가능한 비용으로 고순도 및 수율의 S100A12 단백질을 생산합니다. 면역 세포에 기능적인 실험에 대 한 결국 잔재 endotoxin 오염 신중 한 모니터링 및 endotoxin 없는 단백질을 얻기 위해 추가 청소 단계를 필요. 내독소 오염의 대다수는 항이온 교환 크로마토그래피에 의해 제외될 수 있습니다. 잔류 오염을 고갈시키기 위해 이 프로토콜은 원심 필터를 사용하여 제거 단계를 설명합니다. 사용 가능한 이온 강도 S100A12에 따라 상이한 호모멀티머로 배열할 수 있다. 구조와 기능 사이의 관계를 조사하기 위해 이 프로토콜은 S100A12 단백질의 이온 처리를 더 설명하고 화학적 가교하여 S100A12 올리고머를 안정화시키고 크기 배제에 의한 후속 분리를 설명합니다. 크로마토그래피. 마지막으로, 우리는 정제된 단백질의 생물학적 활성을 확인하고 LPS 가 없는 제제를 확인하는 세포 기반 분석기를 기술한다.

S100A12는 인간 과립구에 의해 주로 생성되는 칼슘 결합 단백질입니다. 단백질은 (전신) 염증 및 혈청 수준 동안 과발현되며, 특히 전신 성 청소년 특발성 관절염 (sJIA), 가족 지중해 열 (FMF) 또는 가와사키 질환 (KD)과 같은 (자동) 염증성 질환에서 질병 활동 및 치료에 대한 반응. 톨-유사 수용체(TLRs)와 같은 패턴 인식 수용체(PRR)에 따라, 선천적인 면역 계통은 리포폴리대당(LPS) 또는 손상 관련 분자 패턴(DAMPs)과 같은 병원체 관련 분자 패턴(PAMPs)에 의해 활성화될 수 있다. '알람'이라고도 불립니다. DAMPs는 세포 단백질, 지질 또는 핵산과 같은 내인성 분자^1. DAMP 기능은 칼그라눌린 단백질 패밀리의 구성원인 S100A8/A9 및 S100A12^2의구성원에 대해 잘 설명되어 있으며, 이는 또한 이원성 금속 이온 킬레이트 화 항균 펩티드로 작동하는 것으로 보고되고^3,4 ,^{4, 5,6}. 사용 가능한 이온 강도 S100A12에 따라, S100 가족의 다른 구성원과 마찬가지로, 상이한 상동체로 배열하고 최근까지 PRR 상호 작용, 특히 TLR4에 S100A12-올리고머화의 영향은 알려지지 않았다.

단백질의 단모체 형태 (92 아미노산, 10.2 kDa)는 유연한 링커에 의해 연결된 두 개의 EF 손 나선 루프 나선 구조로 구성됩니다. C-단말EF-핸드는 고전적인^Ca2+-결합 모티프를 포함하고 있는 반면,N-말단 EF-hand는 S100 단백질 특이적 확장 루프 구조('의사-EF-hand')를 나타내며 감소된^Ca2+-affinity를 보여줍니다. ^Ca2+-결합 은 단백질의 C-종단에 있는 중요한 형태 변화를 유도할 수 있고, 이는 각 단량체에 소수성 패치의 노출을 초래하고 이량화 인터페이스를 형성한다. 따라서, 생리적 조건하에서, S100A12에 의해 형성된 가장 작은 사각 구조는 개별 단량체가 반평행 방향으로 있는 비공유 이량체(약 21 kDa)이다. 이량체로 배열될 때, S100A12는 Zn²⁺ 뿐만 아니라 다른 원화 금속 이온들, 예를 들어,^Cu2+가 높은 친화성^7을가진 격리기로 보고된다. 이러한 이온은 하나의 서브유닛 및 H85의 아미노산 H15 및 D25뿐만 아니라 반병렬화 다른 서브유닛^8,9,10의 H89에 의해 S100A12 디머 계면에서 조정된다. 이전 연구는 Zn²⁺-로드 S100A12호모 테트라머 (44 kDa)로 단백질의 조직을 유도하고 증가^{Ca2 +}-affinity^11,12,최근 금속 적정을 초래할 수 있음을 제안하는 동안 연구⁶ 은 Zn 2 + 단백질의 친화도를 높이기 위해 S100A12에 의한 Ca²⁺-바인딩을 제안합니다. 일단 S100A12 EF-hands가 Ca^2+에의해 완전히 점유되면, 추가 Ca^2+는 hexamer 형성 (약 63 kDa)을 트리거링, 디머 사이에 결합하는 것으로 생각된다. hexameric 분기 구조의 구조는 tetramer의 아키텍처와 분명히 다릅니다. 테트라머 인터페이스가 중단되어 hexamer^{형성(10)에}이점을 주는 새로운 디머-디머 인터페이스를 야기하는 것이 제안된다. S100A12는 거의 독점적으로 인간 과립구에 의해 발현되며, 여기서 모든 세포종 단백질^13의약 5%를 구성한다. DAMP 기능에서 S100A12는 역사적으로 고급 당화 최종 제품(RAGE)에 대한 다중 리간드 수용체의 작용제로서 기술된 후, 세포외 에서 새로 확인된 RAGE 결합 단백질(EN-RAGE)^14라고불림하였다. 이기는 하지만 우리는 이전에 보고된 생화학적 S100A12-분노 및 TLR4¹⁵둘 다에 결합하고, 우리는 최근에 TLR4 의존적인 방식으로 S100A12 자극에 반응하는 인간 단핵구를^{입증하였다 16.} 이를 위해서는 S100A12를 Ca^{2+ /Zn2+}-유도 된 hexameric 분기 구조^16에배치해야합니다.

여기서 우리는 면역 세포 자극에 대한 재조합 인간 S100A12 및 이온 유도 올리고머에 대한 정제 절차를^16,17에기술한다. 이것은 단백질을 분리하고 집중시키고 벌크 오염을 제거하기 위해 음이온 교환 컬럼을 포함하는 2단계 크로마토그래피 전략에 기초합니다(예를 들어, 내독소/리포폴리사카라이드)18. 이온 교환 크로마토그래피는 다른 순 표면 전하에 기초하여 단백질을 분리합니다. S100A12(5.81의 등전점)와 같은 산성 단백질의 경우 pH가 8.5이고 강력한 음이온 교환 수지의 완충 시스템이 양호한 분리를 유도합니다. 바운드 단백질을 고염 완충구로 용출시켰다. 용출 완충제에서 이온 강도의 증가와 함께 수지의 표면에 전하를 위해 단백질과 경쟁한다. 단백질은 그들의 순 전하에 따라 개별적으로 용해되고 그 결과, 본원에 기재된 완충제는 과발현된 S100A12 단백질을 분리하고 농축할 수 있게 한다. 리포폴리당에서 음전하를 띤 그룹으로 인해, 이 분자는 음이온 교환 수지에도 결합합니다. 그러나, 이들의 높은 순전하로 인해 적용된 고염 구배에서 나중에 용출이 발생한다. 정제 절차의 두 번째 단계는 연마 목적으로 도입되었습니다. 이것은 S100A12의 칼슘 결합 능력을 이용하고 소수성 상호 작용 컬럼에 남아있는 불순물을 제거합니다. S100A12의 칼슘 결합은 단백질의 표면에 형성적 변화 및 소수성 패치의 노출을 유도한다. 그 조건에서, S100A12는 수지의 소수성 표면과 상호 작용한다. EDTA에 의해 칼슘 킬레이트에 의해, 이 상호 작용은 반전. 이온, 특히 칼슘과 아연이있는 경우 S100A12는 동종 올리고머로 배열됩니다. 상이한 올리고머의 구조-기능 관계를 연구하기 위해, 화학 적 가교로 디메릭, 테트라메릭 및 hexameric 재조합 S100A12를 안정화하고 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에서 복합체를 분리했습니다. 마지막으로, 정제된 단백질 및 이온 유도 올리고머의 기능 및 생물학적 활성을 분석하기 위해, S100A12 및 LPS 자극 단핵구의 사이토카인 방출을 비교할 수 있다.

S100A12를 정화하기 위한 다양한 방법이 지금까지 설명되어 왔다. Jackson 등^19,예를 들어, 음이온 교환 컬럼 및 후속 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제가 있는 프로토콜을 발표했다. 크기 제외 열의 정화 연마는 좋은 결과를 초래하지만, 예를 들어 제한된 로딩 볼륨으로 인해 확장성이 덜 유연합니다. Kiss et al.^20에의해 출판된 다른 접근법은^Ni2+ 친화성 컬럼을 통한 태그된 단백질의 정제를 첫 번째 정제 단계로 설명하고, 이어서 효소 절단을 제거하여 태그를 제거하고 추가정제 단계를 수행한다. 상기^19,20,이 프로토콜에 기재된 바와 같이 생산된 단백질은 상기 면역 세포에 대한 실험을 위해 결정된다. 따라서, 세균 배양으로부터의 잔재내독생 오염은 도전이다. 내독소 제거를 위한 다른 접근법이 지금까지 기술되었지만, 주어진 단백질 용액^21,22에대해 동등하게 잘 작동하는 균일한 방법은 없다.

요약하자면, 당사의 프로토콜은 박테리아 시스템에서 태그 없는 발현의 장점을 효율적인 내독소 제거 및 순수 단백질의 높은 수율과 결합합니다.

참고: 버퍼 및 재고 솔루션 준비는 보충 표 1을 참조하십시오.

1. 대장균의 단백질 발현

1. 복제
   1. 복제없는 인간 S100A12 (NCBI 기준 서열: NP_005612.1) 박테리아 발현 벡터 pET11b 내로. 단백질을 발현하기 위해, 컨스트럭트를 대장균 BL21(DE3)으로 변형시킨다.
2. 문화
   1. 14 mL 원형 바닥 튜브에서 5 mL의 성장 배지 (100 μg / mL ampicillin를 가진 LB 국물)에서 단일 콜로니를 접종하여 스타터 배양을 준비하십시오. 220 rpm에서 흔들어 37 °C에서 밤새 배양. 2-4 mL의 하룻밤 배양을 2L 에를렌마이어 플라스크에서 400 mL의 성장 배지로 옮기고 220 rpm에서 흔들어 37°C에서 배양을 배양한다.
      참고: 주 배양의 초기 밀도는 600 nm(OD₆₀₀₎= 0.1에서 광학 밀도여야 한다.
   2. 성장 하는 동안 OD_{600모니터링} 합니다. OD₆₀₀ = 0.5-0.6에서 1 mm의 최종 농도로 1 M 이소프로필-ß-D-티오갈라크토피라노시드(IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도한다. 추가 4 시간 동안 37 °C 및 220 rpm에서 배양하십시오.
      참고: 일반적으로, 0.6의 OD_600은 37°C에서 1.5-2.5시간 후에 도달하게 된다.
   3. 탈이온수 40 mL에서 50 mM Tris, 50 mM NaCl 및 1 mM 에틸렌디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 용해시킴으로써 50 mL 초음파 처리 버퍼를 준비하십시오. HCl으로 pH를 8.0으로 조정하고 최대 50mL를 만듭니다. 프로테아제 억제제(50 mL 용액당 1정)를 추가하고 버퍼를 4°C로 평형화합니다.
   4. 세균 배양을 적합한 원심분리기 병으로 옮기고 4°C에서 30분 동안 3,200 x g에서 세포를 수확합니다. 상급을 버리고 얼음 차가운 초음파 처리 버퍼 25 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 이제부터는 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
      참고: 재중단 된 세포는 단기적으로 -20 °C, 장기적으로 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.
3. 초음파 처리 /인해
   1. 얼음에 30 s의 6 주기 동안 세포를 초음파 처리합니다. 각 주기 후, 과열로부터 세포를 보호하기 위해 30-60 s의 휴게소.
   2. 전지 현탁액을 4°C에서 30분 동안 15,000 x g의 고정각도 로터에서 미리 냉각된 50 mL 고속 원심분리관 및 원심분리기로 옮긴다. 수용성 세포질 단백질을 함유한 제거된 용해제를 신선한 50 mL 튜브에 넣고 펠릿을 버린다.

2. 단백질 정화

1. 애니온 교환 크로마토그래피
   1. 투 석
      1. 음이온 교환 크로마토그래피(AIEX) 완충액 A를 20 mMM 트리스, 1 mM EdTA 및 1 mM 에틸렌 글리콜 비스(2-aminoethylether)-N,N,N',N',N'-테트라아세트산(EGTA)을 탈이온수로 8.5로 조절하여 pH를 HCl로 조절한다. 투석을 위해 2 x 5 L을 준비하고 AIEX 버퍼 A의 크로마토그래피 2x 1 L을 준비합니다.
         참고: 투석기 부피는 샘플 부피의 약 100배여야 합니다. 크로마토그래피에 사용되는 모든 버퍼는 여과(0.45 μm 이하)하고 탈기해야 합니다(예: 초음파 목욕 또는 진공 탈기).
      2. 투석 튜브 (분자량 컷 오프 [MWCO]: 3.5 kDa)를 회전 교반 바 위의 샘플 부력을 보장하기 위해 공기를위한 추가 공간이있는 적절한 길이로 잘라냅니다.
         참고: 글리세롤은 멤브레인을 보존하며 사용하기 전에 제거해야 합니다.
      3. 1.3.2단계에서 제거된 단백질 용액의 점도를 줄이려면, 크로마토그래피 컬럼에 후속 적용을 용이하게 하기 위해 AIEX 완충액 A의 25 mL로 용액을 희석한다. 튜브에 첫 번째 폐쇄를 부착, 멤브레인에 샘플을로드하고 튜브의 상단끝에서 적어도 1cm 두 번째 폐쇄를 부착.
      4. 5L 용기를 AIEX 완충판에 놓고, 볶음통과 단백질 용액으로 채워진 막을 추가합니다. 회전 교반 막대와의 간섭을 방지하여 샘플을 회전하도록 속도를 조정합니다. 4°C에서 12-24시간 동안 투석을 한 다음, 투석기 완충제(AIEX 완충제 A)를 신선한 미리 냉각된 제제로 대체하고 적어도 4시간 동안 계속한다. 투석 단백질 용액을 50 mL 튜브로 옮기고 0.45 μm 필터 유닛을 통해 필터합니다.
         참고: 보관 가능.
   2. 크로마토그래피
   3. 일반적인 유지 보수로 액체 크로마토그래피 시스템(FPLC)을 시작하고, 컬럼 버퍼 AIEX A 및 AIEX B(AIEX 버퍼 A와 1M NaCl)를 연결하고 열을 포함하는 음이온 교환 수지(anion-exchange resin)를 연결합니다. 일반적인 크로마토그래피 매개변수는 표 1을 참조하십시오.
      참고: 버퍼, 컬럼 및 FPLC 장비는 실행을 시작하기 전에 동일한 온도로 평형화되어야 합니다(표 1, 표 2, 표 3,표 4및 표 5의크로마토그래피 매개변수 참조).
   4. AIEX 버퍼 A로 컬럼을 평형화한 후 샘플을 컬럼에 로드한 후 0%에서 100% 고염 버퍼(AIEX B)까지선형 구배로 단백질을 용출합니다. 자세한 메서드 프로토콜은 표 2를 참조하십시오.
   5. 용출 동안 2 mL 분획을 수집하고 쿠마시 염색 15 % 나트륨 도데실 황산나트륨 황산염 폴리아클로미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 각 분획의 10 μL을 분석합니다. 투석을 위해 S100A12 단백질을 함유한 분획을 풀링합니다.
      참고: S100A12의 분자량은 10,575 Da입니다.
2. 칼슘 의존적 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)
   1. 투 석
      1. 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.5항에 기재된 절차에 따라 20 mM Tris에 대한 단백질 용액을 투석2.1.1절에 기재한다.
   2. 크로마토그래피
      1. 크로마토그래피 완충제 HIC A 1L을 20 mM Tris, 140 mM NaCl 및 25 mM CaCl_2를 탈이온수에서 용해시키고 pH를 7.5로 조정합니다. HIC 버퍼 B의 경우 20 mM Tris, 140 mM NaCl 및 50 mM EDTA를 용해하십시오. pH를 7.0으로 조정하고 버퍼를 필터링하고 탈기합니다. 시료에 CaCl_2를 25 mM의 최종 농도로 추가하고 0.45 μm을 통해 필터를 적용하고 HIC 버퍼를 평형화하고 샘플을 4 °C (컬럼 온도)로 조정합니다.
      2. 일반적인 유지 보수로 액체 크로마토그래피 시스템을 시작하고 컬럼 버퍼 HIC A및 B와 열을 연결합니다. 추가 크로마토그래피 매개변수는 표 3을 참조하십시오.
      3. 열의 평형을 조정하고 샘플을 로드하고 UV 신호가 다시 기준 선 수준에 도달할 때까지 '언바운드 샘플 세척' 블록을 확장합니다. 그런 다음 완충제 (EDTA)를 포함하는 칼슘 킬레이트로 용출을 시작합니다. 자세한 메서드 프로토콜은 표 4를 참조하십시오.
         참고: 이전 실험은 과량의 칼슘이 크로마토그래피 수지에 S100A12의 결합에 유익한 것으로 보인다는 것을 보여주었다.
      4. 2 mL의 피크 분획을 수집하고 Coomassie 염색 15% SDS-PAGE에서 각 분획의 10 μL을 분석합니다. 풀 퓨어 S100A12 분획및 헤페스 완충식염수(HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7.0)에 대하여 투석 섹션 2.1.1에 기재된 바와 같이.
         참고 : 단모성 S100A12의 소멸 계수는 2980 M^{-1cm -1입니다.}

3. 내독소 의 검출 및 제거

1. 내독소 검출
   1. 내독소 오염을 확인하려면 2.2.4 단계에서 희석 된 단백질의 농도를 측정하십시오. (예를 들어, HBS에서 1:10 및 1:100) 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)-기반, 형광 내독소 검출분석(물자 표)을사용한다. 제조업체의 프로토콜을 따라 이 분석 작업을 수행합니다.
      참고: 버퍼에 의한 (새로운) 내독소 오염을 피하기 위해 초순수 탈이온수에 용해된 갓 제조된 HBS 용액을 사용하십시오.
2. 내독소 제거 및 단백질 농도
   1. 50 kDa 원심 필터 장치에 시료 15 mL을 적재하고 3,200 x g 및 10 °C에서 약 10 분 동안 원심 분리기를. 필터 막을 HBS로 두 번 세척하여 각 단계 마다 가능한 한 많은 단백질을 회복하십시오.
   2. S100A12-함유 유동-3 kDa 원심 필터를 사용하여 부피가 초기 로딩 부피의 1/5까지 감소될 때까지 농축한다(3,200 x g에서원심분리, 약 30분 동안 10°C). 필터를 필요에 따라 자주 리필하고 멤브레인을 헹구고 각 리필 후 농축 된 용액을 새 튜브로 옮니다. 흐름을 취소합니다. 상기와 같이 50 kDa를 통해 다시 필터링합니다.
      참고: 이 절차 동안 단백질 의 손실은 현저하지만 (최대 50 %), 그러나 나머지 단백질 제제는 LPS에서 완전히 고갈됩니다. 이 방법은 400 mL 배양물에서 약 10-15 mg 단백질을 산출합니다.
   3. 단백질 용액을 내독소가 없는 HBS로 1 mg/mL로 조정하고 3.1.1단계에서 설명한 대로 LPS 함량을 측정합니다. 단백질 용액이 여전히 LPS 프리 (<0.1 EU /mL)로 테스트되지 않은 경우, 내독소 제거 수지를 사용하여 잔재 오염을 제거하십시오.
      참고: 1 mg/mL의 단백질 농도로 0.1 EU/mL LPS의 오염은 약 0.01 pg LPS/μg 단백질과 같습니다.

4. 화학 적 교차 연결 및 올리고머 분리

1. 화학 적 가교
   1. 초순수 탈이온수(재료표)에서1M CaCl₂ 및 100 mM ZnCl_2의 고순도(내독소 가없는) 스톡 솔루션을 준비합니다. 다음 단계에서 갓 만든 이 버퍼를 사용합니다.
   2. 정제 된 내독소가없는 S100A12 (HBS의 농도 1 mg / mL)의 10 mL을 체증 / 테트라메릭의 경우 25 mM CaCl 2 또는 hexameric / 테트라머릭 S100A12의 경우 25 mMM CaCl_{2 및} 1 mM ZnCl2로 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 올리고머.
   3. 사용 전에 직접 500 μL의 내독소가 없는 물에 BS³ 8 mg을 용해시켜 크로스링커를 준비합니다(10 mL 이온 스파이크 단백질 용액에 대한 8 mg 크로스링커는 최종 농도 1.4 mM)와 같습니다. 가명링커와 시료를 RT에서 30분 동안 추가로 배양하고 배양하여 1M Tris-HCl, pH 7.5를 50 mM의 최종 농도에 첨가하고 0.45 μm을 통해 필터하여 반응을 담급금질한다.
2. 크기 배제 크로마토그래피
   1. 가교 시료를 12−15°C(컬럼 온도)로 평형화하고 일반적인 유지보수로 액체 크로마토그래피 시스템을 시작합니다. 열 버퍼(HBS) 및 크기 제외 열을 연결합니다. 자세한 내용은 표 5를 참조하십시오.
   2. HBS의 컬럼을 평형화하고, 시료를 로드하고, 주행 중에 피크 분획(1−2 mL)을 수집합니다. 4-20% 그라데이션 SDS-PAGE에서 이러한 분획을 분석하고 원하는 단백질 복합체의 주요 밴드로 풀 분획을 분석합니다.
      참고: 수성 솔루션에서 BS^3과 같은 NHS 에스테르 시약의 가수 분해는 280 nm에서 강한 흡광도를 초래합니다. 언바운드 크로스링커(분자량: 572 g/mol)는 달리기가 끝날 때 용출되어 강한 피크를 생성합니다.
   3. 10 kDa (디머), 30 kDa (테트라머) 또는 50 kDa (hexamer)의 MwcOs와 원심 필터 장치를 사용하여 솔루션을 집중. 섹션 3.1에 기재된 바와 같이 내독소 오염을 결정한다. 필요한 경우 제조업체의 권장사항(재료 표)에따라 내독소 제거 수지로 남은 LPS를 제거하십시오.

5. 단핵구에 대한 기능 테스트

1. 단핵구의 준비
   1. 자기 비드 분리 키트(재료 표)를사용하여 밀도 그라데이션 원심분리 및 후속 단핵구 농축에 의해 인간 버피 코트로부터 단핵구를 분리합니다.
      참고: 이 프로토콜은 83−95%의 순도를 가진 약 5-7 x 10⁷ 단핵구(버피 코트 1개)를 생성합니다. 세포의 반응성은 기증자에 크게 의존하기 때문에, 프로토콜은 (필요한 셀 수에 따라) 확장되어야 할 수도 있다.
   2. 밀도 원심분리의 경우 분리 용액(밀도 = 1.077 g/mL)을 RT에 평형화하고 20mL를 50mL 원심분리튜브(버피 코트당 2개 튜브)로 옮긴다. 행크의 완충 염액 (HBSS)으로 인간 버피 코트에서 혈액을 총 부피 60 mL로 희석하고 분리 매체 위에 조심스럽게이 혼합물을 30 mL 층을 쌓습니다. RT에서 35분 동안 550 x g의 원심분리기를 작동합니다.
   3. 원심분리 후, 단핵 말초 혈액 세포 (PBMC)는 분리 배지 의 바로 위에 위치한다. 이 세포를 신선한 50 mL 원심 분리튜브로 옮기고, HBSS로 최대 50 mL를 만들고, 10 분 동안 170 x g에서 원심 분리기를 만듭니다.
   4. 튜브를 최대 50 mL및 원심분리기를 290 x g에서 10분 동안 10분 동안 채우고, 상수체를 다시 흡인하고, 170 x g에서 170 x g의 세포를 다시 정지합니다. /c9>) 농도가 5 x 10 7 셀/mL로.
      참고: HBSS 대신에, 인산염 완충식염수(PBS)는 세포를 세척하는데 사용될 수 있다.
   5. PBMC의 단핵구 절연의 경우 자기 음세포 절연 키트를 사용하고 제조업체의 프로토콜을 따르십시오. 단핵구를 계산하고 단핵구 배지(RPMI 1640, 15% 열 불활성화 태아 송아지 혈청 [FCS], 4 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신)에서 2 x 10⁶ 세포/mL의 농도로 재중단합니다.
   6. 배양 단핵구에, 소수성, 가스 투과성 필름을 가진 코트 배양 요리(예를 들어, 100 mm)를 현탁액 세포에적합하다(재료표). 약 30 분 동안 UV 광을 사용하여 플레이트를 살균. 이러한 배양 플레이트에 세포를 전송하고 37 ° C 및 5 %_CO2에서밤새 휴식을 취하게하십시오.
      참고: 코팅된 접시당 15-25 mL의 셀 서스펜션을 사용하십시오.
2. 단핵구 자극
   1. S100A12(와일드타입)를 가진 자극
      참고: 처리되지 않은 S100A12(섹션 2.2.2로부터최종산물)를 가교 단백질로부터 구별하기 위해, 이하의 S100A12를 '야생형'이라고 한다.
      1. 나머지 세포를 50 mL 원심관과 원심분리기에서 10 분 동안 350 x g으로 옮기고 상수부를 흡인하고 자극 매체에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단하십시오 (RPMI 1640, 5 % 열 불활성화 FCS, 4 mM L-글루타민, 100 U / mL 페니실린 / 연쇄상 구균)의 농도에서 2 x 10⁶ 세포 / mL.
      2. 자극을 위해, 24개의 웰 서스펜션 플레이트를 사용하고 웰당 250 μL의 셀 서스펜션을 추가하십시오(0.5 x 10⁶ 세포/웰). 의도한 우물에 50 μg/mL 폴리my신 B를 추가한 다음 다른 농도의 LPS(25, 50, 100 및 200 pg/mL) 또는 야생형 S100A12(10, 20, 40, 60 μg/mL)를 추가합니다. 또한, 단백질을 치료되지 않거나 열변성(99°C, 10분)을 세포에 상이한 농도로 적용한다.
         참고: 짧은 열처리는 S100A12 단백질을 변성하지만 LPS에 미치는 영향은 적습니다.
      3. 37 °C 및 5 %_CO2에서4 시간 동안 인큐베이트 플레이트. 각각의 세포 현탁액을 1.5 mL 반응 튜브로 이송하여 세포를 수확한다. 500 x g에서 10분 동안 원심분리기를 신선한 튜브로 옮기고 제조업체의 권고에 따라 인간 TNFα ELISA 키트를 사용하여 다른 희석물(예: 1:2, 1:5, 1:10)으로 TNFα 방출을 측정합니다.
   2. S100A12 올리고머를 함유한 자극
      1. 전술한 바와 같이 24개의 웰 서스펜션 플레이트에서 단핵구를 준비하고 시드한다. 단계 4.2.3에서 S100A12 올리고머를 추가하여 세포를 자극합니다. 상이한 몰 농도(125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
         참고: 단핵구를 자극하는 상이한 올리고머의 능력을 비교하기 위해, 올리고머는 유사한 몰 농도로 세포에 적용하였다.
      2. 37°C 및 5%_CO2에서4시간 동안 배양하고, 전술한 바와 같이 세포를 수확하고 상술한 바와 같은 초자연에서 TNFα 방출을 측정한다.

AIEX 컬럼(도1A-C)에대한 사전 정제 에 이어 후속 칼슘 의존성 HIC(그림2A, B)를순차단백질(도2C)으로수득하였다. 또한, 내독소의 측정은 성공적인 LPS 제거를 밝혀. AIEX에 따른 LPS 함량은 분석 검출 한계, 즉 500 EU/mL 를 초과하는 1:10 희석으로 측정되었다. 50 kDa 필터 유닛을 통해 첫 번째 여과 후, LPS 함량은 1 EU/mL로 감소되었다. 3 kDa 필터 유닛과 50 kDa를 통한 추가 여과로 농도를 따라, 측정된 LPS 오염은 0.08 EU/mL이었다.

추가적인 대조군으로서, 인간 단핵구는 생성된 야생형 단백질로 자극되었다(도3A,B). 폴리마이신 B 처리는 S100A12로 관찰될 수 없는 LPS 자극 단핵구로부터 TNFα 방출을 방출한다. 다른 한편으로는, LPS와 S100A12 둘 다의 열 처리는 세포를 자극하는 단백질의 수용량을 폐지합니다, 이것은 LPS 자극에 세포 반응에 영향을 미치지 않는 동안.

상이한 이온에 단백질 노출은 상이한 S100A12 올리고머의 배열을 초래한다(도4A). 화학 적 가교는 디머, 테트라머 및 헥마머와 같은 정의 된 복합체뿐만 아니라 전환 상태 (예 : '트리머', 약 30 kDa의 밴드)를 캡처 할 수 있습니다. 가교 전에 올리고머 평형의 뚜렷한 이동을 유도하기 위해, 과량의 이온을 적용하였다(도4B).

동등한 몰 농도에서 분리된 올리고머(그림5A-C)를사용하여 PRR을 통한 신호 능력을 비교한 후 단핵구 자극을 사용하였다. ). 잔재 사이토카인 방출은 테트라메릭 S100A12로 자극된 세포로부터 검출될 수 있으며, 반면 디메릭 단백질로 치료하는 것은 TNFα 방출을 유도하지 않는다.

그림 1: 항이온 교환 크로마토그래피의 결과. (A)280 nm (A_280)에서흡광도가있는 크로마토그램과 용출 완충제 B (파선)의 백분율. 메서드 블록은 A = 언바운드 샘플 세척, B = 용출 버퍼(버퍼 B)가 있는 선형 그라데이션, C=버퍼 B로 세척하고, D = 버퍼 A.(B)분수 튜브 번호가 빨간색으로 관련 피크에 초점을 맞춥니다. (C)선택된 분획을 15% 쿠마시 스테인드 SDS-PAGE로 분석하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 소수성 상호작용 크로마토그래피의 결과. (A)280 nm (A_280)에서흡광도가있는 크로마토그램과 용출 완충제 B (파선)의 백분율. 메서드 블록은 A = 언바운드 샘플을 세척하고, B = 용출버퍼 B를 사용하여, C = 버퍼 A.(B)적색의 분획 튜브 번호가 있는 관련 피크에 초점을 맞춥니다. (C)15% 쿠마시 스테인드 SDS-PAGE에 대한 분석 분수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: 1차 인간 단핵구를 지시된 농도에서 자극하였다. LPS(A)또는 S100A12(야생형, B)를처리되지 않거나 열-탈화(99°C, 10분)로 방치하였다. 두 조건은 폴리 색신 B의 존재와 부재에서 테스트되었습니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: S100A12 단백질은 5 mM^Ca2+를 함유하는 HBS 완충액에서 배양 후 BS^3과 가교하고 Zn²⁺ 농도를 나타냈다. (A)Zn²⁺ 농도를 증가시키면 S100A12를 4-20% 쿠마시 염색 SDS-PAGE에서 분리시 테트라머와 헥사머에 넣습니다. (B)크기 배제 컬럼에서 분리에 사용되는 조건이 있는 가교 된 올리고머의 대표적인 결과. S100A12는 25 mM Ca²⁺ (레인 1) 또는 25 mM^Ca2+ 및 1 mM Zn^2+(레인 2)가 있는 경우 가교되었습니다. (S100A12) ₂ = 이분; (S100A12) ₄ = 테트라머; (S100A12) ₆ = hexamer. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 5: S100A12 올리고머는 크기 배제 컬럼상분리되었다. (A)HBS 버퍼에서 25 mM CaCl₂ 및 1 mM ZnCl_2로가교 후 hexamer / tetramer 분리의 크로마토그램. (B)25 mM CaCl_2와HBS 버퍼에서 테트라머 / 디머 분리를위한 크로마토 그램 . (C)쿠마시 염색 4-15% 그라데이션 SDS-PAGE에 분리 후 풀화 및 농축 올리고머의 예. 레인 1 = 이이머; 레인 2 = 테트라머; 레인 3 = hexamer. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 정제된 S100A12 올리고머를 가진 단핵구의 자극. TNFα-4시간 배양 후 방출은 ELISA에 의해 정량화되었다. 데이터는 두 개의 독립적인 실험에서 평균 값을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 항이온 교환 크로마토그래피의 적용된 매개변수에 대한 자세한 정보.

표 2: 항이온 교환 크로마토그래피의 사용된 방법에 대한 자세한 정보.

표 3: 소수성 상호 작용 크로마토그래피의 적용된 매개변수에 대한 자세한 정보.

표 4: 소수성 상호 작용 크로마토그래피의 사용 방법에 대한 자세한 정보.

표 5: 크기 배제 크로마토그래피의 적용된 매개변수에 대한 자세한 정보.

보충 표 1: 버퍼 및 재고 솔루션 준비. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

이 프로토콜에서, 우리는 면역 세포 자극을 위한 다른 이온 유도 된 올리고머로의 분리뿐만 아니라 인간 S100A12의 태그 없는 세균 발현 및 그것의 정제를 기술한다. S100A12 단백질 정제^8,23,24에대한 출판 된 문헌과 비교하여 소수성 상호 작용 크로마토그래피에서 높은 CaCl₂ (25 mM)를 사용하는 것은 우리의 지식고유입니다. 1 내지 5 mM의 농도를 적용하는 몇몇 프로토콜은 순수한 단백질을 생성하지만, 대신 25 mM CaCl_2를 사용하는 우리의 접근 방식에 따라 몇 배 더 높은 수율을 관찰했습니다. 이것은 컬럼 물질과의 단백질 상호 작용의 계층구조에 의해 설명될 수 있습니다:S100A12는 컬럼 물질에 직접 결합할 수 있습니다 그러나^Ca2+의 과잉은 또한 이미 컬럼 결합단백질에 ^{S100A12-dimers의 간접결합을 촉진할 수 있습니다 8}. 따라서, 높은^Ca2+ 농도는 S100A12 정제에 사용할 수있는 표면을 확대 할 수있다. HIC로부터의 S100A12의 용출(선형 그라데이션을 사용하여) 초기(간접적으로 결합된 S100A12) 및 하나의 매우 늦은 피크(컬럼 물질 결합 단백질)는 이러한 추측을 지원할 수 있다(데이터는 도시되지 않음).

재조합 S100A12 (뿐만 아니라 다른 단백질)의 생산을 위해 높은 수율 및 관리 가능한 비용, 대장균에서의 단백질 발현은 여전히 선택의 방법입니다. 그러나, 세균성 내독소와 불가피한 오염은 단백질이 세포 배양 실험을 위해 결정될 때, 특히 선천적인 면역 세포를 관련시키는 연구 결과에서, 문제가 남아 있습니다. 우리의 경험에 따르면, 세포 배양용으로 명시적으로 선언된 시판되는 단백질조차도 최대 1EU/μg 단백질의 엔도톡신 오염을 함유할 수 있으며, 이는 상당히 비뚤어질 수 있습니다. 따라서 내독소의 완전한 제거는 필수적입니다. 용액의 내독소 단량체는 10 ~ 20 kDa의 분자량 범위이지만 분자량이 높은 미셀 및 구조를 형성 할 수 있습니다. 매우 큰 구조의 형성은, 예를 들어, 이원용 이온^21,25를통해 승진된다.

우리의 프로토콜에 따르면, 우리는 단핵구 자극 분석과 고감도 엔도톡신 측정을 결합하여 S100A12 단백질의 내독소가 없는 생산을 확인합니다. 우리는 이러한 조합이 특히 의미있는 것으로 간주a) 낮은 수준의 내독소 오염은 분석의 감도에 따라 평가하기 어려울 수 있으며 b) 단핵구에 LPS 억제제로 폴리멕신 B의 사용은 인해 데이터를 해석하기 어려울 수 있습니다 세포^26,27에독점적 인 폴리 멕신 B 효과. 폴리믹신 B뿐만 아니라 다른 양이온 펩티드는 음전하 지질 A^28을통해 LPS를 결합하는 것으로 보고된다. S100A12의 용매 노출 표면은 또한 큰 음전하 패치를 포함하여 폴리균 B(그림 3B)의존재에서 S100A12 자극 인간 단핵구에서 TNFα 방출의 관찰 된 감소는 a) 비특이적 직접 결합에 기인 할 수있다 폴리 색신 B에서 S100A12 및 / 또는 b) 자극 세포^26,27에대한 폴리 색신 B의 직접적인 효과 . 낮은 수준의 내독소 오염의 검출과 비특이적 폴리명신 B 효과의 알려진 제한으로 인해, 당사의 프로토콜은 LPS- 및 단백질 매개 TLR4 신호화를 명확하게 구별하기 위한 열 불활성화 단계를 더 포함합니다.

정의된 이온 유도 올리고머의 생성 및 정제를 위한 LPS-free S100A12의 사용은 매우 중요하며, 따라서 완충제 또는 기둥 물질을 통해 엔도톡신의 최종 재도입을 피하기 위해 후속 정제에 각별한 주의를 기울여야 합니다. 내독소 제거 수지로 단백질을 요구하는 LPS-고갈.

단백질의 생물학적 기능에 대한 올리고머화의 관련성은 다른 수단으로 평가될 수 있다. S100A12의 경우, 이온 결합 부위에서 표면 플라스몬 공명과 표적 아미노산 교환을 사용했으며, TLR4를 통해 결합하고 신호를 전달할 수 있는 단백질 복합체를 가장 정확하게 정의하기 위해^Ca2+/Zn 2+의 화학 적 가교를 사용했습니다. - 펄스 재조합 S100A12^16. 상이한 이온 조건 하에서 S100A12의 화학적 가교는 전이에 있는 여러 올리고머 형태를 포함하는 순간상태를 스냅동결한다. 이온 적정 실험에서, 우리는 디메릭, 테트라메릭 또는 히시험성 올리고머가 우세한^{올리고머(16)로}결정될 수 있는 조건을 정의하였다. 또한, 이전 실험에서는 올리고머화도 상당히 낮은 이온 농도에서 유도될 수 있지만, 과량의 이온이 비교되고 안정적인 가교 및 후속 정제에 유리하다는 것을 보여주었습니다. 그러나, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 이러한 올리고머를 정화하면 양호하지만 절대분리는 아닙니다. 그럼에도 불구하고, 올리고머의 선택적 농축은 신뢰할 수있는 다운 스트림 분석을 할 수 있습니다.

요약하면, 본 프로토콜은 LPS 프리 인간 S100A12 또는 관련 칼슘 결합 단백질의 정제방법을 제공한다. 이온 유발 형태 변화를 해결하기 위해 크기 배제 크로마토그래피에 의한 화학적 가교 및 후속 복합 분리는 하류 생물학적 공정에 대한 단백질 올리고머화의 관련성을 이해하는 데 유용한 도구입니다.

저자는 공개 할 것이 없다.

이 연구는 Muenster 대학 의학 교수의 교내 혁신적인 의학 연구 프로그램에서 보조금에 의해 지원되었다 (KE121201 C.K.에) 독일 연구 재단 (DFG, Fo354/3-1 D.F.)