Method Article
פרוטוקול זה מתאר שיטת טיהור ל-רקומביננטי הסידן מחייב חלבון בחינם S100A12 והוא המושרה היונים שלה עבור גירוי מונוציט אנושי.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה כדי לטהר את החלבון האנושי מחייב S100A12 החלבונים ואת oligomers המושרה שלה מפני es, המנוכיה קולי התרבות לגירוי התא החיסונית. פרוטוקול זה מבוסס על אסטרטגיה בעלת שני שלבים כרומטוגרפיה, הכוללת את החלבון הטרום-טיהור בטור כרומטוגרפיה של anion-exchange וצעד נוסף ליטוש בטור של אינטראקציה הידרופובי. אסטרטגיה זו מייצרת חלבון S100A12 של טוהר גבוהה ותשואה על עלויות לניהול. עבור מוסר פונקציונלי על התאים החיסוניים בסופו של דבר שארית זיהום אנדוטוקסין דורש ניטור זהיר ועוד לנקות את הצעדים כדי להשיג חלבון אנדוטוקסין ללא. רוב זהום אנדוטוקסין יכול להיות מנשלל על ידי האניב-exchange כרומטוגרפיה. כדי לרוקן זהום שיורית, פרוטוקול זה מתאר שלב ההסרה עם מסננים צנטריפוגליים. בהתאם לS100A12 של כוח היון הזמין יכול לארגן הומוגוטיימרים שונים. כדי לחקור את הקשר בין מבנה לפונקציה, פרוטוקול זה מתאר עוד את יון-הטיפול של חלבון S100A12 ואחריו כימיים המקשרים לייצב S100A12 oligomers והפרדה הבאים שלהם לפי גודל-להדרה כרומטוגרפיה. לבסוף, אנו מתארים שיטת תא המאשרת את הפעילות הביולוגית של החלבון הטהור ומאשרת הכנה ל-LPS ללא תשלום.
S100A12 הוא חלבון מחייב סידן אשר מופק בעיקר על ידי האדם גרנולוציטים. החלבון הוא ביטוי מוגזם במהלך (מערכתי) דלקת רמות הסרום שלה, במיוחד (אוטומטי) מחלות דלקתיות כגון דלקת מפרקים אידיופטית מערכתית (sJIA), קדחת ים תיכונית משפחתית (FMF) או מחלת קווסאקי (KD) יכול להודיע על פעילות מחלה ותגובה לטיפול. בהתאם לקולטני זיהוי תבניות (PRRs) כגון קולטנים למספרי חיוג (TLRs), מערכת החיסון הטבועה יכולה להיות מופעלת על-ידי תבניות מולקולריות הקשורות לפתוגן (PAMPs) כמו ליפופולפידים (LPS) או נזק דפוסי מולקולרי הקשורים (DAMPs; נקרא גם ' מדאיג '. DAMPs הם מולקולות אנדוגני כגון חלבונים סלולריים, שומנים או חומצות גרעין1. לח-פונקציות מתוארות היטב עבור חברי משפחת החלבון calgranulin, S100A8/A9 ו S100A122, אשר מדווחים גם לפעול כמו מתכת יון-הכלג1 פפטידים מיקרוביאלית3,4, 5,6. בהתאם ל-ion הזמין S100A12 יכול, כמו חברים אחרים של משפחת S100, לסדר לתוך הומומרים שונים עד לאחרונה ההשפעה של S100A12-oligomerisation התאמה על PRR-אינטראקציה, במיוחד TLR4, לא היה ידוע.
טופס monomeric של חלבון (92 חומצות אמינו, 10.2 kDa) מורכב משני מבנים EF-לולאה-סליל הסליל מחובר על ידי מקשר גמיש. C-טרמינל ef-יד מכיל את המוטיב הקלאסי של Ca2 +-מחייב בעוד N-טרמינל ef-יד המוצגים S100 חלבון-מבנה ספציפי לולאה מורחבת ("פסאודו-EF-יד") ומגלה Ca מופחת2 +-אהדה. Ca2 +-קשירה על ידי S100A12 יכול לגרום לשינוי הגדול ביותר של החלבונים ' C-הטרמינוס, אשר גורמת לחשיפה של תיקון הידרופובי על כל מונומר וצורות ממשק dimerization. כך, בתנאים פיסיולוגיים, המבנה הרבעוני הקטן ביותר שנוצר על ידי S100A12 הוא דיימר לא-חד-ממדי (כ -21 kda) שבו מונמרים בודדים נמצאים בכיוון אנטי מקבילי. כאשר מסודרים כמו dimer, S100A12 מדווחת Zn 2 + כמו גם יוני מתכתדיאטתיים אחרים, למשל, Cu2 + עם אהדה גבוהה7. היונים הללו מתואמים בממשק S100A12 דימר על ידי חומצות אמינו H15 וD25 של יחידת משנה אחת וH85, כמו גם H89 של משנה אנטי מקבילים השני8,9,10. בעוד מחקרים מוקדם יותר להציע zn2 +-טעון S100A12 עשוי לגרום לארגון של חלבון לתוך הומו-טטרמרס (44 kda) וכתוצאה מכך מוגברת Ca2 +-אהדה11,12, טיטור מתכת לאחרונה מחקרים6 מציעים Ca2 +-מחייב על ידי S100A12 כדי להגביר את הזיקה של חלבון zn2 +. לאחר S100A12 EF-הידיים מאוכלס באופן מלא על ידי Ca2 +, ca נוסף2 + הוא חשב לאגד בין dimers, מפעיל היווצרות הבוחנים (כ 63 kda). הארכיטקטורה של המבנה האפארי של ההקאמארה שונה בבירור מזו של הטטרמר. הוא הציע כי ממשק הטטרמר משתבש כדי לתת עלייה ממשקי dimer החדש, אשר מועילה היווצרות הבוחנים10. S100A12 מתבטא כמעט באופן בלעדי על ידי הגרנולוציטים האדם שבו הוא מהווה כ 5% חלבון ציטוסולג13. בפונקציה לח שלה S100A12 היה מתואר היסטורית כמו אגוניסט של multi-ליגציה עבור גליקטיון מתקדם מוצרי הקצה (זעם), ולאחר מכן כינה מוצרים שזוהו לאחרונה חלבון כריכת זעם (EN-זעם)14. אף על פי שדווחו קודם לכן כS100A12 ביוכימיים לזעם ולTLR415, הדגמנו לאחרונה מונוציטים אנושיים כדי להגיב לגירוי S100A12באופןהתלוי בTLR4. זה דורש הסדר של S100A12 לתוך Ca שלה2 +/zn2 +-המושרה מבנה הקסעון הרבע16.
כאן אנו מתארים הליך טיהור עבור רקומביננטי S100A12 האנושי ואת oligomers יון המושרה שלה לגירוי תא החיסון16,17. זה מבוסס על אסטרטגיה בעלת שני שלבים כרומטוגרפיה, אשר כוללת בתחילה טור anion-exchange כדי לבודד ולרכז את החלבון ולהסיר זהום בצובר (למשל, אנטוקסינים/ליפופוליסכרידים)18. לחילופין, כרומטוגרפיה שרפים חלבונים נפרדים על בסיס של חיובים שונים של פני השטח נטו. עבור חלבונים חומציים כמו S100A12 (נקודת איזואלקטריים של 5.81), מערכת מאגר עם pH של 8.5 ו שרף anion-exchange חזק מוביל הפרדה טובה. חלבונים מאוגדים הובלו עם מעבר מבריק של מאגר מלח גבוה. עם עלייה של יוני יוני שלילי החוזק במאגר להתחרות עם חלבונים עבור חיובים על פני השטח של שרף. חלבונים בנפרד elute בהתאם לחיוב הנטו שלהם וכתוצאה מכך, המאגרים המתוארים כאן מאפשרים לבודד ולרכז את החלבון S100A12 ביטוי יתר. בשל קבוצות טעונה שלילית ליפופוליסכדים, מולקולות אלה גם לאגד anion-exchange שרפים. עם זאת, החיוב הנטו הגבוה יותר שלהם מביא להאצלת מאוחר יותר את מעבר הצבע הגבוה של המלח. השלב השני של תהליך הטיהור הוצג לצורך הליטוש. זה עושה שימוש ביכולת כריכת הסידן של S100A12 ומסיר את הנותרים זיהומים על העמוד אינטראקציה הידרופובי. כריכת סידן של S100A12 מוביל לשינוי הקונפורמציה וחשיפה של טלאים הידרופובי על פני השטח של החלבון. במצב זה, S100A12 מקיים אינטראקציה עם משטח ההידרופובי של השרף. על ידי הסידן-מכלפת על ידי EDTA, אינטראקציה זו היא הפוכה. בנוכחות יונים, במיוחד סידן ואבץ, S100A12 מארגן לתוך הומומרים oligomers. כדי לחקור את מבנה היחסים בתפקוד של oligomers שונים, אנו התייצב dimeric, tetrameric ו hexameric רקומביננטי S100A12 עם מקשר כימי והפרידו את התסביכים על עמוד בגודל כרומטוגרפיה הדרה. לבסוף, כדי לנתח את הפונקציונליות ואת הפעילות הביולוגית של החלבון מטוהרים ואת oligomers המושרה היונים שלה, שחרור cy, S100A12 ו-LPS גירוי מונוציט ניתן להשוות.
שיטות שונות לטיהור S100A12 תוארו עד כה. ג'קסון ואח '19, למשל, פרסם פרוטוקול עם טיהור באמצעות עמודת anion-exchange וכרומטוגרפיה שלאחר הרחקה מהגודל. הליטוש טיהור על עמודה בעלת הגבלת גודל מוביל לתוצאות טובות, אך-בגלל לדוגמה לאמצעי אחסון מוגבלים בטעינה-הוא גמיש פחות במדרגיות. גישה שונה, שפורסם על ידי נשיקה ואח '20, מתאר טיהור של חלבון מתויג דרך Ni2 + טור אהדה כצעד הטיהור הראשון, ואחריו מחשוף אנזימטי כדי להסיר את התג ועוד שלבי הטיהור. בניגוד למחקרים שנערכו במהלך הלימודים19,20, החלבון המיוצר כפי שמתואר בפרוטוקול זה נקבע לניסויים על תאים חיסוניים. לכן, שארית זיהום אנטוקסין מהתרבות החיידקית היא אתגר. למרות שגישות שונות להסרת שורש הסרת רעלן כבר תוארו עד כה, אין שיטה אחידה הפועלת באותה מידה גם עבור כל פתרון חלבון נתון21,22.
לסיכום, הפרוטוקול שלנו משלב את היתרונות של ביטוי ללא תגית במערכת חיידקית עם הסרת אנטוקסין יעיל ותשואה גבוהה של חלבון טהור.
הערה: עיין בטבלה משלימה 1 להכנת מאגרים ופתרונות מניות.
1. ביטוי חלבון ב E. coli
2. טיהור חלבון
3. איתור והסרה של אנדוטוקסין
4. קשר כימי והפרדת האוליעומר
5. בדיקות פונקציונליות במונולוציטים
בעקבות טיהור מראש בעמודת AIEX (איור 1א-ג) והבאים התלויים בסידן hic (איור 2א, ב), חלבון טהור מאוד הושג (איור 2c). בנוסף, מדידות של אנדוטוקסין חשף הסרת LPS מוצלחת. תוכן ה-LPS שלאחר AIEX נמדד בדילול 1:10 מעל למגבלת זיהוי ה, כלומר, מעל 500 האיחוד האירופי/mL. לאחר הסינון הראשון באמצעות יחידת סינון kDa 50, התוכן LPS הופחת ל-1 EU/mL. בעקבות ריכוז 3 kDa מסנן יחידת סינון נוסף דרך 50 kDa, זיהום LPS נמדד היה 0.08 EU/mL.
כפקד נוסף, מונוציטים האדם היו מגורה עם חלבון מסוג wildtype (איור 3A, B). Polymyxin B טיפול באברושערים משחרר מסוג LPS-מוולוציטים, אשר לא ניתן להבחין עם S100A12. מצד שני, טיפול בחום של LPS ו S100A12 מבטל את יכולת החלבון לגרות את התאים, בעוד זה לא משפיע על התגובה התאית ל-LPS-גירוי.
חשיפת חלבונים ליונים שונים יוצרת הסדר של S100A12 oligomers שונים (איור 4A). הקשר הכימי מאפשר ללכוד מתחמים מוגדרים כגון דימרס, טטרמרס, ו הבוחנים, כמו גם מצבי מעבר (למשל, ' טרימרס ', להקה בערך 30 kDa). על מנת לגרום לשינוי בולט של מאזן האולייומר לפני החיבור, הוחל עודף יונים (איור 4B).
Oligomers מבודדים בריכוזים שווים של הטוחנת (איור 5א-ג) היו לאחר מכן גירוי מונוציט כדי להשוות את היכולות איתות באמצעות Prrs. מונוציט גירוי עם hexameric S100A12 הביא ביטוי tnfα שחרור (איור 6 ). שארית ציטוקינים שחרור ניתן להבחין בין תאים מגורה עם tetrameric S100A12, בעוד הטיפול עם dimeric חלבון אינו לגרום tnfα לשחרר.
איור 1: תוצאות כרומטוגרפיה של אניב-exchange. (א) כרומאטוגרם עם ספיגת ב280 ננומטר (a280) ואחוז מאגר האלוטור B (קו מקווקו). בלוקים של שיטות מצוינים עם A = לשטוף מדגם לא מאוגד, B = מעבר ליניארי עם מאגר משחררי (מאגר B), C = לשטוף עם מאגר B, ו-D = שינוי מחדש במאגר A. (ב) להתמקד בפסגות הרלוונטיות עם מספרים שפופרת שבר באדום. (ג) שברים נבחרים נותחו ב-15% coomassie ויטראז '-עמוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תוצאות כרומטוגרפיה של הידרופובי-אינטראקציה. (א) כרומאטוגרם עם ספיגת ב280 ננומטר (a280) ואחוז מאגר האלוטור B (קו מקווקו). בלוקים של שיטות מצוינים עם A = לשטוף מדגם לא מאוגד, B = הימנעות עם מאגר B, ו-C = מחדש השפה במאגר A. (ב) להתמקד בפסגות הרלוונטיות עם מספרי צינור שבר באדום. (ג) שברים שנותחו ב-15% coomassie המוכתמת-עמוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מונוציטים האדם העיקרי היו מגורה בריכוזים שצוין. LPS (A) או S100A12 (מסוגWildtype B) נותרו ללא טיפול או חום-מודגש (99 ° c, 10 דקות). שני התנאים נבדקו בנוכחות והעדר של polymyxin B. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: חלבון S100A12 היה מקושר עם BS3 לאחר דגירה במאגר hbs המכיל 5 מ"מ Ca2 + והצביעו zn2 + ריכוזים. (א) הגדלת zn2 + ריכוזים לגרום הסדר של S100A12 לתוך הטטרמרים והבוחנים על הפרדה על 4 למעלה 20% COOMASSIE מוכתם sds-עמוד. (ב) כתוצאה מייצוג של oligomers מקושרים עם תנאים המשמשים להפרדה בעמודה החרגה מהגודל. S100A12 היה מקושר בנוכחות של 25 מ"מ Ca2 + (ליין 1) או 25 מ"מ ca2 + ו 1 מ"מ zn2 + (ליין 2). (S100A12) 2 = דיימר; (S100A12) 4 = טטרמר; (S100A12) 6 = החודש . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: S100A12 oligomers הופרדו על עמודה הדרה גודל. (א) כרומואטוגרמה של הפרדת ההקשמר/טטראמר לאחר הקישור במאגר hbs עם 25 מ"מ cacl2 ו 1 מ"מ לאחד2. (ב) כרומטוגרמה עבור הפרדת הטטרמר במאגר hbs עם 25 מ"מ cacl2. (ג) דוגמה לאויגמרים במאגר ומרוכז לאחר הפרדה על מפרידי מערכות הדרגתיות 4-15% SDS-עמוד. ליין 1 = dimer; ליין 2 = טטרמר; ליין 3 = הג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: גירוי של מונוציטים עם S100A12 oligomers מטוהרים. TNFα-שחרור לאחר 4 h דגירה היה כימות על ידי אליסה. הנתונים מציגים את הערך הממוצע משני ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
נפח מיטה (CV) | 75 מ ל |
הצג | ספיגת ב280 nM |
מקסימום לחץ | 3 בר |
מאגר עמודות A | 20 מ"מ Tris-HCl, 1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ EGTA, pH 8.5 |
מאגר עמודות B | 20 מ"מ Tris-HCl, 1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ EGTA, 1 M הנאגל, pH 8.5 |
נפח לדוגמה | שתנה |
קצב זרימה | 1-2 מ ל/דקה |
טמפרטורה | 4 מעלות צלזיוס |
טבלה 1: מידע מפורט על הפרמטרים המוחלים של כרומטוגרפיה של anion-exchange.
חסום | אמצעי אחסון | אגר | שקע |
שיווציה | 1 שני אמצעי אחסון לעמודות (קורות חיים) | קצת | פסולת |
מטען לדוגמה | n/a | קצת | פסולת |
שטוף מדגם לא מאוגד | 1 קורות חיים | קצת | שקע בנפח גבוה |
שינוי הדרגתי – הללויה | 0 כ 100% מאגר B ב 1 קורות חיים | א-ב | אספן שבר |
התרחץ – מאגר B | 1 קורות חיים | B | פסולת |
מחדש באקוויציה | 2 קורות חיים | קצת | פסולת |
טבלה 2: מידע מפורט על השיטה הנמצאת בשימוש של כרומטוגרפיה של anion-exchange.
נפח מיטה (CV) | 125 מ ל |
הצג | ספיגת ב280 nM |
מקסימום לחץ | 4 בר |
מאגר עמודות A | 20 מ"מ טריס, 140 מ"מ הנאקל, 25 מ"מ CaCl2, pH 7.5 |
מאגר עמודות B | 20 מ"מ טריס, 140 מ"מ היום, 50 mM EDTA, pH 7.5 |
נפח לדוגמה | שתנה |
קצב זרימה | 1-2 מ ל/דקה |
טמפרטורה | 4 מעלות צלזיוס |
טבלה 3: מידע מפורט על הפרמטרים המוחלים של כרומטוגרפיה הידרופובי-אינטראקציה.
חסום | אמצעי אחסון | אגר | שקע |
שיווציה | 1 שני אמצעי אחסון לעמודות (קורות חיים) | קצת | פסולת |
מטען לדוגמה | n/a | קצת | פסולת |
שטוף מדגם לא מאוגד | 1-2 קורות חיים | קצת | שקע בנפח גבוה |
אלוציה | 100% מאגר B | B | אספן שבר |
התרחץ – מאגר B | 1 קורות חיים | B | פסולת |
מחדש באקוויציה | 2 קורות חיים | קצת | פסולת |
שולחן 4: מידע מפורט על השיטה המשמשת כרומטוגרפיה לאינטראקציה הידרופובי.
נפח מיטה (CV) | 320 מ ל |
הצג | ספיגה ב280 ננומטר |
מקסימום לחץ | 3 בר |
מאגר עמודות A | 20 מ"מ Hepes, 140 מ"מ הייקל, pH 7.2 |
נפח לדוגמה | עד 13 מל ' |
קצב זרימה | 1-1.5 מ"ל לדקה |
טמפרטורה | 12 עד 15 ° צ' |
טבלה 5: מידע מפורט על הפרמטרים המוחלים של כרומטוגרפיה של אי-הכללה בגודל.
טבלה משלימה 1: הכנת מאגרים ופתרונות מניות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים ביטוי בקטריאלי ללא תג של S100A12 האדם ואת הטיהור שלה, כמו גם הפרדה לתוך שונים המושרה יון oligomers הנגרמת על ידי גירוי תא החיסון. בהשוואה לספרות שפורסמה על טיהור חלבון S100A128,23,24, השימוש גבוה cacl2 (25 מ"מ) ב הידרופובי-אינטראקציה כרומטוגרפיה היא לידע שלנו ייחודי. פרוטוקולים מספר החלת ריכוזים מ 1 עד 5 מ"מ לייצר חלבון טהור, ובכל זאת הבחנו בתשואה גבוהה מספר פעמים בעקבות הגישה שלנו באמצעות ה-25 מ"מ CaCl2 במקום. זה יכול להיות מוסבר על ידי היררכיה של אינטראקציה עם החומר בעמודה: S100A12 יכול לאגד ישירות לחומר העמודה, אך עודף Ca2 + עשוי גם להקל על כריכה עקיפה של S100A12-dimers לחלבון מאוגד העמודה כבר 8. Thus, גבוהה Ca2 + ריכוזים עשויים להגדיל את פני השטח זמין עבור טיהור S100A12. הללויה (באמצעות מעבר ליניארי) של S100A12 מ HIC כאחד מוקדם (כרוך בעקיפין S100A12) ושיא אחד מאוחר מאוד (חלבון מאוגד חומר העמודה) עשוי לתמוך ספקולציות זה (נתונים לא מוצגים).
לייצור של רקומביננטי S100A12 (כמו גם חלבונים אחרים) ב תשואה גבוהה ועלויות לניהול, חלבון ביטוי E. coli הוא עדיין שיטת הבחירה. עם זאת, זיהום בלתי נמנע עם האנדוטוקסינים החיידק נשאר בעיה, כאשר חלבונים נקבעים על ניסויים בתרבות התא, במיוחד במחקרים הכרוכים בתאים חיסוניים מולדים. לניסיוננו, אפילו חלבונים זמינים מסחרית הכריז במפורש עבור שימוש בתרבות התא יכול להכיל אנדוטוקסין זהום עד 1 חלבון EU/μg, אשר ניתן להטות באופן משמעותי. לכן, הסרת רעלים מוחלטת היא חובה. ונומרים אנדוטוקסין בטווח הפתרון מתוך משקולות מולקולריות של 10 עד 20 kda, אבל הם יכולים ליצור מיקרולים ומבנים עם משקולות מולקולרי גבוה יותר. היווצרות מבנים גדולים מאוד הוא, למשל, מקודם דרך יוני ביונטי21,25.
על פי הפרוטוקול שלנו, אנו מאמתים את הייצור האנדוטוקסין ללא הS100A12 חלבון באמצעות שילוב של מדידות אנדוטוקסין ברגישות גבוהה באמצעות גירוי מונואלי. אנו רואים שילוב כזה משמעותי במיוחד כמו a) זיהום אנדוטוקסין ברמה נמוכה עשוי להיות קשה להעריך בהתאם לרגישות של המיקום ו-b) השימוש polymyxin B כמו מעכב LPS על מונוציטים עלול לגרום קשה לפענח נתונים בשל לאפקטי polymyxin B בלעדיים על תאים26,27. Polymyxin B, כמו גם פפטידים אחרים האחרים דיווחו לאגד LPS באמצעות שלילית טעונה שומנים מסוג A28. כמו המשטח חשוף הממס של S100A12 מכיל גם טלאים גדולים שלילית טעונה הפחתת הנצפה של TNFα-שחרור מ-S100A12 מגורה מונוציטים האדם בנוכחות polymyxin B (איור 3B) יכול להיות בשל a) מחייב ישירה לא ספציפי של polymyxin B כדי S100A12 ו/או B) השפעות ישירות של polymyxin b על תאים ממריצים26,27. בשל מגבלות ידועות הן זיהוי של זיהום אנדוטוקסין ברמה נמוכה כמו גם השפעות polymyxin B לא ספציפי, הפרוטוקול שלנו עוד מכיל צעד הפעלה בחום כדי להבדיל בבירור בין LPS-חלבון-תיווך TLR4-איתות.
שימוש ב-LPS-free S100A12 לייצור וטיהור של oligomers המושרה הגדיר היא קריטית ותשומת לב נוספת צריך להיות משולם לטיהור הבאים שלהם כדי למנוע בסופו של דבר הקדמה של אנדוטוקסין דרך מאגרים או חומר העמודה וכך חלבון נוסף בדרישה LPS-דלדול דרך הסרת שרפים אנטוקסין.
הרלוונטיות של oligomerization עבור הפונקציה הביולוגית של חלבונים ניתן להעריך באמצעים שונים. במקרה של S100A12, השתמשנו בתהודה משטח, כמו גם לחילופי חומצות אמינו ממוקדות באתרים כריכת יון ו--להגדיר בדיוק את חלבון מורכב מסוגל לאגד ולאותת דרך TLR4-אנו מועסקים החוצה כימית המקשר של Ca2 +/Zn2 + -פעמו רקומביננטי S100A1216. מעבר כימי של S100A12 בתנאים יוניים שונים snap-קופא מדינה רגעית כולל צורות oligomeric מספר כי הם במעבר. מתוך ניסויי יון טיטור, הגדרתם מצבים שבהם dimeric, tetrameric או הקסאמנרס, ניתן לקבוע כ-oligomers השולט16. בנוסף, ניסויים קודמים הראו כי עודף יונים הוא מועיל עבור המקבילה, מעבר יציב וטיהור לאחר מכן, למרות oligomerization יכול להיגרם גם בריכוזים נמוכים משמעותית של יון. עם זאת, טיהור האויגמרים האלה באמצעות כרומטוגרפיה של הוצאה מהכלל מביא לתוצאה טובה, אך לא הפרדה מוחלטת. ובכל זאת, העשרת האולימרים הסלקטיביים. מאפשרים ניתוח מהימן במורד הזרם
לסיכום, פרוטוקול זה מספק שיטה לטיהור של LPS-free S100A12 אנושי או הקשורים חלבונים כריכת סידן. כדי לתקן שינויים המושרה יון, מרובי כימיים והפרדה מורכבת לאחר מכן על ידי הוצאת גודל כרומטוגרפיה הוא כלי שימושי כדי להבין את הרלוונטיות של oligomerization חלבונים עבור תהליכים ביולוגיים במורד.
. למחברים אין מה לגלות
מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים מתוך תוכנית המחקר הרפואי חדשני של אוניברסיטת Muenster הפקולטה לרפואה (KE121201 ל-ק. ק.) וקרן המחקר הגרמני (DFG, Fo354/3-1 כדי D.F.).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
pET11b vector | Novagen | ||
BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
100x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
Hepes | Carl Roth | 9105 | |
Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
hTNF-alpha - OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
Penicillin/Streptomycin (10.000 U/mL) | Merck | A 2212 | |
Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
Labware | |||
0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
Equipment | |||
37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
NanoPhotometer | Implen | P330 | |
Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
pH meter | Knick | 765 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved