배아 패턴 스케일링 연구를 위한 제 브라 피시 수술 크기 감소

여기서, 우리는 정상적인 발달 과정을 방해 하지 않고 제 브라 피시 배아의 크기를 감소 시키는 방법을 설명 한다. 이 기술을 사용 하면 크기 변경에 대 한 패턴 스케일링 및 개발 견고성을 연구할 수 있습니다.

발달 과정에서, 배아는 자신의 신체 크기에 자신의 신체 패턴을 일치 시키는 현저한 능력을 나타낸다; 그들의 신체 비율은 특정 한계 내에서 더 크거나 작은 배아 에서도 유지 됩니다. 이 스케일링 현상은 한 세기 동안 주목을 받고 있지만, 근본적인 메커니즘을 이해 하는 것은 다양 한 크기의 배아에서 발달 역학에 대 한 정량적 인 설명의 부족으로 인해 제한 되었습니다. 이 한계를 극복 하기 위해, 우리는 생체 내 라이브 이미징에 대 한 큰 이점이 zebrafish 배아의 크기를 감소 시키는 새로운 기술을 개발 했습니다. 우리는 별도의 단계에서 blastula 단계에서 세포와 노 른 자의 균형 잡힌 제거 후, 배아는 신속 하 게 올바른 조건에서 회복 하 고 더 작은 하지만 그렇지 않으면 정상적인 배아로 발전 할 수 있음을 보여줍니다. 이 기술은 특별 한 장비가 필요 하지 않기 때문에 쉽게 적응 할 수 있으며, 형태 적 매개 패터 닝의 견고성을 포함 하 여 광범위 한 스케일링 문제를 연구 하는 데 사용 됩니다.

과학자 들은 배아 크기가 자연 및 실험 조건^1,3에서 크게 다를 수 있지만 태아가 일정 한 신체 비율을 형성 하는 현저한 능력을가지고 있다고 오랫동안 알려져 있다. 이론 및 실험적 연구의 수십 년에도 불구 하 고, 크기 변화에이 견고성, 불리는 스케일링, 그리고 그것의 근본적인 메커니즘은 많은 조직과 기관에서 알 수 없는 남아. 직접 개발 시스템의 역학을 포착 하기 위해, 우리는 생체 내 라이브 이미징⁵에서 큰 이점을가지고 zebrafish⁴에서 재현 가능 하 고 간단한 크기 감소 기술을 확립 했다.

Zebrafish는 발달 생물학을 포함 하 여 생물학의 여러 학문을 연구 하는 동물 모델 척추 동물 역임 했습니다. 특히, 제 브라 피쉬는 생체 내 라이브 이미징 (⁶ ) 때문에 1) 개발이 정상적으로 진행 될 수 있으며 모와 달걀 껍질, 그리고 2) 배아가 투명 하다. 또한, 배아는 일부 온도 및 환경 변동을 견딜 수 있으며,이는 실험실 조건에서 공부 하는 것을 허용 한다. 또한, 모 르 폴 리노와 mRNA 주입^7,8에의 한 종래의 유전자 발현 섭 동에 더하여, 최근 CRISPR/Cas9 기술의 진보는 제 브라 피쉬 고효율⁹에서 역 유전학을 만들었다. 더욱이, 세포 이식 또는 조직 수술과 같은 발생 학의 많은 고전 기술이^4,10,11에 적용 될 수 있다.

원래 크기 감소 기법은 수 륙 양용 및 기타 비 척추 동물 동물¹²에서 개발 되었다. 예를 들어, xenopus laevis에서 또 다른 인기 있는 척추 동물 동물 모델 인 blastula 단계에서 동물-식물성 축을 따라 양분는 크기 감소 배아^12,13을 생산할 수 있다. 그러나, 우리의 손에서이 한 단계 접근은 제 브라 물고기에 있는도 배 화 된 배아를 초래 하 고, 아마도 등 쪽 결정 개미는 불균일 하 게 분포 하 고 하나는 배아의 형태학에서 그들의 현지화를 알 수 없습니다. 여기에서 우리는 일반적으로 개발 하지만 작은 배아를 생산 zebrafish에 대 한 대안 2 단계 베 지 기법을 보여줍니다. 이 기술을 통해 세포는 처음에는 동물 극에서 제거 되 고, 조직자 활동에서 부족 한 순진한 세포의 영역입니다. 노 른 자와 세포의 양을 균형을 유지 하기 위해,이는 상피와 이후의 형태 형성에 중요 한, 노 른 자는 제거. 여기서는이 프로토콜에 대해 상세히 설명 하 고, 패턴 형성에서의 크기 불변의 두 가지 예를 제공 합니다. 솜 사이트 형성 및 복 부 신경 튜브 패터 닝. 정량적 이미징과 결합 하 여 크기 감소 기법을 활용 하 여 진드기와 신경 관의 크기가 감소 된 배아의 크기에 미치는 영향을 조사 했습니다.

모든 어류 관련 절차는 하버드 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 승인을 받아 수행 하였다.

1. 공구 및 시 약 준비

1. 배아를 잘라 와이어 루프를 확인
   1. 직경 40 μ m의 견고 하 고 부식성이 없는 스테인레스 스틸 와이어 20cm를 사용 하십시오. 와이어를 통해 유리 모 세관 (1.0 mm 외경, 0.5 mm 내경, 필 라 멘 트 없음)을 반복 하 여 상단에 작은 루프를 작성 합니다 (루프 길이는 1.0 mm입니다).
   2. 제자리에 고정 하기 위해 와이어 루프 사이의 유리 모 세관의 끝에 명확한 매니큐어의 약간의 방울을 넣어. 건조 시켜 주세요. 배아를 손상 시킬 수 있으므로 루프 부분에 매니큐어를 주지 않도록 하십시오.
   3. 나무 젓가락 (9 "대나무 일회용 젓가락 반으로 깨진)에 루프와 유리 모 세관을 부착 실험실 테이프를 사용 하 여. 유리 모 세관의 약 2.5 cm 정도를 두고 젓가락을 넘어, 도구 젓가락 부분이 물에 담 그 지 않도록 하십시오. 이 길이를 기본 설정으로 조정 합니다.
2. 또는, 유리 바늘을 만들어 배아를 잘라
   1. 손으로 다른 쪽을 잡고 유리 파스퇴르 피 펫의 한쪽 끝을 집게로 핀치 하십시오. 파이 펫의 얇은 부분을 영 램프 또는 분 젠 버너 위에가 열 하십시오.
   2. 유리 피 펫을 손으로 당깁니다. 이상적인 파이 펫은 약 30 μ m의 지름과 완만 한 곡선 (곡률 반경 = 약 5mm)입니다. 적절 한 직경과 곡률은 연습과 약간의 기회와 함께 얻어진 다.
3. 메 틸 셀 룰로 오 스 준비
   1. 메 틸 셀 룰로 오 스는 자르고 있는 동안 배아를 보유 하는데 사용 된다. ⅓ x 링거 용액에 2% 메 틸 셀 룰로 오 스 용액을 만든다 (116 mm 염화 나트륨, 2.9, 1.8 mm cacl 2 및 에틸 piperazineethanesulfonic 7.2 산). 메 틸 셀 룰로 오 스 분말을 ⅓ x 링거 용액에서 밤새 4°c에서 흔들어 주세요.
   2. 선택적으로, 용액을 볼 수 있도록, 적색까지 10 mL 2% 메 틸 셀 룰로 오 스 용액에 ~ 1.5 mL의 페 놀 레드 (0.5% DPBS 원 액)를 첨가 한다. 색이 균일 해질 때까지 흔들어 주세요.

2. 수술 크기 감소를 위한 제 브라 피쉬 배아의 제조

1. 배아 수집
   1. 한 두 개의 수 컷과 하나 또는 두 개의 암컷 제 브라 피쉬를 많은 물로 채워진 결합 챔버에서 배치 하십시오. 플라스틱 분배기를 사용 하 여 남성과 여성을 분리 합니다. Somite 이미징 (섹션 4)과 신경 튜브 이미징에 대 한 신경 관 패터 닝의 형질 전환 리포터 라인 (nkx dbx1b: gfp또는 Olig2)을 위한 AB 라인을 사용 한다. 밤새 챔버에 두십시오.
      참고: 성인의 선택은 수술을 잘 견 뎌 내는 계란을 얻는 데 중요 합니다. 일반적으로, 젊은 건강 한 여성은 건강 한 계란을 생산.
   2. 다음날 아침, 챔버를 얕은 물로 옮겨 놓고 약간의 기울기로 챔버를 놓습니다. 물고기가 짝을 수 있도록 구분선을 제거 합니다.
   3. 차 여과기에 붓고 계란을 수집 합니다. 계란 물이 있는 페 트리 접시에 계란을 전달 (₂₀배 계란 물, 6 g 인스턴트 바다 소금, 1.5 g caso₄ 및 1lh2o; 1x에서 사용). 더 나은 준비를 위해, 산란 직후 계란을 수집 합니다. 배아를 28.5 ° c 인큐베이터에 넣습니다.
   4. 필요한 경우 일반적인 프로토콜^7,8에 따라 1 ~ 4 개의 세포 단계에서 모 폴 리노, mRNA 등을 주사 하십시오. 신경 관 화상 진 찰을 위한 형광 막 상표 (mem-mCherry, mem-mBFP1또는 mCitrine)를 위한 mRNA를 주입 하십시오 (단면도 5).
2. Dechorionate를 사용 하 여
   1. 128-세포 주위에 256-세포 단계, 계란 물이 채워진 35 mm 유리 접시에 건강 한 배아를 전달 하십시오. 접시에서 가능한 한 많은 계란 물을 제거 하십시오.
   2. 20 밀리 그램/mL의 대명사 1 mL를 추가 합니다. 접시를 이동 하 여 배아를 부드럽게 소용돌이 치고, 유리 피 펫을 사용 하 여 dechor이온화를 돕기 위해 용액을 부드럽게 피 펫 합니다.
   3. Chorions가 탄력성을 잃기 시작 하면 (일반적으로 계란과 물의 양에 따라의 대명사를 첨가 한 후 1-4 분), 가능한 한 많은 계란 물을 추가 하 여 프로 네 나를 희석 시킨다. 집게로 chorion을 부드럽게 만져 서 탄력성 손실을 평가 하십시오. chorion은 즉시 다시 튀는 없이 덴트를 보유 해야 합니다. 유리 파이 펫을 사용 하 여 계란 물을 다른 접시에 전달 하십시오 (이 시점에서 대부분의 chorions는 파손 되지 않음).
      1. 또는, 배아를 공기에 노출 시 키 지 않고 계란 물로 채워진 큰 400 mL 유리 비 커에 접시에서 부드럽게 붓 습니다. 그런 다음 배아를 완전히 침전 시킵니다. 배아가 한쪽으로 떨어질 수 있도록 비 커를 기울입니다. 유리 피 펫을 사용 하 여이 배아 들을 모으고 ⅓ x 링거 용액으로 채워진 새로운 35 mm 유리 접시로 옮겨 보세요.
   4. 대부분의 chorions가 탄력성을 완전히 잃을 때까지 몇 분간 기다리십시오. 계란을 부드럽게 피 펫 팅 하 여 배아에서 남은 융 삭을 제거 합니다. 손상 된 배아를 제거 하 고 28.5 ° c 배양 기에서 배아를 배양 한다.

3. 수술 크기 감소 및 회복

1. 깨끗 한 35 mm 유리 접시를 준비 하십시오. 플라스틱 주걱을 사용 하 여 더 큰 요리의 바닥 중앙 근처에 약 0.5 mL의 메 틸 셀 룰로 오 스 (⅓ x 링거 용액에 페 놀 레드를 사용 하 여)를 넓게 펴 주세요. 메 틸 셀 룰로 오 스를 얇고 고르게 약 0.5 mm의 두께로 펴 바릅니다.
2. 약 30 mL의 ⅓ x 링거 용액을 접시의 측면에 붓고 나머지 접시에 펴 넣고 메 틸 셀 룰로 오 스를 덮어 줍니다.
3. 2% 메 틸 셀 룰로 오 스에 256 세포 1k-세포 단계에서 dechorated 배아를 놓습니다. 양쪽에 배아의 방향을 조정 하 여 세포와 노 른 자 모두를 가시화 한다. (그림 1)
4. 와이어 루프 (또는 유리 바늘)를 사용 하 여 동물-식물성 축에 수직으로 절단 하 여 동물 폴 근처의 배 반 덤 으로부터 약 30% ~ 40%의 세포를 잘라 냅니다 (그림 1, 상단 패널). 세포를 제거한 후, 끝을 가볍게 두 드려 나머지 세포가 다시 붙을 수 있도록 돕습니다. 몇 분 안에 배아가 치유 되기 시작할 때 죽은 세포가 벗 겨 야 합니다.
5. 노 른 자를 "자르고" 대신 식물성 극 근처의 노 른 자에 게 작은 상처를 만듭니다 (그림 1 중간 패널). 장착 된 철사로 계란 막을 nicking으로 난 황을 감 겨 냅니다. 노 른 자는 부상 후 몇 분 동안 밖으로 스며 나 고 상처가 치유 됩니다 (그림 1 하단 패널).
6. 노 른 자가 밖으로 나 가지 않는 것을 멈출 때, 동일한 접시에 메 틸 셀 룰로 오 스 외부의 pipet를 사용 하 여 배아를 이동 하 여 더 나은 회복을 가능 하 게 합니다.
7. 모든 배아에 대해 3.4-3.6 단계를 반복 합니다. 배아가 회복 되는 동안에는 접시를 30 분 동안 안정 하 게 두십시오.
8. 배아를 신선한 ⅓ x 링거 용액으로 새 접시에 옮겨 넣고 28.5 ° c 인큐베이터에 넣어 완전히 회복할 수 있도록 하십시오.
   1. 선택적 관심 단계가 초기 somite 단계 인 경우, 배아는 보호막 단계까지 28.5 ° c에서 인큐베이션 된 후 20°c에서 인큐베이션 될 수 있으며, 실험 및 이미징에 대 한 타이밍을 조정 한다.

4. 제 브라 피시 Somitogenesis의 라이브 이미징

1. 달걀 물 100에 1 g의 아가 로스를 첨가 하 고, 아가 로스가 완전히 용 해 될 때까지가 열 하 여 1% 아가 로스 용액 100 ml를 준비 합니다. 5-10 분의 온도를 62-72 ° c로 식혀 주세요.
2. 이미징 용 마운트를 준비 합니다.
   참고: 이 가이드는 반전 와이드 필드 현미경과 함께 사용 하기 위해 개발 되었다.
   1. 100 mm x 15mm 플라스틱 페 트리 디쉬에 15 mL의 1% 아가 로스를 붓 습니다.
   2. 조심 스럽게 등 쪽 마운트 V1 몰드 템플릿⁵ 를 페 트리 디쉬의 바닥에 놓는다. 물에 15 mL 튜브와 같은 무게를 사용 하 여 바닥에 곰 팡이를 유지 합니다.
      참고: 이는 배아가 거꾸로 현미경을 사용 하는 경우 가능한 한 페 트리 디쉬의 바닥에 가깝게 되도록 하기 때문 이다. 배아가 somite 이미징을 위해 횡 방향으로 장착 되어 있지만, 여기 등 쪽 마운트 V1⁵ 는 초기 somite 단계에서 배아를 더 잘 보유 하 고 있기 때문에 사용 됩니다.
   3. 아가 로스가 완전히 응고 될 때까지 식혀 주세요. ~ 30 mL의 달걀 물에 0.01%의 트리 라인을 붓고 집게로 조심 스럽게 벗으 면 서 몰드를 제거 합니다.
3. 솜 사이트 이미징 용 배아 산
   1. ⅓ x 링거 용액 (또는 계란 물)에 1% 낮은 용융 아가 로스를 준비 하 고 42 ° c에서 보관 하십시오. 온도가 42 ° c로 내려 올 때까지 기다리십시오.
   2. 해 부 현미경에서, 잘 당 하나의 배아를 배치 합니다. 피 펫은 약 1 μ l의 저 융 점 아 피 오 스를 잘 미세 하 게 조절 하 여 크기가 달라 지는 개별 배아의 크기, 특히 크기 감소 유무에 상관 없이 잘 크기를 조정 한다.
   3. 배아가 고 화 되기 전에 배아를 신속 하 게 정위 시켜 태아가 접시에 완전히 횡 방향으로 향하도록 한다. 배아를 장착 한 후, 아가 로스 산에 커버 슬립을 부드럽게 배치 하 여 배아를 제자리에 고정 시킵니다. 배 향은 나중 단계에서 명확 하 게 이미지화 될 모든 somite 경계를 위해 정확 하 게 횡 방향으로 거치 되어야 하기 때문에 장기 somite 화상 진 찰을 위해 특히 중요 합니다.
   4. 장착 영역에서 떨어진 곳에서 하위 병합 하 고 25mm x 25mm 커버 글래스를 조작 하 여 몰드에 의해 만들어진 정사각형 들여쓰기의 방향에서 45도 오프셋 되도록 합니다. 각 모서리가 몰드의 다른 면이 될 때까지이 방향으로 몰드를 통해 커버 슬립을 밉니다.
      참고: 이 프로토콜은 도립 현미경에 대 한 것 이지만, 현미경으로 전달 하는 동안 배아가 움직이지 않도록 곰 팡이 위에 커버 글래스를 배치 하는 것이 여전히 중요 하다.
4. 이미징 솜 사이트 형성 과정
   1. Foamcore 보드와 캐비닛 히터로 만들어진 인큐베이터에서 현미경을 28°c로 미리 따뜻하게 합니다.
   2. 장착 된 배아와 함께 페 트리 디쉬를 현미경 단계에 놓는다. 낮은 배율로 아가 로스 산의 상단 왼쪽에 장착 된 배아를 찾은 다음 대물 렌즈를 10 배로 전환 하십시오.
   3. 이미지 수집을 설정 합니다.
      참고: 이 명령은 밝은 필드입니다.
   4. Somite 경계를 명확 하 게 볼 수 있도록 광 량, 노출 시간 및 응축 기에 대 한 조건을 찾으십시오. Z 스택 설정을 사용 하 여 가장 낮은 및 가장 높은 원하는 이미징 평면을 설정 합니다. 총 시간 및 시간 간격을 설정 합니다. 모든 배아의 xy 위치를 찾아 등록 하 여 다중 배아를 한 번에 영상 촬영 할 수 있습니다.
5. 피지를 사용 하 여 PSM과 진드기의 길이를 측정¹⁶.

5. 신경 관 패터 닝의 이미징

1. 달걀 물 100에 1 g의 아가 로스를 첨가 하 고, 아가 로스가 완전히 용 해 될 때까지가 열 하 여 1% 아가 로스 용액 100 ml를 준비 합니다. 5-10 분을 62-72 ° c로 식혀 주세요. 트리 네이를 0.01%로 조정 하십시오.
2. 이미징 용 등 쪽 거치대를 준비 합니다.
   참고: 본 가이드는 직 립 형광 현미경과 함께 사용 하도록 개발 되었습니다. 거꾸로 된 현미경의 경우 커버 슬립 바닥 접시가 필요 하 고 3 단계에서 장착 방향이 뒤집힙니다.
   1. 100 mm x 15mm 플라스틱 페 트리 디쉬에 1% 아가 로스의 15 mL를 붓고 있습니다. 공기 방울을 피하도록 아가 로스 표면에 등 쪽 마운트 V1 몰드를 부드럽게 떠 줍니다. 아가 로스가 완전히 응고 될 때까지 식혀 주세요.
   2. 핀셋 또는 면도날로 몰드를 조심 스럽게 제거 하십시오. 접시에 달걀 물과 함께 0.01% 트리 네를 채우고 사용 될 때까지 덮습니다.
3. 신경 튜브 이미징에 대 한 배아를 마운트합니다.
   1. 형질 전환 또는 주사 된 형광 크기 감소 및 조절 배아는 20-25 somite 단계 (풍부 하 게 함 후 약 18-22 시간)까지 개발 될 수 있다. 형광 막 라벨 (mem-mCherry, mem-mBFP1또는 mCitrine)과 신경 관 패터 닝의 형질 전환 리포터를 발현 하는 배아 (nkx: mem-gfp, dbx1b또는 Olig2)가 사용 됨 이미징.
   2. 준비 된 등 쪽 산에 계란 물 매체를 대체 하는 0.01% 트리 네 스 작업 솔루션. 등 쪽 산의 우물에 이미지 되는 배아에서 부드럽게 피 펫.
   3. 배아를 올바른 방향으로 조작 하 여 헤드가 마운트에서 앞으로 향하게 하 고 꼬리는 등 쪽 부분을 물 표면 쪽으로 향하게 하 여 뒤쪽을 향합니다.
   4. 꼬리를 평평 하 게 눕 히 고 접시 바닥 쪽으로 향하게 하지 않도록 배아의 방향을 잡습니다. 꼬리를 가라앉 고 부주의 하 게 이미징 하는 것을 막기 위해 마운팅의 측면 선반에 꼬리의 뒤쪽 부분을 잘 쉬게 하는 것이 때때로 도움이 됩니다. 각 배아에 대해 반복 합니다. 크기가 감소 된 배아를 사용 하 여 이미지를 만들 우물 깊숙이 떨어지지 않도록 하십시오.
   5. 마운팅 영역에서 멀리 떨어진 부분을 조정 하 고 25mm x 25mm 커버 글래스를 조작 하 여 몰드에 의해 만들어진 정사각형 들여쓰기의 방향에서 45 ° 오프셋 되도록 합니다. 각 모서리가 몰드의 다른 면이 될 때까지이 방향으로 몰드를 통해 커버 슬립을 밉니다.
   6. 커버 유리가 천천히 장착 영역에 떨어질 때까지 서서히 돌립니다. 배아가 올바른 위치와 방향으로 여전히 장착 되어 있는지 확인 하십시오. 커버 글래스의 낙하로 인해 움직임이 너무 많으면 부드럽게 제거 하 고 C 단계에서 장착을 반복 합니다.
4. 개발 척수의 3 차원 이미지.
   1. 거치 된 배아를 포함 하는 접시를 공초점 현미경으로 부드럽게 운반 한다. 장기 라이브 이미징의 경우, 인큐베이션 현미경을 사용 하십시오. 그렇지 않으면, 낮은 온도는 견딜.
   2. 명시 야 조명 아래에서 배아를 이미지로 이동 하 고 선호 하는 전방 후방 위치에서 시야를 중심에 놓습니다. 배아 간의 세부적인 비교를 가능 하 게 하기 위해 각 배아에 대 한이 위치는 일관성이 있어야 합니다.
   3. 이미징 매개 변수를 설정 하 여 이미지화 되는 형광 단백질의 신호를 자극 하 고 포착 합니다. 매개 변수를 눈으로 조정 하 여 초기 샘플에 원하는 이미지를 만들 수 있습니다. 측정 일관성을 사용 하려면 데이터 세트의 모든 배아에 이러한 설정을 적용 합니다. 많은 z 스택이 필요한 경우 속도에 대 한 설정을 최적화 합니다.
   4. Z 스택 설정을 사용 하 여 가장 낮은 및 가장 높은 원하는 이미징 평면을 설정 합니다. Z 스택에서 최적의 이미지 품질을 위해 z 해상도를 조리개 설정에 가장 적합 한 가장 높은 값으로 설정 합니다. 좋은 이미지는 1 μ m z 간격으로 생성 될 수 있습니다.
5. 선호 하는 방법으로 이미징 데이터를 분석 합니다.
   참고: 이 경우 이미지의 신경 부분을 간단 하 게 세분화 하 고 이미징 신호의 정량화를 가능 하 게 하는 사용자 정의 MATLAB 스크립트로 분석이 수행 되었습니다.

노 른 자 부피 감소는 일반적인 형태학을 위해 중요 합니다
최근 알 무에도 카스 티 요 외¹⁷에 기재 된 바와 같이, 배아의 크기 감소는 노 른 자 부피를 감소 시 킴으로써 달성 될 수 있다. 노 른 자 부피 감소와 비교 하기 위해, 우리는 2 단계 장작 패기와 황 반도 (그림 2 와 보조 영화 1)를 모두 수행 했습니다. 2 단계 다진 배아는 발달 단계 전반에 걸쳐 크기 차이를 제외한 대조 군 (dechor이온화만) 배아에 비해 겉보기에 정상적인 전체적인 형태학을 보여 주었다 ( 도 2의 상단 및 중간 패널 참조). 다른 한편으로, blastula만 다진 배아는 특히 초기 단계에서 특이 한 형태를 보였다. 상피 내에서 배아는 수축 하 고 들여쓴 모습 ( 그림 2에서 70%에 대 한 하단 패널 참조). 다음 somite 단계에서 중간 선 구조는 여러 축 수준에서 평면화 (즉, DV 길이가 ML 길이 보다 상대적으로 짧음) 되는 것으로 확인 되었습니다 ( 그림 2의 하단 패널 참조). 나중 단계에서, 중간 및 후 뇌와 같은 노 른 자에 인접 한 신체 구조 및 첫 번째 ~ 10 개의 소 진드기는 상대적으로 큰 노 른 자 로부터 증가 된 장력으로 인해 비교적 평평한 모양을 보였다.

솜 사이트 크기 감소 배아 크기가 감소
진드기는 배아 발생 동안 일시적으로 나타나고 척추와 골격 근을 야기 하는 분절 구조입니다. Presomitic 중 배 엽 (PSM) 로부터, 소 진드기는 주기적인 방법으로 전방에서 후방 방향으로 하나씩 형성 된다 (예를 들어 제 브라 피시, 쥐에 대 한 경우에는25 분) (그림 3a). 우리는 대조 및 잘게 자른 배아 모두에 대 한 솜 사이트 형성의 시간 경과 이미징을 수행 하 고 새로 형성 된 진드기의 크기를 측정 했습니다 (그림 3b). 대조 군과 다진 배아 모두에서, 이후 단계에서 형성 된 소 진드기의 크기는 이전 단계의 것 들에 비해 더 작은 것으로 밝혀졌다. 또한, 솜 사이트 형성 단계 전반에 걸쳐, 다진 배아는 대조 배아에 있는 것 보다 더 작은 소 진드기를 가졌다 (도 3c).

신경 관 높이가 감소 하는 다음 크기 감소
신경 관 크기에 대 한 배아 크기 감소의 효과를 보기 위해, 우리는 mem-mCherry 주입 배아에 대 한 2 단계도 마 기법을 수행 하 고 공초점 이미징 시스템을 사용 하 여 20 hpf에서 척수를 이미지화 했습니다 (그림 4A, B). 이 데이터 세트에서 신경 튜브 높이는 사용자 이미지 분석 코드를 사용 하 여 수동으로 측정 한 후 크기 감소를 12.4% ± 3.2% 감소 시켰습니다 (그림 4C). 이 데이터를 함께 촬영 하면 크기 감소가 신경 튜브 높이를 줄이는 것으로 나타납니다. 이 기술은 신경 패터 닝에 대 한 크기 감소의 효과를 측정 하는 데 사용할 수 있습니다.

그림 1 : 크기 감소 기법. 약 30%-40%의 세포를 동물 극에서 절단 하였다 (상단 패널). 노 른 자를 둘러싼 막이 조심 스럽게 상처를 입 었으 므로 노 른 자 (중간 패널)가 나옵니다. 다음 몇 분 동안, 노 른 자는 두 배 엽과 노 른 자 모두에서 상처를 내 고 난 후 (바닥 패널). 스케일 바 = 200 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 크기 감소의 두 가지 방법 간의 비교. 대조 배아 (상부 패널, 24 hpf 및 30hpf에 대 한 상단 배아) 및 크기 감소 된 배아 (블 라스와 노 른 자, 중간 패널, 24 hpf 및 30hpf에 대 한 중간 배아) 및 크기 감소 배아 (바닥 패널, 하단 배아) (24 hpf 및 30hpf)를 개발 단계에 따라 비교 합니다. Blastula만 다진 배아에서, 배 반 배 볼륨은 노 른 자에 비해 훨씬 작습니다 (70%). 결과적으로, 배아는 솜 사이트 단계에서 불균형 하 게 평탄 화 된 형태를 가진다 (즉, DV 축은 블 라스 볼 라만 다진 배아의 AP 축에 비해 상대적으로 짧아 대조 군 또는 2 단계 다진 것에 비해). 스케일 바 = 200 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : 크기 감소 감소 소 진드기의 길이. (A) 솜 사이트 형성을 개략적으로 나타낸 그림. (B) 시간이 지남에 따라 대조 및 다진 배아의 밝은 전계 이미지. 노란색 화살표는 각 somite 단계에서 가장 새로 형성 된 somite를 나타냅니다. (C) 제어 및 다진 배아 모두에 대해 시간 경과에 따른 솜 사이트 길이 (전방 후부 축에서의 측정). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 : 크기 감소는 신경 관의 높이를 감소 시킵니다. (A-B) 정상 크기 (A)의 이미지 및 크기 감소 (B) tg (ptch2) 배아는 단일 세포 단계에서 mem-mcherry mRNA로 주입 되었다. 스케일 바 = 20 μ m. (C) 신경 관의 높이를 각 z-스택에 있는 신경 관의 수동 분할에서 추출 하였다. 값이 짝이 없는 t 검정을 사용 하 여 비교 되는 경우 평균 신경 높이에서 통계적으로 유의 한 차이가 관찰 됩니다 (p = 0.0397). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 동영상 1:2 단계 장작 패기와 블 라이 단 장작 패기의 비교. 상단 행 = 대조 배아, 중간 행 = 크기 감소 된 배아 2 단계 장작을 사용 하 여, 하단 행 = 크기가 감소 된 배아에만 자르고. 영화는 12 시간 동안 3 분 마다 촬영 되었다. 스케일 바 = 1mm. 이 동영상을 보려면 여기를 클릭 하십시오. (마우스 오른쪽 버튼을 클릭 하 여 다운로드 합니다.)

역사적으로, 척추 동물 동물 들 중에서, 크기 감소는 주로 배아를 수 륙 양용으로 사용 하 여 수행 되었으며, blastula 스테이지 (¹²)에서 동물-식물성 축을 따라 배아를 양분 하였다. 그러나, 우리는 배아를 이등분 때 개구리와 제 브라 피쉬 배아 사이에는 주로 두 가지 차이점이 있습니다. 첫째, 제 브라이 어 배아가 비 대 한 (blastula 단계)의 관용이 되는 단계에서 주최자는 blastula 여백^18,20,²¹의 제한 된 지역에 위치 하 고 있습니다. 배아의 형태에서 주최자의 위치를 알 수 없기 때문에, 무작위로 동물-식물성 축을 따라 배아를 절단 하는 것은도 살자 또는 독 화 된 배아를 생산 합니다. 둘째, 개구리 배아와는 달리, 제 브라 피쉬 배아는 세포에 완전히 둘러싸여 있을 때까지 분리 된 노 른 자 주위의 식물성 극을 향해 세포가 이동 하는 상피에 불리는 과정을 통해 이동 합니다. 배 반 덤의 일부분만 제거 되 면 상대적으로 큰 부피의 노 른 자를 삼 킬 수 있는 세포가 줄어들고 결과적으로 형태학에 영향을 받게 됩니다. 따라서 우리는 2 단계 장작 패기를 사용 하 여 동물 기둥 근처에서 blastulae를 자르고, 주최자의 절단을 피하고 노 른 자 막에 상처를 내 고 난 황 크기를 blastula에 비례 하 게 만듭니다.

2 단계 장작 패기 외에도 수술 후의 배아 회복에 중요 한 크기 감소 수술이 수행 되는 매개체를 발견 했습니다. 우리는 (계란 물, 계란 물 + 알 부 민, Danieau 버퍼, L15 L15 + FBS ⅓ x 링거, 1x 링거)에 대 한 여러 미디어 중에서 높은 생존 율을 산출 한 ⅓ x 링거와 1x 링거만을 시도 했다. 그밖 매체에서, 배아는 상처에서 복구 하는 것을 실패 했습니다.

낮은 생존 율에 대 한 중요 한 문제 해결 팁 건강 하 고 젊은 부모 물고기에서 건강 한 배아를 사용 하는 것입니다. 우리는 비 크기 감소 배아가 거의 100%의 생존 율을 보이는 경우에도, 크기가 감소 하면, 오래 된 어류의 배아는 낮은 생존 율을 보이는 경향이 있다고 지적 했다. 또한, 모 폴 리노 주사와 같은 추가적인 교란과 크기 감소가 결합 되 면 생존 율이 감소 하는 경향이 있음을 유의 하십시오.

여기에 설명 된 크기 감소 기술의 단순성을 통해 연구원은 전문 장비나 집중적인 교육 없이이 기술을 적용할 수 있습니다. 또한, 크기 감소 배아는 개발의 이후 단계까지 더 작게 남아 있기 때문에 (일단 그들이 먹기 시작 하면, 그들의 크기는 대조 물고기를 잡을 것으로 보인다),이 기술은 많은 조직과 장기의 스케일링 연구에 적용 될 수 있다. 따라서,이 기술은 크기 감소 및 정량적 생체 내 라이브 이미징을 결합 하 여 다양 한 시스템의 스케일링 및 크기 제어를 연구할 수 있게 한다.

저자는 경쟁 또는 재정적 이해관계를 선언 하지 않습니다.

이 작품은 일본 과학 기술 기구 (JPMJPR11AA)의 프레스 프로그램 및 건강 보조금 (R01GM107733)의 국가 학회에 의해 지원 되었다.