세균성 성장의 정확한, 높은 처리량 분석

세균성 성장의 양적 평가 시스템 수준 현상으로 미생물 생리학을 이해 하는 데 필수적입니다. 실험적인 조작 및 분석 접근 프로토콜, 세균성 성장, 시스템 생물학의 핵심 주제는의 정확한, 높은 처리량 분석에 대 한 허용 소개.

세균성 성장 시스템 수준에서 세포 역학 조사에서 뿐만 아니라 현대 미생물 생리학의 발달에 중앙 개념 이다. 최근 연구는 세균성 성장 및 게놈 감소와 transcriptome 개편 같은 게놈 넓은 이벤트 사이의 상관 관계를 보고 했다. 올바르게 박테리아의 성장을 분석 유전자 기능 및 세포 구성 성분의 성장-종속 조정 이해 결정적 이다. 따라서, 높은 처리량으로 세균 성장의 정확한 정량적 인 평가 필요 합니다. 신흥 기술 개발 공부 하는 박테리아의 성장을 위해 사용 하는 방법의 업데이트를 허용 하는 새로운 실험 도구를 제공 합니다. 여기 소개 하는 프로토콜 세균성 성장의 재현 하 고 정확한 평가 위해 고도로 최적화 된 실험적인 절차 microplate 리더를 사용 합니다. 이 프로토콜의 성장을 평가 하는 데 사용 되었다 대장균 변종 설명한. 프로토콜의 주요 단계는 다음과 같습니다: 재현할 결과와 높은 처리량 성장 평가 96 잘 접시를 사용 하 여, 두 가지 주요의 수동 계산 반복된 테스트에 대 한 작은 튜브에서 셀 주식의 많은 수의 준비 매개 변수 (즉, 최대 성장 속도 인구 밀도) 성장 역학을 나타내는. 전통적인 식민지 형성 단위 (CFU) 분석 결과, 한 천 배지에서 시간이 지남에 따라 유리 튜브에 교양 있는 셀을 계산, 비교 현재의 방법 보다 효율적 고 성장 변화, 자세한 시간 레코드를 제공 합니다 하지만 엄격한 낮은 인구 밀도에 검색 제한입니다. 요약, 설명된 방법 개념적 결론 또는 이론적 관찰 하도록 이용 될 수 있는 세균 성장의 정확 하 고 재현성 높은 처리량 분석을 위해 유리 하다.

미생물 연구는 종종 세균 세포의 문화, 그리고 세균 생리학^1,2,3의 기본적인 현상을 대표 하는 세균성 성장 곡선의 평가로 시작 합니다. 세균성 문화는 근본적인 방법론 때문에 기본적인 문화 원리 교과서 출판된 연구 문학에 널리 사용할 수 있습니다. 벤치 수준에서 상당한 관심은 전통적으로에 초점을 맞춘 성장 미디어 최적화와 배양 조건, 하지만 성장 속도 제어는 미생물 생리학의 더 큰 이해를 제공할 것입니다 가능성이 되지 않았습니다. 광범위 하 게 공부⁴. 기 하 급수적으로 성장 하는 박테리아, 세포의 주요 매개 변수는 성장률, 게놈, transcriptome와 프로테옴^{5,6,7,8 조정 될 것으로 보고 되었습니다.} . 따라서, 세균성 성장의 양적 평가 미생물 생리학을 이해 결정적 이다.

세균성 성장 평가, 바이오 매스를 추정 하는 데 사용 하는 실험 방법 잘 설립된^9,10 있으며 광 탁 등, 물리적, 생화학 또는 생물 학적 매개 변수의 탐지에 기반. 또한, 성장 변경의 동적 속성을 캡처하는 데 사용 하는 분석 방법 설립된 비선형 모델^11,,1213, 예를 들어 로지스틱 방정식에 일반적으로 근거한 다. 성장 역학 광 탁도 측정 하거나 콜로 니 형성 단위 (CFU) 분석 실험을 수행 하 여 셀 성장 문화에서의 시간된 샘플링에 의해 일반적으로 획득 됩니다. 이러한 배양 및 검출 방법의 한계는 데이터 요소는 없습니다 인구 역학의 진정한 반사 측정 간격 시간에 종종 있기 때문에 때문에 문화 조건 (예를 들어, 온도 변경 및 통 기 통풍) 샘플링 시간에 교란 된다. 문화 및 분석 기술은 최근 개발 기술 및 이해를 사용 하 여 업데이트 해야 합니다. Microplate 리더의 최근 발전 세균 성장의 실시간 관찰을 허용 하 고 노동 비용을 크게 감소. 이러한 고급 장치를 사용 하 여, 세균성 성장에 대 한 최신 연구는 높은 처리량 측정^14,15에 대 한 분석 방법 보고.

이 프로토콜의 목적은 궁극적으로 어떻게 성장 율 결정 되 고 어떤 요인에 영향을 미치는 성장 율의 질문 하는 양적 연구에 대 한 가치가 있을 것입니다 높은 처리 방식으로 정확한 성장 역학을 평가 하는 것입니다. 프로토콜 세균 성장의 반복 가능 하 고 정확한 정량에 대 한 계정으로 이동 해야 하는 모든 요소를 해결 합니다. 실험 방법 및 분석 주요 텍스트에서 자세히 설명 합니다. 이 메서드는 높은 처리량 방법에서 세균 성장의 정확 하 고 재현성 분석을 허용합니다. 미생물학은 그들의 실험적인 증거 추가 양적 결과 파생이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 개념적 결론 또는 성장에 대 한 이론적 개요를 달성 하기 위해 시도 하는 시스템 생물학에서 연구를 위해 사용할 수 있습니다.

1. 성장 매체를 준비

참고: 최소한의 중간 M63의 화학 조성은 다음과 같습니다: 62 m K m ₂ HPO ₄, 39mm KH ₂ 포 ₄, 15 밀리미터 (NH ₄) ₂ 등 ₄, 1.8 µ M FeSO ₄, 15 µ M 티 아민-HCl, 0.2 m m MgSO ₄ 및 22 m m 포도 당. M63 3 재고 솔루션을 혼합 하 여 이루어집니다: 5 X 솔루션, 20% 포도 당 및 MgSO ₄ 티 아민 솔루션. 4 모든 솔루션을 저장 ° C.

1. FeSO ₄ 솔루션을 준비 하는 5 X 솔루션
   1. 준비를 사용 하 여 전기 피 펫, 일회용 혈 청 학적인 피 펫 ddH ₂ O 50 mL 원심 분리기 튜브를 추가. P-200 0.06 mL HCl 0.01 M HCl. 추가 36 mg FeSO ₄-7 H ₂ O를 섞어 잘 추가를 사용 하 여.
   2. 160 mL ddH ₂ O 측정 실린더에 측정 하 고 500 mL 비 커에 추가. 이 순서 대로 다음을 추가: 10.72 g K ₂ HPO ₄, 5.24 g KH ₂ 포 ₄, 2.0 g (NH ₄) ₂ 등 ₄, 그리고 0.5 mL FeSO ₄ 솔루션 (단계 1.1.1에서에서 준비).
   3. 2 분 코를 추가 하 여 7.0에 pH를 조정 하는 정밀 pH 미터를 사용 하 여. 측정 실린더에 솔루션을 붓는 다 고 200 mL의 총 볼륨 ddH ₂ O를 추가 합니다. 250 mL 여과 장치 (PVDF, 0.22 μ M)를 사용 하 여 솔루션을 소독.
2. 준비 20% 포도 당 솔루션
   1. 200 mL ddH ₂ O 측정 실린더에 측정 하 고는 500 mL 비이 커에 부 어. 자력 교 반기를 사용 하 여 혼합 하는 동안 포도 당 50g을 추가 합니다. 250 mL의 총 볼륨 측정 실린더에 솔루션을 희석. 1.1.3 단계에 설명 된 대로 솔루션을 소독.
3. MgSO ₄ 티 아민 솔루션 준비
   1. 500 mL 비 커에 150 mL ddH ₂ O를 추가. 자력으로 혼합 될 때 200 mL의 총 볼륨 측정 실린더에 있는 티 아민-HCl와 MgSO ₄-7 H ₂ o. Dilute 솔루션의 10 g 1.0 g을 추가 합니다. 1.1.3 단계에 설명 된 대로 솔루션을 소독.
4. 최소 중간 M63 준비
   1. 5 X 솔루션, 20% 포도 당 솔루션, MgSO ₄ 티 아민 솔루션, 전자 피 펫, P-200 피 펫 및 깨끗 한 벤치에 200 µ L 피 펫 팁.
   2. 155.8 mL ddH ₂ O 측정 실린더에 측정 하 고 500 mL 비 커에 부 어.
   3. 전자 피 펫, 일회용 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 추가 5 X 솔루션 및 4 mL 20% 포도 당 용액 40 mL 측정된 ddH ₂ o. 그런 다음, 추가 0.2 mL는 P-200 MgSO ₄ 티 아민 솔루션. 1.1.3 단계에 설명 된 대로 솔루션을 소독.

2. 글리세롤 재고 준비

1. 셀 문화
   참고: (예를 들어, W3110 및 그것의 감소 된 게놈) 세균성 긴장 스트레인 은행 조직에서 사용할 수 있습니다. 긴장 한 천 배지에서 식민지의 형태로 일반적으로 얻을 수 있습니다.
   1. 장소 5 소독된 유리 튜브와 실리콘 고무 마 개, 전자 피 펫, P-1,000, 1000 µ L 피 펫 팁, P-200, 200 µ L 피 펫 팁, 클린 벤치에 대상 긴장 (접시에 식민지).
   2. 는 실리콘 고무 마 개를 열기 전에 분 젠 버너 유리 튜브의 입 노출. 튜브 열 후 불꽃에 실리콘 고무 마 개를 노출 하 고 가볍게 유리 튜브에 다시 뚜껑을 배치.
   3. 전자 피 펫, 일회용 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 유리 튜브와 4.5 mL M63 다른 4 개의 튜브 중 하나에 5 mL M63 추가.
   4. P-200 팁을 사용 하 여 식민지를 선택 5 mL M63 포함 된 유리 튜브에 접종을.
   5. 소용돌이 관 정지 수 있도록입니다. 그런 다음 솔루션을 10 배 희석 4.5 mL M63 포함 된 4 개의 튜브 중 하나에이 솔루션의 0.5 mL를 옮겨서.
   6. 는 2.1.5 나머지 튜브에 대 한 단계에서 설명 하는 프로세스를 반복 합니다. 5 다른 농도로 희석 시리즈 (1, 10, 100, 1000, 희석 및 10000) 이제.
   7. 소독 유리 튜브 및 실리콘 고무 stoppers 2.1.2 단계에 설명 된 대로 입. 모자는 stoppers 튜브. 하지 주름 실리콘 고무 마 개에 의해 오염 방지.
   8. 37 ° C에 미리 데워 진된 떨고 인큐베이터에서 5 개의 튜브를 배치 하 고 200 rpm에서 흔들어. 하룻밤 또는 10 ~ 30 헤에 대 한 문화를 품 어
2. 글리세롤 주식에 대 한 문화의 선택
   1. 깨끗 한 벤치에 미리 따뜻하게 실내 온도 M63 매체, P-1,000, 1000 µ L 피 펫 팁, 그리고 일회용 cuvette 장소.
   2. 추가 1000 µ L P-1, 000와 일회용 cuvette에 M63. 분 광 광도 계에 일회용 cuvette, 600의 고정된 파장에서 프로그램을 시작, 및 측정 빈.
   3. 떨고 인큐베이터에서 클린 벤치 5 유리 튜브를 이동.
   4. 삭제 M63 일회용 cuvette에서 1000 µ L 문화 P-1, 000와 같은 일회용 cuvette에 추가. 2.2.2 단계에서 설명한 대로 세포 배양 (OD ₆₀₀)의 광 탁도 측정.
      참고: 모든 오염을 방지 하 고 정확한 측정을 달성 하기 위해 노출 유리 튜브와 같이 불꽃을 소용돌이 샘플링 하기 전에 문화 stoppers. 신뢰할 수 있는 결과 보장 하기 위해, 반복된 측정은 것이 좋습니다, 특히 때 셀 밀도.
   5. 다섯 셀 문화, 초기 지 수 성장 단계에 있는 하나를 선택 (OD ₆₀₀ = 0.01-0.05) 글리세롤 주식.
      참고: 여러 문화 최적의 범위 내에서 밀도, 가장 가까운 0.05에 일반적으로 선택 됩니다.
3. 반복된 테스트에 대 한 글리세롤 주식 확인.
   참고: 10 주식을 준비 하기 위한이 설명 합니다. 실험 요구 사항에 따라 더 크게 또는 더 작은 금액을 만들 수 있습니다.
   1. 소독된 60% 글리세롤 용액 10 1.5 mL microtubes, P-1,000 소독 놓고 P-200, 1000 그리고 200 µ L 피 펫 팁, 그리고는 microtube 깨끗 한 벤치에 서 서.
   2. 추가 250 µ L pipetting에 의해 60% 글리세롤 솔루션 및 1.5 mL microtube 믹스를 선택한 세포 배양의 750 µ L 소독.
      참고: 스톡 볼륨 변수 이지만 항상 셀 문화; 60% 글리세롤의 1:3 비율을 유지 이 결과 15% 글리세롤의 최종 농도.
   3. 는 Microtube 서에서 나머지 9 microtubes 놓고 준비 단계 2.3.2 각 관에서에서 혼합물의 100 µ L를 분배 합니다. 지금 미래 사용을 위해 10 동일한 글리세롤 주식 있다.
   4. 주식-80에서 깊은 냉동 실에 저장 ° c.

3. 성장 곡선 인수

1. microplate 리더 설정.
   참고: (재료의 표 참조) 플레이트 리더에 사용 하는 특정 말 씨는 여기에 사용 된 인용 부호 표시에 표시 된 조건.
2. 오픈 소프트웨어
   입니다. 오픈 " 프로토콜 "에 " 작업 관리자 " 선택 " 새로 만들기 ". 선택 " 표준 프로토콜 ".
   1. 오픈 " 프로시저 ", 설정을 조정 하 고. 오픈 " 설정 온도 ", 선택 하 고 " 인큐베이터에 ". 설정 " 온도 " 37 ° C에 그리고 " 그라데이션 "을 0 ° C. 확인 " 예 열 " 다음 단계를 계속 하기 전에. 오픈 " 운동 시작 ", set " 실행 시간 " 24시: 00 또는 48:00:00, 및 " 간격 " 00시 30분: 00 또는 01시: 00.
      참고: 전체 96 잘 접시 읽을 약 1 분 걸립니다.
   2. 오픈 " 흔들어 " 설정 " 흔들 모드 "으로 " 선형 ". 체크 " Constitution 쉐이크 " 설정 " 주파수 " 567 cpm에서. 오픈 " 읽기 ", 확인 " 흡 광도 ", " 끝점/운동 ", 및 " Monochromators. " 설정 " 파장 " 600.
   3. 클릭 " 유효성 검사 " 절차 올바른지 확인 합니다. 클릭 " 저장 " 미래 사용을 위한 새로운 프로그램으로 그것을 저장 하.
3. 성장의 기록 실시간
   1. 96 잘 접시에 접종된 문화 샘플의 위치를 나타내기 위해 96 잘 접시 그림 (8 × 12 테이블)를 그립니다. 테이블을 출력 하 고 실험에 대 한 참조로 사용.
      참고: 웰 스는 미 판의 가장자리에 있는 포함 빈 매체 증발 때문.
   2. 장소 소독된 96 잘 평면 바닥 microplate와 뚜껑, P-1000, 1000 µ L 피 펫 팁, P-200, 200 µ L 피 펫 팁, 여러 1.5 mL microtubes, 8-멀티 채널 피 펫, 멸 균된 시 저수지, 실내 온도 M63, 글 리세 린 주식 (2.3 단계에서 준비) 깨끗 한 벤치에.
   3. 시 저수지에 M63 약 25 mL를 추가합니다. 이 저수지 주식에 대 한 모든 다음 단계 사용 하 여.
   4. 추가 900 µ L 직렬 희석을 만들기 위한 준비에 microtubes에 M63.
   5. 는 글리세롤 재고 실 온에서 해 동. 900 µ L을 추가 해 동된 글리세롤 주식과 소용돌이에 M63. 그러면 원래 글리세롤 주식의 10 희석.
   6. 다른 microtube M63 및 소용돌이의 900 µ L을 포함 하 게 10 희석의 전송 100 µ L. 그러면 100 희석.
   7. 3.2.6 희석의 원하는 숫자를 얻을 때까지 반복 단계.
   8. 채우기 200 µ L M63 사용 microplate의 가장자리에서 웰 스는 8 개 채널 피 펫 (P-200).
      참고:이 웰 스는 빈으로 사용할 수 있습니다.
   9. 부하 200 µ L 각 샘플 준비 단계-3.2.4 3.2.7 참조 테이블 (단계 3.2.1)에 따르면 미 판 우물을 희석. 소용돌이 희석된 샘플 전에 로드 및 로드 같은 샘플에 여러 우물에 다양 한 접시에 위치.
   10. 플레이트 리더에 96-잘 미 판 배치.
   11. 오픈 " 읽기 지금 "에 " 작업 관리자 " (3.1 단원) 프로그램을 선택 하십시오. 클릭 " 확인 "를 측정 시작. 데이터 분석 (제 4)에 대 한 새로운 실험 파일로 녹음을 저장.

4. 데이터 분석

1. 수출 USB 메모리를 실시간 성장 율 데이터 (3.2 단원)의 결과 텍스트 파일로 스틱.
   참고: 96-잘 포맷 된 결과 (곡선) 실시간으로 플레이트 리더에 표시 됩니다. 시간별 레코드 (OD 값); 테이블로 내보낼 수 있습니다. 행과 열 대표 잘 번호 (예를 들어, A1, B1)과 측정 시간 (예: 00시: 59), 각각.
2. 스프레드시트 소프트웨어와 함께 텍스트 파일을 엽니다.
3. 96 잘 microplate의 시간별 OD ₆₀₀ 읽기 추가 분석에 대 한 새 워크시트에 복사.
4. 빼기 배경에서 읽는 시간 각 샘플의 시간별 읽기에서 제로 잘.
   참고: 편의 위해, 빈의 평균값이 우물 포함 하 M63 (단계 3.2.8) 배경 값으로 사용할 수 있습니다.
5. 최대 인구 밀도 추정을 5 연속 세 ₆₀₀ 읽기의 평균을 계산.
   참고: 5 연속 세 ₆₀₀ 읽기의 가장 큰 평균 값 해당 성장 곡선의 최대 OD ₆₀₀으로 정의 됩니다.
6. OD ₆₀₀의 모든 연속적인 값 쌍에 대 한 다음 방정식을 적용 하 여 성장 율, μ (h ^-1), 계산:
   
   참고:이 수식에서는 C _나 및 C _{i + 1} 어떤 두 연속 시간 포인트 (t _i t _{i + 1}의 OD ₆₀₀ 값을 나타냅니다 각각). LN 자연 로그값을 나타냅니다.
7. 계산 시간별 OD ₆₀₀을 기반으로 시간이 지남에 성장 속도 변화 단계 4.6 따라 읽습니다. 평균 및 최대 성장 율 추정 5 연속 성장률의 표준 편차를 계산.
   참고: 작은 표준 편차와 함께 가장 큰 의미는 해당 성장 곡선의 극대 성장 율으로 정의 됩니다.

5. 96-잘 읽기 (선택 사항)의 글로벌 바이어스 확인

참고: 두 접시 리더 및 소모품 96 잘 접시 한쪽으로 치우친된 측정을 발생할 수 있습니다. 매우 정확 하 고 재현 가능한 양적 결과 얻기 위해 96 잘 접시의 글로벌 바이어스를 확인 것이 좋습니다.

1. 3.2.2 섹션에서 설명한 대로 96 잘 접시 및 플레이트 리더 바이어스 테스트에 대 한 준비.
2. 추가 20 mL M63 소독된 50 mL 원심 분리기 튜브. 같은 원심 분리기 튜브와 소용돌이에 글리세롤 주식을 추가 합니다. 멸 균된 시 저수지에 정지 솔루션 전송.
3. 8 채널 피 펫을 사용 하 여 일시 중단 된 솔루션의 200 µ L 96 잘 접시에 전송.
4. 플레이트 리더에 96 잘 접시를 놓고 측정 시작.
5. 기록 시간별 OD ₆₀₀ 읽어들이고 분석 섹션 4에서에서 설명한 대로. 96-잘 읽기의 locational 바이어스를 결정 하기 위해 각 잘 계산 된 최대 성장 속도 인구 밀도 비교.

설명된 방법 96-잘 형식 리더는 여러 광학 밀도 측정 (일 분)에서 다양 한 시간 간격을 이용 하 여 동적 세균성 성장을 지속, 높은 처리량으로에서 잡으려고 수단을 제공 합니다. 다양 한 유전자를 표현 하는 E. 콜라이 긴장의 구색의 성장 곡선 단일 실험 (그림 1A)에서 정확 하 게 취득 될 수 있다. 설명된 방법에 비해 전통적인 방법 (CFU 분석 결과) 일반적으로 필요 이상 샘플링 시간 간격 (그림 1B) 이며 노동 집약적인 여러 문화 필요한 경우. 또한, 각 문화 샘플링 시간 CFU 분석 결과 대 한 작은 양의 세포 배양을 반복된 측정에 사용할 수 없습니다 사용을 해야 합니다. 또한, 검색 시간 포인트의 제한 된 숫자는 성장 속도 및 최대 OD₆₀₀의 정확한 계산에 필요한 샘플링 포인트를 놓칠 수 있습니다. 그러나, CFU 분석 결과 더 낮은 검출 한계, 10³ -10⁴ 셀/mL, 광 탁도 분석 결과 보다 더 중요 한 적어도 2 개의 크기 순서 만들기 (OD₆₀₀약 10의 검출 한계는 0.001 =⁵ -10⁶ 셀/mL). 설명된 방법 성장 역학에 대 한 시스템 수준 연구에 대 한 실용적이 고 효율적인 실험 도구를 제공합니다.

이 프로토콜의 주요 장점은 걸리는 일반적인 글리세롤 재고에서 반복된 측정입니다. 어떤 날짜 표시줄에서 문화 시간을 결정 하는 연구를 허용 하 고 예측할 수 없는 사건으로 문화를 포화 데 피할 수 있기 때문에 초기 지 수 성장 단계에서 다양 한 희석 속도에서 여러 셀 문화는 데 매우 유용 합니다. 경작 그리고 성장의 매우 비슷한 결과 제시 프로토콜 섹션 2.2 (그림 2A)에 설명 된 대로 다른 희석 비율을 사용 하 여 시작 5 문화 중 하나에서 준비 했다 일반적인 주식의 측정 반복 역학 분석입니다. 여러 성장 곡선 반복 및 독립적인 측정 (N = 6)의 잘 겹쳐 (그림 2B맨 위 패널), 작은 차이 (그림 2B하단 패널), 특히 단계 지 수 ( 와 함께 그림 2B, 그림자 영역). 이 결과 제안 설명된 방법 재현성 높은 결과 제공 합니다.

96-잘 읽기의 글로벌 바이어스 추정이 좋습니다. 현재 메서드에서 글로벌 바이어스 모니터링 야생-타입 대장균 의 성장을 추정 된다 프로토콜 섹션 5에에서 설명 된 대로 W3110 스트레인. 예를 들어 성장 속도 데이터 조작 및 장치 오류에서 파생 된 글로벌 동요를 나타내는 96 웰 스 (그림 3A) 중 중요 한 변화를 보여 성장 곡선에서 계산. 이러한 오류는 접시에 다양 한 위치에서 여러 우물에 동일한 샘플을 로드 하 여 마스크 수 있습니다. 대조적으로, 최대 OD₆₀₀ 나타났다는 결과 대 한 명확한 위치 종속 바이어스 점차적인 변화는, 수직 방향을 따라 관찰 되었다. 즉, 최대 OD₆₀₀ 점차 증가 열 2의 우물에서 그의 열 11 96 잘 접시 (그림 3B). 편향 된 결과 방지 하려면 같은 샘플 반복된 측정을 위한 96 잘 접시의 양쪽에 있는 우물에 로드 되어야 하는 것이 좋습니다. 최대 OD₆₀₀ 값에 locational 바이어스 난방 효율성을 씰링 둘 다에 의해 결정 된다 증발 비율에 있는 변이에서 발생으로 간주 됩니다. 96-잘 microplate 중간 우물과 비교해, 가장자리에 위치한 웰 스 상대적으로 높은 값을 반영 하는 미 판의 씰링 효과에서 유래한 다양 한 증발 속도 보여 경향이 있었다. 또한, 다른 96 잘 microplates 같은 바이어스 테스트를 받게 했다 잘 했다 접시에 위치에 따라 비슷한 방향 변경, 바이어스의 플레이트 리더에 따라 다릅니다 수 있습니다. 따라서, 96-잘 읽기 최대 인구 밀도 결정 하는 연구의 글로벌 바이어스를 평가 하는 것이 중요 하다. 상용 판 독자 모두 그들의 특정 글로벌 바이어스 난방 및 효율성, 그리고 96 잘 microplates 동요로 인 한 효율성을 씰링 하 여 크게 구분 됩니다.

이 방법은 세균 성장의 체계적인 분석을 위한 그리고 그것은 두 가지 주요 매개 변수, 즉, 다양 한 분야, 시스템 생물학, 진화에 일반적으로 적용 되는 성장 속도 셀 밀도 분석을 사용할 수 있습니다 그리고 생태학^16,17. 스프레드시트를 사용 하 여 수동 계산 원시 읽기 생산 성장 속도 셀 밀도의 계산 된 매개 변수 처리를 보여 소개 된다. 시간별 성장률 프로토콜 섹션 4.6 데이터 집합으로 순차 변경의 성장 속도 (그림 4B)에 따르면 성장 곡선 (그림 4A)의 원시 읽기에서 먼저 계산 됩니다. 방법 마다 5 연속 성장률의 표준 편차 순차적으로 취득 (그림 4C-D), 가장 작은 표준 편차와 함께 가장 큰 평균 성장 율 증가의 최대 성장 율으로 정의 됩니다 곡선 (그림 4C-D, 강조). 최대 셀 밀도 (OD₆₀₀) 마찬가지로 분석 (그림 4E-F). 계산 된 성장 속도 셀 밀도 이후에 추가 분석을 복종 된다. 설명된 계산 수 수 자동으로 수행 전산 플랫폼 (프로그래밍 언어)을 사용 하 여 예를 들어, R, Python.

다양 한 방법으로 그림 1 성장 곡선 인수. (A) 성장 곡선의 여러 인수. 성장 곡선의 4 가지 다양 한 유전자를 표현 하는 대장균 변종 높은 처리 방식으로 입수 했다. 대장균 세포는 최소한의 중간 M63에서 성장 했다 그리고 OD₆₀₀ 읽기에서 변경 1-h 간격 microplate 리더에 의해 기록 되었다. 변종 왼쪽에서 오른쪽 있습니다 야생 타입 대장균 W3110 (0 번) 및 그것의 감소 된 게놈 숫자 1, 10, 18 (기술 이전⁵), 각각. (B) 성장 곡선 CFU 분석 결과 사용 하 여. 야생-타입 대장균 세포 (숫자 0) 경작 되었고, 몇 시간 동안 지정 된 시간에 샘플링 된. 성장 변화 CFU 분석 결과 사용 하 여 견적 되었다. 오픈 서클 녹음 또는 샘플링 포인트를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2입니다. 측정을 반복 재현할 수. (A) 다양 한 희석 속도의 숙박 문화s. E. 콜라이 세포에서 1-10,000-fold, 표시 된 대로 다양 한 여러 희석 비율로 튜브에 주사 했다. 셀 약 12 h 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 배양 했다. (왼쪽에서 오른쪽) 5 세포 배양의 마지막 세₆₀₀ 값 1.51, 0.74, 0.05, 0.008, 0.001, 각각 있었다. 0.05 세₆₀₀ 와 문화는 일반적인 글리세롤 주식에 대 한 사용 되었다. (B) 높은 재현성 측량입니다. 6 독립적인 성장 곡선 (최고, 회색 라인) 같은 E. 콜라이 긴장의 취득 하 고는 미 판 및 일반적인 글리세롤의 두 튜브에 6 개의 위치에서 계산 했다. 검은 선 6 성장 곡선의 평균을 나타냅니다. 6 반복된 측정의 편차 (CV)의 계수 계산된 (아래), 그리고 꾸준한 낮은 포인트는 핑크에 그림자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

96 잘 포맷의 그림 3 글로벌 바이어스. 성장 속도의 (A) 열 지도. 대장균 세포 주식 최소 중간 M63에 중단 되었고 미 판 (12 × 8 테이블으로 표시)의 96 웰 스에서 똑같이 로드. OD₆₀₀ 에서 변경 프로토콜의 섹션 5에에서 설명 된 대로 microplate 리더를 사용 하 여 얻은 했다. 빨간색에 흰색에서 그라데이션 0.7에서 0.9 h^-1의 성장 속도 나타냅니다. (B) 최대 OD₆₀₀의 지도 열. 빨간색 흰색에서 그라데이션 1.2 0.9에서 최대 OD₆₀₀ 값을 나타냅니다. 성장 속도 및 최대 OD₆₀₀ 에 대 한 계산에는 그림 4에 설명 된 대로입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

성장 곡선의 그림 4 분석입니다. (A) 성장 곡선의 원시 데이터. 시간별 OD₆₀₀ 읽기 문화 시간에 대해 그려집니다. 오픈 서클 샘플링 시간을 나타냅니다. (B) 측 성장 속도 변화. 두 개의 연속 세₆₀₀ 읽기 사이 시간당 성장률 4.6에서 설명 하는 수식에 따라 계산 됩니다. (C) 성장 율을 의미 합니다. 5 연속 성장률의 평균 주고 부드러운 성장 속도 계산 됩니다. (D) 평균 성장률의 표준 편차. 동일한 5 연속 성장률의 표준 편차를 계산 합니다. 작은 표준 편차와 최대 성장 속도 빨간색으로 강조 표시 됩니다. (E) 세₆₀₀의미. 5 연속 세₆₀₀ 값의 평균 부드러운 OD₆₀₀을 결정 하기 위해 계산 됩니다. (F) 의 표준 편차는 OD₆₀₀ 값을 의미합니다. 같은 5 연속 세₆₀₀ 값의 표준 편차를 계산 합니다. 작은 표준 편차와 최대 OD₆₀₀ 빨간색으로 강조 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

프로토콜에 중요 한 단계는 기 하 급수적으로 성장 하는 세포와 같은 샘플은 microplate에 다양 한 위치에서 여러 우물에서의 복제의 보통주 준비 포함 됩니다. 이전, 미생물학 하룻밤 사전 문화에서 문화를 시작 했다. 이 방법은 세균 성장의 지연 시간을 줄일 수 있습니다, 하는 동안 재현할 수 성장 곡선을 달성 하기 어렵다. 그림 2에서 같이 거의 동일한 성장 곡선, 재현할 수 및 정확한 결과 제공 하는 일반적인 글리세롤 주식을 사용 하 여 독립 측정 결과. 그림 3에서 보듯이 다양 한 위치에서 웰 스는 측정의 글로벌 배경 이라고 여겨진다 약간 다른 읽기에 제공 합니다. 세균성 성장의 양적 평가 대 한이 배경 고려 되어야 한다. 실험적인 복제에 대 한 다양 한 플레이트 위치에 여러 우물을 샘플의 접종이 글로벌 바이어스에 대 한 계정에 좋습니다.

오류를 처리, 뿐만 아니라 수정 및 실험 장치 및 공급에서 파생 된 문제 해결 고려 되어야 한다. 몇 가지 고급 microplate 리더 상업적으로 사용할 수 있습니다. 그들은 특성, 빛 파장, 난방 또는 냉각, 모드를 조정 하는 방법 등 그리고 방법 및 진동의 주파수에 다양 한 변화를 보여줍니다. 우리의 경험을 바탕으로, 증발 해야 해결 되어야 높은 처리량 연구에서 액체 볼륨에서 변경 크게 영향 OD₆₀₀ 읽기 때문에. 증발은 microplate 리더와는 microplates의 건축에서 사용 하는 난방의 방법에 의해 발생 합니다. 일반적으로 상업 microplate 리더에서 구현 하는 난방의 두 가지 모드 따뜻한 공기에 의해가 열 되며 핫 플레이트로 난방. Microplate 리더가이 프로토콜에 사용 되는 매체는 microplate에 신속 하 게 불고 따뜻한 공기 건조 것 때문에 증발을 감소 난방 방법으로 핫 플레이트를 사용. microplates 해야 신중 하 게 선택. (뚜껑)과 다른 96 잘 microplates 증발의 다른 수치가 발생할. 설명된 방법 증발을 감소 시키는 깊은 커버 뚜껑 접시 형식을 사용 합니다.

또한, 연구 고정 위상 분석 성장 곡선의 경우, 다음 방식과 microplate 리더에 떨고의 주파수 취해야 한다 계정으로. 문화 중 떨고 하면 성장 셀 미디어에서 균일 하 게 중단 된다. 부적 절 한 떨고 또는 낮은 주파수 잘 가장자리 주위 또는 높은 밀도, 낮은 또는 높은 실제 읽기 보다 거짓 읽기 결과에 센터 스택 셀을 발생할 수 있습니다. 설명된 방법 사용 하 여 선형, 양방향 떨고입니다. 8 자 모양의 진동 모드 아마 충분 한 동안, 우리 동요의 순환 모드를 권장 하지 않습니다.

이 방법의 주요 한계는 세포 배양 매체의 증발. 최대한 문화 볼륨 작은 이기 때문에, 즉, 200 µ L, 37 ° C에 외피에 상당한 증발을 발생 합니다. 따라서,이 방법은 또한 48 h. 이상 경작을 위해 적당 한, 낮은 밀도의 세포 배양 광학 탐지 (OD₆₀₀)이이 밀도에서 제한 되기 때문에 피해 야 한다. 함께 고려 될 때 아주 느린 성장 세포/긴장 또는 매우 낮은 초기 농도 문화 되지 않습니다, 그들은 더 긴 시간이 필요 하 고 OD₆₀₀의 검출 한계 같습니다.

이 메서드는 매우 유리한 체계적인 설문 조사에 대 한 정확한, 높은 처리량 측정을 생성 합니다. 대표 결과적으로이 방법은 다양 한 게놈 시퀀스 또는 매체 E. 콜라이 긴장의 구색을 쉽게 reproducibly 평가 수⁵. 튜브에 경작 하 고 수동으로 다른 시간 지점에서 샘플 측정의 전통적인 방법에 비교 될 때 더 적은 노동 및 시간 집중 설명된 방법은 이다. 미래의 응용 프로그램 및 개발 방법의 실험적인 조작 및 전산 분석의 자동화를 포함으로 간주 됩니다. 자동 측정 및 로봇 응용은 세포 성장을 평가 하 고 세균성 및 포유류 세포를 사용 하 여 생존 테스트를 수행 하는 매우 효율적이 고 안정적인 방법으로 이어질 것입니다.

고헤이 츠치야는 CFU 분석 결과 예제를 제공 하는 감사 합니다. 이 작품 부분적으로 재정적으로 지원 했다는 선진적인 26506003 과학 연구 (C) 호에 대 한 (BWY)에 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술, 일본에서.

저자는 공개 없다.