Method Article
This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.
Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.
항생제의 발견은 20 세기의 가장 위대한 과학적 업적 중 하나였다. 그러나, 항생제의 사용 및 남용 항생제 내성균의 급속한 발전을 주도하고 있으며, 이들은 지금 21 세기 공중 보건에 심각한 위협. 대부분의 치료 옵션에 대한 내성 균주의 증가는 우리가 항균 약물이 더 이상 1,2 효과적 시대를 입력 할 수있는 가능성을 제기한다.
항생제 내성을 부여 유전 기계 년 3 수백만의 인간과 항생제 선택 압력을 낳은, 고대 시스템입니다. 이러한 플라스미드, 트랜스포존, 게놈 섬, 통합 공역 요소와 integrons 모바일 유전 적 요소, 내 세균 종 4 사이에 모두 항생제 내성 유전자 (ARG)를 배포 할 수 있습니다. 이들 중에서는 integrons 불구 ARG의 확산에 중요한 역할을 해왔다그들은 박테리아 게놈 5에 플라스미드 및 동원 및 삽입 트랜스포존에 의존한다는 사실. Integrons는 integron-인테그라를 이용한 유전자 카세트를 캡처하고 인코딩 integron -6,7- 프로모터 (도 1)를 이용하여 카세트를 표현한다. 유전자 Integron 카세트는 누구의 제품 항생제 나 소독제 (8)에 대한 내성을 부여 할 수 있습니다 단일 오픈 리딩 프레임 (ORF)로 구성된 소형 모바일 요소입니다. 클래스 1 integrons은 가장 일반적으로 그들이 집단적으로 (130) 다른 항생제 내성 유전자 카세트 (9)을 통해 획득 한 임상 분리 5에서 회복 integrons 있습니다.
인간 관련된 공생과 병원성 세균에 클래스 1 integrons의 확산은 이러한 유전 적 요소 (10)의 큰 숫자를 포함하는 인간의 폐기물을 생성합니다. 클래스 1 integrons를 포함 약 10 (19) 박테리아는 하수 슬러지 매년 전을 통해 출시n은 영국 (11). 그것은 항생제 저항을 부여 클래스 1 integrons 지금은 야생 조류, 물고기, 그리고 다른 나라의 야생 동물 12-14의 미생물 검출되고 있다는 것을 따라서 놀라운 일이 아니다. 새로운 유전자 카세트 및 기타 모바일 요소와 복잡한 재 배열의 인수는 특히 하수 처리장 및 기타 수역 15-18에서 계속 발생 이후 다시 환경으로 integrons을 떼면, 중요한 공중 보건 위협. 자연 환경은 새로운 저항의 결정 요인과 기회 병원균 (19, 20)를위한 비옥 한 모집 땅이된다. 소설 integron 함유 세균과 새로운 인수는 오염 된 물과 음식 (21, 22)을 통해 인간 사회에 다시 동그라미를 할 수 있습니다. 환경 감시 인수의 이해와 미래 23 항생제 내성을 관리하는 키 전략이다. 특히,주의 원 먹거나되는 식품에 지불해야한다이러한 새로운 모바일 요소와 병원체의 전송을위한 가장 큰 위협이 있기 때문에 가볍게 요리.
이 프로토콜, 1 integrons 및 식품에 연관된 유전자 카세트, 탐지 식별하고 클래스의 특성에 대한 효율적인 접근 방법 (그림 2) 설명되어 있습니다. 배양 및 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)의 조합을 사용하여, 신속 integrons 복잡한 세균 공동체 및 개별 분리 물에서 검출 될 수있다. 박테리아와 integron 관련 유전자 카세트의 형태와 정체성의 종류를 식별하기위한 방법이 제공됩니다. 방법은 식물과 동물 식품 광범위한 적합하고, 통상적 인 작업 흐름의 예는 이들 식품 유형마다 주어진다.
원시 먹거나 가볍게 조리 식품은 인간의 건강에 가장 관심사이다. 예를 들면 샐러드 야채, 과일, 어패류와 갑각류를 포함한다.
1. 샘플 컬렉션
2. 농축 문화 준비
Integrons 3. 선별 문화
주 : 표준 PCR 프로토콜 효소가 공급 버퍼를 이용하여,이 방법론에 걸쳐 사용하고, 2.5 mm의 최종 농도의 MgCl 2. 필요한 경우, 로렌스 (2011) (24)는이 저널의 이전 문제에 PCR 최적화 및 문제 해결 방법을 설명하고있다.
4. 클래스 1 Integrons을위한 단일 콜로니의 심사
구슬이 25 잔 사용 (5)의 게놈 DNA를 추출 Integron 양성 단일 콜로니
6. 진단의 PCR 및 DNA 시퀀싱
참고 :섹션 5에서 제조 게놈 DNA는 모든 진단의 PCR에 사용되며, 클래스 1 integrons에 대한 양성 반응을 확인합니다.
7. 매핑 및 Integrons 및 카세트 배열의 특성
참고 : 인간이 지배하는 생태계에서 나오는 1 급 integrons은 모든 시료에서 가장 흔한 integrons 될 가능성이 있습니다. 이러한 integrons 모든 최근 단일 기점을 가지며, 따라서 고도로 보존 된 DNA 서열 (5)를 갖는다.
혼합 문화와 intI1에 대한 박테리아 균주의 선별
프라이머 세트 HS463a / HS464 PCR은 클래스 1 integron-인테그라 유전자 intI1 (도 1)의 존재를 검출하는데 사용될 수있다. 이 프라이머 세트는 혼합 된 문화에서 intI1을 검출 잘 작동하고, 또한 확산 판 (그림 2)에서 수확 박테리아 콜로니를 선별하는 데 사용됩니다. 긍정적 인 균주는이 프라이머 세트 (그림 3A)를 사용하여 471 BP에 하나의 강한 밴드를 생성해야합니다. 긍정적 인 균주의 대부분은 인간 또는 농업과 가축에서 유래했다 intI1을 수행한다. 이 균주는 311 bp의 증폭 물 (그림 1)를 생성한다 PCR을 이용하여 프라이머 F165 / R476, 긍정적 인 것입니다. intI1의 환경 소스는 일반적으로이 두 번째 분석에서 긍정적되지 않습니다.
integron 카세트 배열 특성화
순수한 균주의 게놈 DNA를 integron 카세트 배열의 특성에 사용됩니다. 테네시 402 -associated 클래스의 카세트 배열 한 integrons 프라이머 HS458 / HS459를 사용하여 증폭 될 수있다. 이러한 프라이머는 각각 integron 재조합 부위를 타겟팅하고 정상적으로 qacEΔ sul1 융합 유전자 (도 1)에서 종결 카세트 배열의 3 '말단. 상기 분석에서 생성 된 PCR 산물의 크기는 배열 (도 3b)의 개수 및 카세트의 아이덴티티에 따라 변화한다. 환경 클래스 1 integrons 종종 박테리아 염색체에 삽입되어, 그 카세트 어레이는 근위 및 원위 가장 재결합 부위 (도 1)을 대상으로 프라이머에 의해 증폭 될 수있다. 프라이머 MRG284 / 285 카세트 함유량이 다르기 때문에, 증폭 산물의 크기는 다르며, 다시 영역을 증폭하도록 설계된다 (도 3c). HS458 / 459 PCR의 연속순서 MRG284 / 285 PCR 제품은 일반적으로 알 수없는 기능의 폴리 펩타이드를 인코딩 유전자 카세트를 회복하면서 제품은 일반적으로 알려진 항생제 내성 결정을 복구합니다.
세균 종을 식별
박테리아는 16S rDNA 염기 서열 분석 및 데이터베이스 비교를 사용하여 식별됩니다. 게놈 DNA는 작은 소단위 16S rRNA 유전자의 증폭을위한 주형으로 사용된다. 프라이머가 제안하여,이 약 1,450 BP의 증폭 물을 생성한다. 콜로니 다수가 한번에 스크리닝 할 수 있으므로, 계층 적 스크리닝 방법이 사용된다. PCR 증폭 된 16S 제품은 제한 효소 Hinf 1로 분해되며,이 다이제스트는 아가 로스 겔상에서 분리된다. 개별 종은 동일 종의 분리를 용이하게 식별 할 수 있도록 다이제스트 후 독특한 패턴 (도 3d)를 생성한다. 최대 3에서 16S rRNA의 유전자 PCR 제품 시퀀싱어느 한 제한 패턴을 나타내는 것은 integron 긍정적 인 균주의 컬렉션에있는 모든 가능성 종을 효율적으로 식별 할 수 있습니다 분리합니다.
그림 1 급 integrons 1. 구조. 결합 부위의 PCR 프라이머를 보여주는 임상 및 환경 클래스 1 integrons의 개략도는 원고에서 언급. 클래스 1은 integrons 카세트 배열을 형성하기 위해 캡처 및 유전자 카세트의 발현을 촉진 integron-인테그라 유전자 (intI1)로 구성된다. 항생제 사용의 출현 전에 1 종 integrons 대부분 염색체이었고, 그의 기능 아직 결정되지 유전자 카세트를 운반. 항생제 사용을 통해 강력한 선택은 크게 테네시 (402) 트랜스포존과 관련된 클래스 1 integron의 하나의 시퀀스 변형의 풍요 로움을 증가했다.이 '임상'integrons은 항생제 내성을 인코딩 카세트의 배열을 인수했다. 그것은 현재 자연 환경과 식품 생산 체인을 오염 이들 integrons입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
식품의 클래스 1 integrons을 검출 2. 도식 흐름도를 그림. 식품의 샘플 미디어 접종 및 혼합 박테리아 문화를 생성하는 데 사용됩니다. 이 혼합 된 문화 클래스 1 integrons의 존재를 상영하고, 긍정적 인 문화 확산 판을 준비하는 데 사용. 확산 판에서 개별 식민지 integrons에 대한 rescreened된다. 긍정적 인 문화는 추출 된 DNA 자체에 의해 카세트 콘텐츠를 특징으로 정제, DNA입니다quencing. 16S rRNA 유전자의 염기 서열은 종 식별을 위해 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 대표 전기는 심사 과정에서 분석한다. (A)를 intI1가 HS463a / 464 프라이머 사용하여 단일 콜로니를 선별. 긍정적 인 식민지는 471 BP에 강한 하나의 밴드를 생성합니다. 프라이머 HS458 / 459를 사용 테네시 402 integrons로부터 카세트 어레이 (B)의 증폭. 이 PCR 생성물은 변수가 배열 요소 카세트의 ID 및 크기에 따라 크기를 생성한다. 이 카세트의 확인은 DNA 염기 서열을 필요로한다. (C) 1 종 I 환경에서 카세트 배열 증폭프라이머 MRG284 / 285을 사용 ntegrons. 이 PCR은 또한, 가변 제품 ID 및 배열 요소 카세트의 크기에 따라 크기를 생성 환경 어레이는 항생제 내성을 인코딩하기에 어렵다 그러나 카세트. (D) 1 Hinf 소화 16S PCR 제품의 선별. 동일한 제한 패턴이 동일한 종류 일 가능성과 분리합니다. 하나의 제한 형의 다수가 복구하는 경우 다음의 몇 염기 서열을 할 필요가있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PCR | 유전자 대상 | 프라이머 이름 | 방향 | 시퀀스 5 '- 3' | 사이클링 조건 | 참조하지만NCE |
HS463a / HS464 | 클래스 1 Integron | HS464 | 앞으로 | ACATGCGTGTAAATCATCGTCG | 94 ° C의 3 분; 35 사이클 94 ° C 30 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃에서 1 분 30 초; 72 ° C에서 5 분 | 스톡스 등. 2006 년 (28) |
HS463a | 역 | CTGGATTTCGATCACGGCACG | ||||
F27 / r1492 | 16S rRNA의 | F27 | 앞으로 | AGAGTTTGATCMTGGCTCAG | 94 ° C의 3 분; 35 사이클 94 ° C 30 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃에서 1 분 30 초; 72 ° C에서 5 분 | 레인 1991 (29) |
r1492 | 역 | TACGGYTACCTTGTTACGACTT | ||||
intI1F165 / IntI1R476 | 임상 클래스 1 integron | INTI1F165 | 앞으로 | CGAACGAGTGGCGGAGGGTG | 94 ° C의 3 분; 35 사이클 94 ° C 30 초, 55 ℃ 30 초, 72 ℃에서 1 분 30 초; 72 ° C에서 5 분 | 링스 2014 (10) |
intI1R476 | 역 | TACCCGAGAGCTTGGCACCCA | ||||
HS549 / HS550 | 3'CS 임상 Integron | HS549 | 앞으로 | ACTAAGCTTGCCCCTTCCGC | 94 ° C의 3 분; 35 사이클 94 ° C 30 초, 65 ℃ 30 초, 72 ℃에서 1 분 30 초; 72 ° C에서 5 분 | 스톡스 등. 2006 년 (28) |
HS550 | 역 | CTAGGCATGATCTAACCCTCGG | ||||
HS458 / HS459 | 임상 카세트 배열 | HS458 | 앞으로 | GCAAAAAGGCAGCAATTATGAGCC | (94)6, C 3 분; 35 사이클 94 ° C 30 초, 55 ℃ 30 초, 72 ℃에서 1 분 30 초; 72 ° C에서 5 분 | 홈즈 등. 2003 년 (30) |
HS459 | 역 | GTTTGATGTTATGGAGCAGCAACG | ||||
MRG284 / MRG285 | 환경 카세트 | MRG284 | 앞으로 | GTTACGCCGTGGGTCGATG | 94 ° C의 3 분; 35 사이클 94 ° C 30 초, 55 ℃ 30 초, 72 ℃에서 1 분 30 초; 72 ° C에서 5 분 | 링스 등. 2009 년 (21) |
MRG285 | 역 | CCAGAGCAGCCGTAGAGC |
클래스 1 integrons 및 연관된 유전자 카세트를 식별하기 위해 사용되는 표 1 프라이머 서열 및 PCR 조건.
PCR 시약 | 볼륨 (μL) | 제한 다이제스트 시약 | 볼륨 (μL) |
멸균 | 21.5 | 멸균 | (23) |
10 배 GoTaq 화이트 | (25) | 버퍼 (B) | (5) |
RNAseA [1 ㎎ / ㎖] | 0.5 | 소 혈청 알부민 [1 ㎎ / ㎖] | 1 |
정방향 프라이머 [50 μm의] | 0.5 | HinfI [10 단위 / μL] | 1 |
프라이머 역 [50 μm의] | 0.5 | ||
Mastermix 볼륨 | (48) | Mastermix 볼륨 | (30) |
DNA 주형 | (2) | PCR 템플릿 | (20) |
최종 PCR 볼륨 | (50) | 최종 제한 다이제스트 볼륨 | (50) |
표 2. PCR 및 제한 mastermix 성분을 소화.
integrons과 연관된 유전자 카세트의 식별은 잠재적으로 새로운 기회 병원체의 출현을 예측 인간 먹이 사슬에 병원체에 대한 경로를 추적 및 식별하는 새로운 저항에 중요한 단계이며 독성이 8,21,26를 결정. 이 논문의 목적은, 클래스 1 integrons에 대한 샘플을 선별 자신의 카세트 배열을 특성화하고 상주하는 세균의 종을 식별하기위한 효율적인 방법을 설명했다. 프로토콜의 중요한 단계는 좋은 미생물 연습을 포함하고, PCR 오염을 방지하는 오탐 (false positive)을 생성 할 것이라고.
여기에 설명 된 프로토콜을 용이하게 또한 인간 병원체에서 발견되는 클래스 2 및 클래스 3 integrons 포함한 다른 임상 적 integrons을 검출하도록 변경 될 수있다. 또한 물, 바이오 필름, 토양, 퇴적물에서 미생물 군집에 integrons을 감지 수정할 수 있습니다. 일부 limitatio이 있습니다박테리아 세포의 배양에 의존에서 발생이 기술에 NS. 많은 환경은 쉽게 세균 배양 아니며, 여기에 설명 된 프로토콜은 이러한 종을 검출하지 않을 것이다. 회수 종의 범위는 다른 세균 미디어 제형 긴 배양 시간을 사용하여 확장 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 인간의 건강에 대한 관심 종의 대부분은 여기에 설명 된 조건 하에서 성장할 가능성이있다.
이 프로토콜은 선택 배지에 도금 사용하십시오 기술에 비해 몇 가지 장점이있다. 어떤 가정은 회수 특징으로 할 수있는 개별 분리, 새로운 저항성 유전자에 의해 운반 저항 결정의 신원에 대해 할 필요가 없습니다. 보다 일반적인 관점에서, 워크 플로도 4 관심을 가질만한 resistome 27 mobilome의 모든 요소를 검색하도록 구성 될 수있다. 이러한 분석법에 관련된 다양한 DNA 요소의 역학을 이해하는데 중요tibiotic 저항 및 항균 화합물의 감소하고 병기를 보존 중요.
저자는 공개 관련 아무것도 없다.
미카엘라 홀, 라리사 스포 및 기술 지원에 대한 구스타보 타바레스에게 감사드립니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
GoTaq Colourless Mastermix | Promega | M7132 | Used in all PCRs |
RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) | Sigma | R6513-10MG | Used in all PCRs |
HinFI restriction enzyme | Promega | R6201 | Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA |
100 bp ladder | GE Healthcare | 27400701 | Used as a size standard on all agarose gels |
GelRed DNA stain | Biotium | 41003 | CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material |
Guanidinium thiocyanate | Life Technologies | AM9422 | CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material |
CLS-TC Solution | MP Biomedicals | 6540409 | Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction |
Lysing Matrix E FastPrep tubes | MP Biomedicals | 116914500 | Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available. |
Binding matrix | MP Biomedicals | 116540408 | Diluted 1:5 with 6 M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method. |
Fast Prep machine | MP Biomedicals | Number of options available | MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information |
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