클래스 1 Integrons 유전자 카세트 식품을 선별

This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21^st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.

항생제의 발견은 20 ^세기의 가장 위대한 과학적 업적 중 하나였다. 그러나, 항생제의 사용 및 남용 항생제 내성균의 급속한 발전을 주도하고 있으며, 이들은 지금 21 ^세기 공중 보건에 심각한 위협. 대부분의 치료 옵션에 대한 내성 균주의 증가는 우리가 항균 약물이 더 이상 ^1,2 효과적 시대를 입력 할 수있는 가능성을 제기한다.

항생제 내성을 부여 유전 기계 년 ³ 수백만의 인간과 항생제 선택 압력을 낳은, 고대 시스템입니다. 이러한 플라스미드, 트랜스포존, 게놈 섬, 통합 공역 요소와 integrons 모바일 유전 적 요소, 내 세균 종 ⁴ 사이에 모두 항생제 내성 유전자 (ARG)를 배포 할 수 있습니다. 이들 중에서는 integrons 불구 ARG의 확산에 중요한 역할을 해왔다그들은 박테리아 게놈 ^5에 플라스미드 및 동원 및 삽입 트랜스포존에 의존한다는 사실. Integrons는 integron-인테그라를 이용한 유전자 카세트를 캡처하고 인코딩 integron ^-6,7- 프로모터 (도 1)를 이용하여 카세트를 표현한다. 유전자 Integron 카세트는 누구의 제품 항생제 나 소독제 ^(8)에 대한 내성을 부여 할 수 있습니다 단일 오픈 리딩 프레임 (ORF)로 구성된 소형 모바일 요소입니다. 클래스 1 integrons은 가장 일반적으로 그들이 집단적으로 (130) 다른 항생제 내성 유전자 카세트 ^(9)을 통해 획득 한 임상 분리 ^5에서 회복 integrons 있습니다.

인간 관련된 공생과 병원성 세균에 클래스 1 integrons의 확산은 이러한 유전 적 요소 ^(10)의 큰 숫자를 포함하는 인간의 폐기물을 생성합니다. 클래스 1 integrons를 포함 약 10 ⁽¹⁹⁾ 박테리아는 하수 슬러지 매년 전을 통해 출시n은 영국 ^(11). 그것은 항생제 저항을 부여 클래스 1 integrons 지금은 야생 조류, 물고기, 그리고 다른 나라의 야생 동물 ^12-14의 미생물 검출되고 있다는 것을 따라서 놀라운 일이 아니다. 새로운 유전자 카세트 및 기타 모바일 요소와 복잡한 재 배열의 인수는 특히 하수 처리장 및 기타 수역 ^15-18에서 계속 발생 이후 다시 환경으로 integrons을 떼면, 중요한 공중 보건 위협. 자연 환경은 새로운 저항의 결정 요인과 기회 병원균 ^{(19, 20)를위한} 비옥 한 모집 땅이된다. 소설 integron 함유 세균과 새로운 인수는 오염 된 물과 음식 ^{(21, 22)을} 통해 인간 사회에 다시 동그라미를 할 수 있습니다. 환경 감시 인수의 이해와 미래 ²³ 항생제 내성을 관리하는 키 전략이다. 특히,주의 원 먹거나되는 식품에 지불해야한다이러한 새로운 모바일 요소와 병원체의 전송을위한 가장 큰 위협이 있기 때문에 가볍게 요리.

이 프로토콜, 1 integrons 및 식품에 연관된 유전자 카세트, 탐지 식별하고 클래스의 특성에 대한 효율적인 접근 방법 (그림 2) 설명되어 있습니다. 배양 및 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)의 조합을 사용하여, 신속 integrons 복잡한 세균 공동체 및 개별 분리 물에서 검출 될 수있다. 박테리아와 integron 관련 유전자 카세트의 형태와 정체성의 종류를 식별하기위한 방법이 제공됩니다. 방법은 식물과 동물 식품 광범위한 적합하고, 통상적 인 작업 흐름의 예는 이들 식품 유형마다 주어진다.

원시 먹거나 가볍게 조리 식품은 인간의 건강에 가장 관심사이다. 예를 들면 샐러드 야채, 과일, 어패류와 갑각류를 포함한다.

1. 샘플 컬렉션

1. 오염을 최소화 조건에서 샘플을 수집 및 전송시 별도의 청소 가방에 저장된다. 수집되면, 샘플은 4 ℃에서 보관하고 24 시간 이내에 처리해야한다.

2. 농축 문화 준비

1. 과일과 야채 :
   1. 튼튼한 비닐 봉지에 재료의 약 10g을 놓습니다. 큰 재료를 처리하는 경우, 청과물의 피부에 집중한다. 30 초 동안 패들 블렌더에 90 ml의 0.1 M 인산 나트륨 완충액, pH가 7.0 및 프로세스를 추가한다. 패들 믹서를 사용할 수없는 경우, 대안 적으로, 재료는 수동으로 교반 할 수있다.
   2. 이 50 ㎖ 팔콘 튜브에 액체를 수집합니다. 펠렛 박테리아에 7 분 동안 4,000 XG에 원심 분리기 튜브.
   3. 조심스럽게 멸균 루리아 베르 타니 (LB) 배지 30 ml의 펠렛 박테리아를 뜨는을 제거하고 일시 중지합니다.
   4. 37 ° C에서 다른 25 ° C에서 하나의 튜브를 잡고, 통 O / N에 품어. 문화는 분당 200 진동 (OPM)에서 동요한다. 4 ℃에서 보관 배양 될 때까지이 필요합니다.
2. 해산물 :
   1. 멸균 된 핀셋 및 핀셋을 사용하여 위장 (굴) 또는 소화관 (새우)를 해부하고 0.1 M 인산 나트륨 완충액, pH가 7.0의 200 μl를 함유하는 멸균 된 1.5 ㎖의 튜브에 배치했다. 균질를 만들 수있는 샘플을 담가서 부드럽게.
   2. 이 멸균을 5 ml 튜브에 LB 배지 5 mL를 분배하고, 해산물 균질 각각 접종.
   3. 25 ° C와 다른 37 ° C에서 하나의 튜브를 들고, 셰이커 O / N에 품어. 문화는 200 OPM에서 동요한다. 4 ℃에서 보관 배양 될 때까지이 필요합니다.

Integrons 3. 선별 문화

주 : 표준 PCR 프로토콜 효소가 공급 버퍼를 이용하여,이 방법론에 걸쳐 사용하고, 2.5 mm의 최종 농도의 MgCl _2. 필요한 경우, 로렌스 (2011) ^(24)는이 저널의 이전 문제에 PCR 최적화 및 문제 해결 방법을 설명하고있다.

1. 삶은 DNA 준비 :
   1. 멸균 0.5 ㎖의 PCR 튜브에 풍부한 문화의 100 μl를 분배. 수욕 또는 열차 단을 사용하여, 10 분간 99 ° C로 샘플을 가열한다. 2 분 동안 얼음에 진정을 스냅.
   2. 5 분 14,000 XG에 마이크로 원심은 세포 파편 펠렛합니다. 얼음으로 돌아갑니다. DNA 샘플은 요구 될 때까지 -20 ℃에서 냉동 될 수 있지만, 얼음 위에서 해동되어야한다.
2. PCR을 사용하여 클래스 1 integrons 선별 :
   참고 : O / N 배양에서 혼합 문화가 HS463a / HS464 PCR 프로토콜 (표 1)를 사용하여 클래스 1 integrons 상영된다.
   1. 잠재적 SOU에서 멀리, 얼음에 모든 PCR 시약을 녹여DNA를 오염의 경우 RCEs. 음성 대조군 (표 2)를 포함하여, 샘플 당 48 μL의 PCR mastermix을 확인합니다. 배리어 팁을 사용하여, 각각의 튜브에 PCR 마스터 믹스의 48 μl를 분배.
   2. 장벽 팁을 사용하여 개별 PCR 튜브에 해동 DNA의 2 μl를 추가합니다. PCR의 열 순환기에 적절한 프로그램을 실행합니다.
   3. 증폭의 결과를 평가하기 붓고 TBE 완충액 (90 mM 트리스 - 보레이트, 2 mM의 EDTA)에서 실행되는 2 % 아가 로즈 겔상에서 PCR 생성물 7 μl를 electrophorese. 100 bp의 사다리 같은 분자량 마커를 포함한다.
   4. 포스트 DNA 얼룩 겔을 염색하고, UV 트랜스 일루미네이터를 이용하여 시각화. 음성 대조군에서 더 증폭이 없었다 있는지 확인합니다. 특정 샘플에 대한 약 470 BP에 강한 밴드가 혼합 된 문화 클래스 1 integron을 가지고 박테리아가 포함되어 있음을 나타냅니다. 순수한 식민지 이제 긍정적 인 PCR을 반환 된 혼합 된 문화에서 고립 될 것이다.

4. 클래스 1 Integrons을위한 단일 콜로니의 심사

1. 직렬 희석 및 확산 판 :
   주 : PCR 양성 혼합 배양 물로부터 단일 콜로니를 분리는, 혼합 배양 직렬 인산 나트륨 완충액에서 10 배 희석 한 후 단일 콜로니를 복구하기 위해 도금된다.
   1. 0.1M 인산 나트륨 완충액, pH가 7.0 9 ml의 혼합 문화의 한 ML을 추가하고 반전에 의해 혼합. ^10-8의 일련의 희석 될 때까지 인산염 버퍼의 또 9 ml의 희석 1 mL를 넣어 반복하는 것은 도달한다.
   2. 중복, LB 한천 상 ^{10-4 -8} 10 희석액 100 ㎕를 확산. 초기의 혼합 배양에 사용 된 동일 온도에서 플레이트 O / N을 부화. 플레이트는 그러나 그것은 매우 신속하게 단일 콜로니를 처리하는 것이 가장 좋습니다, 필요한 때까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. 단일 콜로니 선택과 삶은 DNA 준비 :
   1. 자체 직렬 희석 판에서 하나의 식민지를 선택이러한 콜로니의 크기, 모양, 색 등의 기준을 사용하여 가능한 한 많은 다른 유형의 콜로니 lecting. 확산 판에서 하나의 식민지를 선택 멸균 이쑤시개를 사용합니다.
   2. 식민지에 이쑤시개를 터치 한 다음 멸균 물 100 μl를 포함하는 PCR 튜브에 전송할 수 있습니다. 콜로니 다수가 상영되어야하는 경우, 콜로니에서 마이크로 타이 터 트레이를 제조 할 수있다. 물에 일부 셀을 제거하는 손가락 사이 이쑤시개 스핀.
   3. 동일한 이쑤시개를 이용하여 콜로니의 연속로 LB 플레이트에 접종. 각 연속 약 1cm 길면 큰 콜로니 번호 표지 플레이트 상에 저장 될 수있다. 당신이 분리의 적절한 수를 선택할 때까지 3 단계 1을 반복합니다.
   4. 초기의 농축 된 배양에 사용 된 것과 동일 온도에서, LB 플레이트 O / N을 부화. 필요한까지 배양 후 4 ℃에서 저장 될 수있다.
   5. 세균 현탁액에서 DNA를 제조, OU 등의 단계를 따릅니다3.1 절에 tlined. 3.2 절에 설명 된대로 순수 배양 용 해물의 심사를 들어, HS463a / HS464 PCR을 수행합니다. 즉 양성 PCR은 게놈 DNA (5 장)의 제조에 사용하고, 또한 분석을 위해 복귀한다 분리합니다.

구슬이 ^{25 잔} 사용 (5)의 게놈 DNA를 추출 Integron 양성 단일 콜로니

1. 4.2 절에 고립 된 순수 문화의 샘플 LB 배지 5 mL를 접종한다. 초기 농축 배양에 사용 된 동일한 온도에서 떨고, O / N을 품어.
2. 펠렛 세포는 7 분 동안 4,000 XG에서, 다음 상층 액을 제거합니다. 용균 매트릭스 E 빨리 준비 튜브에서 1 mL의 CLS-TC 용액 중에 펠렛 세포를 재현 탁. 비드 박동 기계를 사용하여, 30 초 동안 5.5 m / sec의 샘플을 처리합니다.
3. 원심 분리기 5 분 14,000 XG에 튜브 및 멸균 1.5 ML 튜브에 뜨는 70​​0 μl를 복구 할 수 있습니다.
4. 6 M의 구안과 5 : 1로 희석 결합 매트릭스의 700 μl를 추가idinium 티오 시아 네이트는 5 분 동안 실온에서 혼합한다. 1 분, 폐기 뜨는 14,000 XG에 원심 분리기.
5. 펠렛을 완전히 재현 탁 될 때까지 800 ㎕의 염수 세척 에탄올 (70 % 에탄올, 0.1 M 아세트산 나트륨) 및 소용돌이를 추가한다. 1 분 동안 14,000 XG에 실온에서 5 분, 원심 분리기에 대한 세척하고 상층 액을 버린다. 다음 5 분 동안 공기 건조하도록 허용 필요한 경우 마이크로 피펫을 사용하여, 모든 상층 액이 제거 된 확인합니다.
6. 로 pipetting 아래 200 ㎕의 TE (10 mM 트리스 - 염산, 1mM의 EDTA, pH를 7.6)의 펠렛 행렬을 재현 탁. 3 분 동안 실온에서 품어. 3 분 및 멸균 튜브에 전송 용출 된 DNA의 160 μl를 14,000 XG에 원심 분리기. DNA 추출 수율 및 무결성을 확인하는 2 % w / v를 아가 로스 겔에서 게놈 DNA 추출의 분취 량을 실행. 정제 된 게놈 DNA는 -20 ° C에서 저장 및 PCR 시험을 위해 필요할 때 얼음에 해동된다.

6. 진단의 PCR 및 DNA 시퀀싱

참고 :섹션 5에서 제조 게놈 DNA는 모든 진단의 PCR에 사용되며, 클래스 1 integrons에 대한 양성 반응을 확인합니다.

1. 간단히 20 초 동안 14,000 XG에서 DNA 샘플 및 펄스 스핀 와동, 얼음에 게놈 DNA를 녹여. 분리가 471 bp의 증폭 물 (3.2 절)에 대한 긍정적 인 것을 확인한 HS463a / HS464 (표 1)를 사용하여 클래스 1 integron - 인테그라 유전자에 대한 PCR을 반복합니다.
2. 종 양성 문화 수준의 식별 작은 소단위 rRNA 유전자 (16S rDNA 염기)를 분석함으로써 달성된다. 프라이머 F27 / r1492 (표 1)를 사용하여 유전자를 증폭 16S. 전기를 사용하여 PCR 제품을 확인합니다. 모든 박테리아 타겟은 약 1,450 BP의 16S 증폭 물을 생성한다.
3. 시퀀스 16S rRNA 유전자 증폭 물은 종의 신분을 확인하는,하지만 같은 종의 박테리아 수 있습니다 단계 6.2에서 여러 긍정적 인 PCR들을 될 가능성, 이러한 긍정적 많은 있기 때문에, 우리는 먼저저기서 다른 종을 구별한다16S PCR 생성물 g 제한 소화.
   1. 제한 효소 Hinf 1 16S PCR의 분취 다이제스트. 상관 4 BP 절단 부위는 인식 할 것이다 효소하지만 Hinf 1 16S 타겟으로부터 양호한 다이버 시티를 생성하고, 신뢰성, 저렴 효소이다.
4. 30 μL 제한은 멸균 튜브에 mastermix (표 2) 소화되지 않은 purfied 16S PCR 산물 20 μL를 추가 설정합니다. 37 ° C의 물을 욕조의 O / N에 품어. 2 % 아가 로스 겔에 다이제스트를 확인합니다.
5. Hinf 일 소화에 의해 생성 된 패턴 점수. 동일한 16S 제한 프로파일과 균주 같은 종 될 가능성이 높다. 오히려 각 Hinf 1 제한 패턴의 가장 세 대표에 모든 16S PCR 제품, 순서를 시퀀싱보다.
6. 상업용 키트를 사용하여 PCR (16S)의 제품을 정제. 단일 가닥 엑소 뉴 클레아 키트를 사용할 수 있지만, 열 기반 또는 석출 방법도 uninc 제거 잘 작동orporated 프라이머 및 단일 가닥 DNA를. 서열 프라이머 R910 (표 1)를 이용하여 시퀀싱 기능에 의해 지정된대로 반응을 설정 16S 증폭.
7. BLASTN 기능 (함께 NCBI의 DNA 데이터베이스를 심문 얻어진 DNA 서열을 사용 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ). 보다 큰 97 %의 염기 ID는 보통 종의 신분으로한다.

7. 매핑 및 Integrons 및 카세트 배열의 특성

참고 : 인간이 지배하는 생태계에서 나오는 1 급 integrons은 모든 시료에서 가장 흔한 integrons 될 가능성이 있습니다. 이러한 integrons 모든 최근 단일 기점을 가지며, 따라서 고도로 보존 된 DNA 서열 ^(5)를 갖는다.

1. 클래스 사이에 한 사람의 소스에서 나오는 integrons과를 수행하여 환경 시료에서 자연적으로 발생하는 것과 차별화프라이머와 PCR을 intI1F165 / intI1R476 ¹⁰ (표 1)을 설정합니다.
   참고 : 환경 클래스 1 integrons이 제품을 생성하지 않습니다 동안 임상 또는 공생 박테리아에서 1 등급 integrons는 ~ 300 bp의 제품을 생성합니다.
2. 프라이머 세트 HS458 / HS459와 카세트 배열을 증폭하여 임상 integrons을 특성화. 이 PCR은 가장 카세트 배열 intI1 말단과 3 '보존 된 세그먼트 사이의 영역을 증폭한다. 카세트의 번호 및 ID가 가변이기 때문에, PCR 산물의 크기도 달라진다.
3. 증폭 산물을 정제하고 증폭 프라이머를 이용하여 각 DNA 시퀀싱. BLASTN 기능 (사용의 DNA 데이터베이스 심문 시퀀스를 사용 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi을 ).
4. integron 유전자 카세트에 대한 많은 데이터 침착하기 때문에, 표준화 된 명칭 ^(9)에 따라 카세트의 이름을 확인합니다S는 일관성이 없거나 모호한 이름을 사용합니다. 이러한 전달률, 병원성 또는 독성 ^{8,21 증가하는} 유전자를 포함, 새로운 표현형을 인코딩 할 수 있기 때문에, 새로운 유전자 카세트에 특히주의를주십시오.
   참고 : 클래스 1 integron의 전임상 형태는 여전히 자연 환경에 순환. 특히, 활성 테네시 (402) 트랜스포존에 링크 된 것을 가장 관심 ^{(26)의이다.} 이러한 integrons의 카세트 배열 프라이머 세트 HS458 / HS459으로 증폭되지 않지만 카세트 콘텐츠에 종속 변수 크기의 증폭 물을 생성 MRG284 / MRG285 프라이머 세트 (표 1)로 증폭 될 수있다. PCR 제품은 정제 및 7.2에 설명 된대로 DNA는 염기 서열을해야합니다.

혼합 문화와 intI1에 대한 박테리아 균주의 선별

프라이머 세트 HS463a / HS464 PCR은 클래스 1 integron-인테그라 유전자 intI1 (도 1)의 존재를 검출하는데 사용될 수있다. 이 프라이머 세트는 혼합 된 문화에서 intI1을 검출 잘 작동하고, 또한 확산 판 (그림 2)에서 수확 박테리아 콜로니를 선별하는 데 사용됩니다. 긍정적 인 균주는이 프라이머 세트 (그림 3A)를 사용하여 471 BP에 하나의 강한 밴드를 생성해야합니다. 긍정적 인 균주의 대부분은 인간 또는 농업과 가축에서 유래했다 intI1을 수행한다. 이 균주는 311 bp의 증폭 물 (그림 1)를 생성한다 PCR을 이용하여 프라이머 F165 / R476, 긍정적 인 것입니다. intI1의 환경 소스는 일반적으로이 두 번째 분석에서 긍정적되지 않습니다.

integron 카세트 배열 특성화

순수한 균주의 게놈 DNA를 integron 카세트 배열의 특성에 사용됩니다. 테네시 402 -associated 클래스의 카세트 배열 한 integrons 프라이머 HS458 / HS459를 사용하여 증폭 될 수있다. 이러한 프라이머는 각각 integron 재조합 부위를 타겟팅하고 정상적으로 qacEΔ sul1 융합 유전자 (도 1)에서 종결 카세트 배열의 3 '말단. 상기 분석에서 생성 된 PCR 산물의 크기는 배열 (도 3b)의 개수 및 카세트의 아이덴티티에 따라 변화한다. 환경 클래스 1 integrons 종종 박테리아 염색체에 삽입되어, 그 카세트 어레이는 근위 및 원위 가장 재결합 부위 (도 1)을 대상으로 프라이머에 의해 증폭 될 수있다. 프라이머 MRG284 / 285 카세트 함유량이 다르기 때문에, 증폭 산물의 크기는 다르며, 다시 영역을 증폭하도록 설계된다 (도 3c). HS458 / 459 PCR의 연속순서 MRG284 / 285 PCR 제품은 일반적으로 알 수없는 기능의 폴리 펩타이드를 인코딩 유전자 카세트를 회복하면서 제품은 일반적으로 알려진 항생제 내성 결정을 복구합니다.

세균 종을 식별

박테리아는 16S rDNA 염기 서열 분석 및 데이터베이스 비교를 사용하여 식별됩니다. 게놈 DNA는 작은 소단위 16S rRNA 유전자의 증폭을위한 주형으로 사용된다. 프라이머가 제안하여,이 약 1,450 BP의 증폭 물을 생성한다. 콜로니 다수가 한번에 스크리닝 할 수 있으므로, 계층 적 스크리닝 방법이 사용된다. PCR 증폭 된 16S 제품은 제한 효소 Hinf 1로 분해되며,이 다이제스트는 아가 로스 겔상에서 분리된다. 개별 종은 동일 종의 분리를 용이하게 식별 할 수 있도록 다이제스트 후 독특한 패턴 (도 3d)를 생성한다. 최대 3에서 16S rRNA의 유전자 PCR 제품 시퀀싱어느 한 제한 패턴을 나타내는 것은 integron 긍정적 인 균주의 컬렉션에있는 모든 가능성 종을 효율적으로 식별 할 수 있습니다 분리합니다.

그림 1 급 integrons 1. 구조. 결합 부위의 PCR 프라이머를 보여주는 임상 및 환경 클래스 1 integrons의 개략도는 원고에서 언급. 클래스 1은 integrons 카세트 배열을 형성하기 위해 캡처 및 유전자 카세트의 발현을 촉진 integron-인테그라 유전자 (intI1)로 구성된다. 항생제 사용의 출현 전에 1 종 integrons 대부분 염색체이었고, 그의 기능 아직 결정되지 유전자 카세트를 운반. 항생제 사용을 통해 강력한 선택은 크게 테네시 (402) 트랜스포존과 관련된 클래스 1 integron의 하나의 시퀀스 변형의 풍요 로움을 증가했다.이 '임상'integrons은 항생제 내성을 인코딩 카세트의 배열을 인수했다. 그것은 현재 자연 환경과 식품 생산 체인을 오염 이들 integrons입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

식품의 클래스 1 integrons을 검출 2. 도식 흐름도를 그림. 식품의 샘플 미디어 접종 및 혼합 박테리아 문화를 생성하는 데 사용됩니다. 이 혼합 된 문화 클래스 1 integrons의 존재를 상영하고, 긍정적 인 문화 확산 판을 준비하는 데 사용. 확산 판에서 개별 식민지 integrons에 대한 rescreened된다. 긍정적 인 문화는 추출 된 DNA 자체에 의해 카세트 콘텐츠를 특징으로 정제, DNA입니다quencing. 16S rRNA 유전자의 염기 서열은 종 식별을 위해 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. 대표 전기는 심사 과정에서 분석한다. (A)를 intI1가 HS463a / 464 프라이머 사용하여 단일 콜로니를 선별. 긍정적 인 식민지는 471 BP에 강한 하나의 밴드를 생성합니다. 프라이머 HS458 / 459를 사용 테네시 402 integrons로부터 카세트 어레이 (B)의 증폭. 이 PCR 생성물은 변수가 배열 요소 카세트의 ID 및 크기에 따라 크기를 생성한다. 이 카세트의 확인은 DNA 염기 서열을 필요로한다. (C) 1 종 I 환경에서 카세트 배열 증폭프라이머 MRG284 / 285을 사용 ntegrons. 이 PCR은 또한, 가변 제품 ID 및 배열 요소 카세트의 크기에 따라 크기를 생성 환경 어레이는 항생제 내성을 인코딩하기에 어렵다 그러나 카세트. (D) 1 Hinf 소화 16S PCR 제품의 선별. 동일한 제한 패턴이 동일한 종류 일 가능성과 분리합니다. 하나의 제한 형의 다수가 복구하는 경우 다음의 몇 염기 서열을 할 필요가있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

클래스 1 integrons 및 연관된 유전자 카세트를 식별하기 위해 사용되는 표 1 프라이머 서열 및 PCR 조건.

표 2. PCR 및 제한 mastermix 성분을 소화.

integrons과 연관된 유전자 카세트의 식별은 잠재적으로 새로운 기회 병원체의 출현을 예측 인간 먹이 사슬에 병원체에 대한 경로를 추적 및 식별하는 새로운 저항에 중요한 단계이며 독성이 ^8,21,26를 결정. 이 논문의 목적은, 클래스 1 integrons에 대한 샘플을 선별 자신의 카세트 배열을 특성화하고 상주하는 세균의 종을 식별하기위한 효율적인 방법을 설명했다. 프로토콜의 중요한 단계는 좋은 미생물 연습을 포함하고, PCR 오염을 방지하는 오탐 (false positive)을 생성 할 것이라고.

여기에 설명 된 프로토콜을 용이하게 또한 인간 병원체에서 발견되는 클래스 2 및 클래스 3 integrons 포함한 다른 임상 적 integrons을 검출하도록 변경 될 수있다. 또한 물, 바이오 필름, 토양, 퇴적물에서 미생물 군집에 integrons을 감지 수정할 수 있습니다. 일부 limitatio이 있습니다박테리아 세포의 배양에 의존에서 발생이 기술에 NS. 많은 환경은 쉽게 세균 배양 아니며, 여기에 설명 된 프로토콜은 이러한 종을 검출하지 않을 것이다. 회수 종의 범위는 다른 세균 미디어 제형 긴 배양 시간을 사용하여 확장 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 인간의 건강에 대한 관심 종의 대부분은 여기에 설명 된 조건 하에서 성장할 가능성이있다.

이 프로토콜은 선택 배지에 도금 사용하십시오 기술에 비해 몇 가지 장점이있다. 어떤 가정은 회수 특징으로 할 수있는 개별 분리, 새로운 저항성 유전자에 의해 운반 저항 결정의 신원에 대해 할 필요가 없습니다. 보다 일반적인 관점에서, 워크 플로도 ⁴ 관심을 가질만한 resistome ²⁷ mobilome의 모든 요소를 검색하도록 구성 될 수있다. 이러한 분석법에 관련된 다양한 DNA 요​​소의 역학을 이해하는데 중요tibiotic 저항 및 항균 화합물의 감소하고 병기를 보존 중요.

저자는 공개 관련 아무것도 없다.

미카엘라 홀, 라리사 스포 및 기술 지원에 대한 구스타보 타바레스에게 감사드립니다.