食品筛查为1类整合和基因盒

This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21^st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.

抗生素的发现是20 ^世纪最伟大的科学成就之一。然而，抗生素的使用和滥用，导致对抗生素有抗药性的细菌的快速发展，而这些现在在构成21 ^世纪严重威胁到公众健康。细菌耐药株大多数治疗方案的兴起，引起了我们正在进入一个时代，抗菌药物不再有效^1,2的可能性。

赋予抗生素抗性的遗传机制是一个古老的制度，由百万年³早于人类和抗生素的选择压力。移动遗传元件，如质粒，转座子，基因组岛，一体化接合元件和整合子可以传播抗生素抗性基因（ARG）内和细菌物种⁴之间。其中，整合都起到ARG传播的核心作用，尽管事实上，他们依靠质粒和转座子动员和插入到细菌基因组中^5。整合捕获使用整合子整合酶基因盒，然后表达使用整合编码启动子^6,7-（ 图1）盒。 整合基因盒是由单个开放阅读框（ORF），其产品能够赋予对抗生素或消毒剂⁸的小型移动元件。 1类整合是从临床分离^5，在那里他们已经集体过130个不同的抗生素耐药基因盒⁹收购最常用的回收整合。

1类整合传播到人类的相关共生菌和致病菌产生含有大量的这些遗传元件¹⁰的人类废物流。据估计，10 ¹⁹的细菌包含1类整合是通过污水污泥每年我发布n中的英国^11。因此，毫不奇怪，1类整合赋予抗生素抗性现在正在野生鸟类，鱼类和其他野生动物^12-14菌群检测。整合释放回环境构成了显著的公共健康威胁，因为收购新基因盒和复杂的重组与其他移动元素仍然存在，特别是在污水处理厂和其他水体^15-18。自然环境就变成一个招兵的新的阻力因素和条件致病菌^19,20。新型含整合细菌和新的ARG可以绕回到人类社会通过被污染的水和食物^21,22。 ARG游戏环境监测是理解和未来²³管理抗生素耐药性的关键战略。特别是，要注意食品要被生吃或轻熟，因为这些本作的新要素流动和​​病原体传播的最大威胁。

在这个协议中，用于检测，鉴定和表征1类整合并在食品及其相关基因盒一个简化的方法概述（ 图2）。使用的培养和聚合酶链反应（PCR）的组合，整合可迅速在复杂细菌群落和个体分离物检测。方法来识别细菌和整合相关基因盒的构象和身份的物种中给出。该方法适用于范围广泛的植物和动物的食物和典型的工作流程的例子给出了每个这些食物类型。

那些生吃或熟轻食物是最关注的问题对人类的健康。例子包括蔬菜沙拉，水果，贝壳类和甲壳类动物。

1.样品采集

1. 采集样品，最大限度地减少污染条件下，在运输过程中保存在单独的，干净的袋子。一旦收集，样品应当存放在4℃和24小时内处理。

2.富集培养制备

1. 水果和蔬菜:
   1. 放置约10g材料在耐用的塑料袋中。如果在处理较大的材料，集中在水果或蔬菜的皮肤上。添加90毫升0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.0和过程中桨式搅拌器30秒。可替代地，该材料可手动搅动如果桨式搅拌器不可用。
   2. 收集液体倒入两个50毫升猎鹰管。离心管在4000 XG 7分钟沉淀细菌。
   3. 小心取出上清液，在30ml无菌卢里亚BERTANI（LB）肉汤暂停沉淀细菌。
   4. 孵育在振荡器上O / N，保持一个管在25℃，另一个在37℃。文化应在每分钟200振荡（OPM）被动摇。商店培养在4℃下直到需要。
2. 海鲜:
   1. 解剖出胃（牡蛎）或消化道（虾），使用无菌镊子和镊子，并放入无菌的1.5mL管中含有200微升的0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.0。浸渍样品以创建匀浆。
   2. 分配5毫升LB肉汤分成两无菌5毫升管，并与海鲜匀浆接种每个。
   3. 孵育在振荡器上O / N，保持一个管在25℃，而另一个37℃。文化应该在200 OPM动摇。商店培养在4℃下直到需要。

3.筛选的文化整合子

注意:标准PCR方案被用在本方法，使用与酶提供的缓冲区，以及最终的MgCl ₂浓度为2.5mM。如果需要的话，洛伦茨^（2011）24概述了在这个杂志的早期发行的PCR优化和故障排除方法。

1. 煮DNA制备:
   1. 分配100μl的富集培养物进入无菌0.5毫升PCR管。加热样品至99℃下进行10分钟，用水浴或加热块。卡扣冰上冷却2分钟。
   2. 微量在14000×g离心5分钟以沉淀细胞碎片。回到冰。 DNA样品可以在-20℃冷冻直至需要的，但必须在冰上解冻。
2. 筛选使用PCR 1类整合:
   注:从O / N混合培养培养筛选使用HS463a / HS464 PCR协议（ 表1）1类整合。
   1. 解冻所有的PCR试剂在冰上，远离任何潜在SOU污染的DNA的RCE中。弥补48微升的PCR mastermix每个样品，包括阴性对照（ 表2）。免除48微升PCR主混合物中，每管使用障碍的提示。
   2. 加入2微升的DNA解冻使用障碍的提示各PCR管。在PCR热循环仪运行相应的程序。
   3. 为了评估扩增的结果，electrophorese 7微升PCR产物在2％琼脂糖凝胶倾和在TBE缓冲液（90毫摩尔Tris-硼酸，2mM EDTA）中运行。包括分子量标记，如一个100bp的阶梯。
   4. 交的染色用DNA染色的凝胶，和可视化使用UV透照。检查是否有已在阴性对照无扩增。在大约470基点的任何特定样品强大的乐队表明混合培养包含携带1类整合细菌。纯粹的殖民地现在从返回的阳性PCR任何混合培养物中分离。

4。筛选单菌落的1类整合

1. 连续稀释和扩散板:
   注意:为了分离单菌落从PCR阳性混合培养物中，混合培养物连续稀释10倍的磷酸钠缓冲液中，然后镀以回收单菌落。
   1. 加入1毫升混合培养至9毫升0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.0和通过倒置混合。加入1毫升的稀释液，以进一步9毫升磷酸盐缓冲液中，并重复直到10 ^-8系列稀释为止。
   2. 蔓延100微升10 ^-4至10 ^-8稀释到LB琼脂，一式两份。孵育板O / N在用于初始混合培养相同的温度。板然后可被储存在4℃直到需要，但是最好是处理单菌落相当迅速。
2. 单个菌落选择和煮DNA制备:
   1. 从串行稀释板，本身挑单个菌落lecting许多不同菌落类型成为可能，使用的标准，如集落的大小，形状和颜色。使用无菌牙签选择从传播板单菌落。
   2. 触摸牙签的菌落，然后转移到含有100微升无菌水PCR管。如果很大数量的菌落被筛选，然后菌落可以在微量滴定盘制备。旋转的手指之间的牙签撞出一些细胞进入水中。
   3. 使用相同的牙签，接种LB平板与殖民地的连胜。大量菌落可以存储在标记板如果每个条纹为约1厘米长。直到选择分离适当数量的重复步骤1〜3。
   4. 孵育LB平板O / N，在相同的温度与用于初始浓缩培养。培养物然后可被储存在4℃下直到需要。
   5. 对于从菌悬液准备DNA，按照步骤为OUtlined 3.1节。对于纯培养裂解物的筛选，执行HS463a / HS464 PCR在3.2中列出。隔离返回一个正的PCR将用于制备基因组DNA（部分5），以及用于进一步的分析。

5.基因组DNA提取整合子阳性单菌落使用珠击²⁵

1. 接种5毫升LB肉汤与纯培养物中分离的第4.2节的样品。孵育O / N，振荡被用于初始富集培养的相同的温度。
2. 沉淀细胞在4000 XG 7分钟，然后取出上清。悬浮在一个裂解矩阵E快速制备管1毫升CLS-TC解决方案沉淀的细胞。使用珠打浆机，处理该样本以5.5米/秒，30秒。
3. 在14000×g离心5分钟离心管中并回收700微升上清液进入无菌1.5mL管中。
4. 加入700μl稀释1结合矩阵:5用6M关idinium硫氰酸并混合在RT 5分钟。离心机在14000 xg离心1分钟，弃去上清液。
5. 添加800微升盐乙醇洗涤（70％乙醇，0.1M乙酸钠）和涡流直至沉淀完全重悬。在14000×g离心洗5分钟，室温，离心1分钟，弃上清。确保所有上清液已被去除，使用微量如果必要的话，允许风干5分钟。
6. 通过上下吹打悬浮于200μl的TE中（10mM的Tris-HCl，1mM的EDTA，pH7.6）中的小球基质。在室温下孵育3分钟。离心机在14000×g离心3分钟，并转移160微升洗脱的DNA的到无菌管中。运行在2％w / v琼脂糖凝胶的基因组DNA提取的等分试样来检查DNA提取的得率和完整性。将纯化的基因组DNA被储存在-20℃，并需要用于PCR检测时解冻在冰上。

6.诊断的PCR和DNA测序

注意:在第5制备的基因组DNA将被用于所有的诊断的PCR，并以确认阳性测试为1类整合。

1. 冰上解冻基因组DNA，短暂涡旋的DNA样本和脉冲旋在14000 XG为20秒。重复的PCR用HS463a / HS464（ 表1），确认该菌株是积极为471 bp的扩增（3.2节）1类整合子整合酶基因。
2. 阳性培养物，以种的水平鉴定是由小亚基rRNA基因（16S rDNA的）的分析来实现的。使用引物F27 / r1492（ 表1）扩增16S基因。检查采用电泳PCR产物。所有的细菌指标应生成16S扩增大约1450碱基对。
3. 序列的16S rRNA基因的扩增子，以确定物种的身份，但由于有可能是多个正的PCR从步骤6.2，并且许多这些阳性的将是相同的细菌种类，我们将首先区分不同物种全光照在16S PCR产物克酶切。
   1. 消化16S的PCR的等分试样用限制酶的Hinf 1。任何酶识别4 bp的切割位点会做，但1 的Hinf从生成目标16S良好的多样性，是一个可靠的，廉价的酶。
4. 成立了30微升限制性消化mastermix（ 表2）在无菌试管，加入20微升未purfied 16S PCR产物。孵育在37℃水浴O / N。检查消化在2％琼脂糖凝胶。
5. 分数消化图案的Hinf所产生的1。隔离用相同的16S限制信息有可能是相同的物种。而不是每次测序16S PCR产物，序列的Hinf每1限制模式的最三名代表。
6. 纯化使用商业试剂盒的16S PCR产物。单链核酸外切酶试剂盒可用于，但基于列的或沉淀的方法也工作良好以除去unincorporated引物和单链DNA。序列使用引物R910（ 表1），所指定的测序设施建立反应16S扩增子。
7. 使用产生的DNA序列与功能BLASTN（询问NCBI数据库的DNA http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ）。大于97％核苷酸同一性通常取为物种身份。

7.映射和整合子和磁带阵列的表征

注:1类整合来自人类主宰的生态系统所产生很可能是所有样品中最常见的整合。这些整合都具有最新单曲的起源，因此具有高度保守的DNA序列^5。

1. 一类区分1整合来自人力资源和所产生的那些自然发生环境样品中通过执行PCR引物与设置intI1F165 / intI1R476 ^10（ 表1）。
   注:1级临床或共生菌整合将产生约300 bp的产品，而环保类1整合不会产生任何产品。
2. 通过放大盒阵列引物HS458 / HS459表征临床整合。该PCR将扩增intI1和3'保守区段之间的区域中至多暗盒阵列的末端。因为盒的数目和身份是可变的，所述PCR产物的大小也将有所不同。
3. 纯化的扩增子和测​​序使用每个的扩增引物的DNA。使用序列询问使用BLASTN功能（DNA数据库http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ）。
4. 确保盒的命名遵循标准化术语^9，因为许多数据的证词整合基因盒■使用不一致或不明确的名称。特别注意的新基因盒，因为这些可以编码新的表型，包括基因，赋予提高传播能力，致病性或毒性^8,21。
   注:临床前的1类整合形式仍然散发自然的环境。特别是，那些与活性Tn的402转座子最感兴趣^26。这些整合的盒的阵列将不会与引物组HS458 / HS459放大，但可以与MRG284 / MRG285引物组（ 见表1）被放大，产生可变尺寸依赖于盒式内容的扩增子。 PCR产物应纯化和DNA测序为7.2概述。

混合培养物和细菌分离的intI1筛选

引物组HS463a / HS464 PCR可以用来检测类整合-整合酶基因，intI1（ 图1）的存在。这个引物组可以很好地用于在混合培养物检测intI1，并且也用于筛选从扩散板（ 图2）收获的细菌菌落。阳性分离应在471碱基对使用该引物组（ 图3A）产生单一强条带。大多数阳性菌株将携带的，源自人类或他们的农业和家畜intI1。这些菌株也将在一个使用引物F165 / R476，这应该产生一个311 bp的扩增（ 图1）阳性。 intI1的环境来源通常不是在该第二测定阳性。

整合盒阵列的表征

纯菌株的基因组DNA用于整合盒阵列的表征。 Tn的402机相关类的盒式磁带阵列整合子可以用引物HS458 / HS459被放大。这些引物分别靶向整合重组位点，并且所述盒阵列，通常终止于qacEΔsul1基因融合（ 图1）的3'端。 PCR产物在该试验中所产生的尺寸根据所述阵列（ 图3B）的数量和盒的标识而变化。环境1类整合通常嵌入在细菌染色体，和它们的带盒的阵列可以通过靶向近端和最远端的重组位点（ 图1）的引物进行扩增。引物MRG284 / 285号被设计以扩增该区域，并再次，因为带盒内容变化时，扩增子的大小也变化（ 图3C）。 HS458 / 459 PCR测序通常产品将恢复已知的抗生素耐药性的决定因素，而测序MRG284 / 285 PCR产物通常会恢复编码未知功能的多肽基因盒。

确定细菌种类

细菌16S采用rDNA序列和数据库进行比较确定的。基因组DNA被用作用于16S小亚基rRNA基因的扩增模板。使用引建议，这应该产生的约1450 bp的扩增。因为大量的集落可能在任一时刻被筛选，分级筛选方法采用。扩增16S的PCR产物用限制性酶的Hinf 1，并且这些消化产物被分离在琼脂糖凝胶上。个别品种将生成的摘要后鲜明的图案，使得相同物种的菌株可以容易地识别（ 图3D）。从最多三个测序16S rRNA基因的PCR产物隔离较任何一个限制模式可实现高效鉴定的整合阳性菌株的集合所有可能的品种。

图1类整合1.结构，临床和环境1类整合的示意图，显示出PCR引物结合位点的手稿提到。 1类整合包含一个整合，整合酶基因（intI1）催化捕获和基因盒的表达，形成一个盒阵列。使用抗生素出现之前，大多数1类整合都是染色体，并进行基因盒，其功能还有待确定。通过抗生素的使用强大的选择大大增加的1级与Tn的转座子402整合相关的一个序列变异丰富。这些"临床"整合已经获得了编码抗生素抗性盒的阵列。正是这些整合了当前污染自然环境和食品生产链。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2示意图流程图，用于检测1类整合在食品。食品的样品用于接种介质和生成的混合细菌培养物。这些混合的培养物中筛选1类整合的存在下，和阳性培养物用于制备扩散板。从价差板个人菌落再次筛选的整合。积极的文化是纯化，提取DNA和DNA本身的特点录像带内容测序。 16S rRNA基因测序是用于品种鉴定。 请点击此处查看该图的放大版本。

图从筛选过程代表性的电泳分析。（A）用筛选引物intI1 HS463a / 464单菌落。阳性克隆产生强烈的单频段在471基点。 （ 二）从扩增402 Tn的整合利用引物HS458 / 459盒阵列。该PCR产生可变产物大小取决于阵列中的组件盒的身份和大小。这些录像带的鉴定需要DNA测序。 （ 三）从环保类1我扩增盒阵列使用引MRG284 / 285 ntegrons。该PCR还生成变量产品尺寸依赖于身份和阵列中的组件盒的大小，但是纸盒在环境阵列不大可能抗生素抗性编码。 （ 四）16S PCR产物经消化的Hinf 1筛选。株具有相同的限制性模式很可能是相同的物种。如果大量的单一限制类型的被回收，只有少数的这些都需要进行测序。 请点击此处查看该图的放大版本。

用于识别第1类整合子及其相关的基因盒表1引物序列和PCR条件。

表2. PCR和限制性消化mastermix成分 。

整合及其相关基因盒的识别可能是在预测的新机会病原体的出现，跟踪途径病原体进入人类食物链，并确定新的抗性的关键步骤和毒力决定^8,21,26。本文的目的是描述筛选样品1类整合，其特征阵列盒，并确定其所在的细菌种类精简的办法。在协议中的关键步骤涉及微生物好做法，并防止污染的PCR将产生误报。

这里所描述的协议可以很容易地修改，以检测其他临床相关整合，包括级别2和级别3整合，它们也存在于人类病原体。它也可以被修改，以检测在选自水，生物膜，土壤或沉积物的微生物群落整合。有一些limitations到这种技术，从细菌细胞的培养的依赖而出现。许多环境细菌不容易可培养，并在这里描述的方案将不检测这些物种。被回收的物种的范围可以通过使用不同的细菌培养基配方和更长的温育时间进行扩展。尽管如此，大多数对人体健康利益的物种很可能在这里所述的条件下生长。

该协议具有一定的优势超过了使用镀选择性介质技术。没有假设需要进行关于由个体分离物，以及新的抗性基因进行抗性决定因素的同一性可以被回收和表征。在更一般的术语中，工作流还可以适于检测resistome ²⁷或mobilome可能会感兴趣⁴中的任何元素。此类测定法是重要的理解中涉及的各种DNA元件的动态tibiotic阻力以及节省抗微生物化合物的减少的军火库的关键。

作者必须披露相关一无所获。

感谢麦克拉厅，拉里萨Bispo的古斯塔沃和塔瓦雷斯的技术援助。