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Toxoplasma gondii는 조직 문화 모델 했었 수있는 환경 스트레스에 대한 응답으로 낭종 형태로 변환됩니다. 이 동영상은 골수 파생 macrophages 뼈를 활성화하거나 fibroblast 세포 성장 매체 산도를 변경하여 낭종 벽 형성을 검토하기 위해 기술을 보여줍니다.
Toxoplasma gondii는 온혈 동물의 nucleated 세포에 침입할 수있는 의무 세포내 기생충이다. 감염 동안, T. 빠른 복제 양식이 tachyzoite 전화로 gondii는 disseminates. Tachyzoites 잘 묘사되지 않은 신호 처리에 의해 bradyzoite라는 느린 성장 encysted 형식으로 변환합니다. 동물 내에서 bradyzoite의 cysts는 중추 신경계와 근육 조직에서 발견하고 감염의 만성 단계를 대표하고 있습니다. bradyzoites 전환은 높은 산도, 또는 인터페론 감마 (IFNγ)의 추가로 매체를 사용하여 CO 2 기아의 조직 문화에 시뮬레이션 할 수 있습니다. Bradyzoites는 렉틴가 Dolichos biflorus agglutinin (DBA)가 바인딩에 낭종 벽의 존재에 의해 특징입니다. 찬란 분류 DBA는 낮은 CO 2와 높은 산도 매체에 노출되었습니다 인간의 포피의 섬유아 세포 (HFFs) 재배 기생충에있는 낭종 벽을 시각화하는 데 사용됩니다. 마찬가지로, 기생충은 BMMs가 IFNγ와 lipopolysaccharide (LPS)로 활성화한 후 골수 파생 macrophages (BMMs)가 DBA에 의해 감지 낭종 벽을 표시 murine 뼈에 거주. 이 프로토콜은 T.의 전환을 유도하는 방법을 보여줍니다 것입니다 BMMs의 낮은 CO 2 및 활성화와 높은 산도 성장 매체를 사용하여 bradyzoites하는 gondii. 호스트 세포는 coverslips에 대한 교양 tachyzoites와 감염 중 IFNγ와 LPS (BMMs)를 추가로 활성이나 사흘 동안 높은 산도 성장 매체 (HFFs)에 노출됩니다. 감염 완료되면, 호스트 세포는 고정 permeabilized 및 차단됩니다. 낭종 벽은 형광 현미경과 rhodamine의 DBA를 사용하여 시각 것입니다.
1. 인간의 포피의 섬유아 세포 (HFF) 코팅 coverslips의 준비
2. BMC 개발 L929 에어컨 매체 (CM)를 준비
3. 골수 및 BMCs의 세포 배양의 분리
4. T.과 감염 세포 gondii
5. T.을 시작 환경 스트레스에 의해 gondii bradyzoite 개발
6. Immunofluorescence 검출
7. 대표 결과
그림 1은 T.의 대표적인 DBA의 염색법을 보여줍니다 산도 응력 하에서 활성화 BMMs과 HFFs에 gondii. 기생충 주변 모두보기 DBA의 얼룩은 낭종 벽 구성 요소의 존재를 나타내는 vacuoles을 포함. 활성화 BMM 이미지는 공포의 표면과 일치 DBA 염색법을 보여줍니다. T.의 단면 gondii는 산도에 HFFs은 스테인드없이 내부 구조와 낭종 벽을 보여줍니다 강조했다.
그림 1. 스트레스 T.의 DBA 염색법 스트레스 조건, 활성화 BMMs이나 산도에 따라 gondii. 세포내 기생충, HFFs 강조 rhodamine 복합 DBA (적색)와 스테인드되었습니다. 차동 간섭 대비 (DIC)은 낭종의 개요를 보여줍 검은 스케일 바는 2 μm의 같습니다.
동물 실험
동물 실험 위스콘신 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
T.의 bradyzoite 개발의 메커니즘은 완전히 이해되지 않지만, 분자 유전 분석 조직 문화 gondii 단계 변환 bradyzoite의 낭종 형성 2,3,4에 관련된 유전자의 발견되었다. 분석은 또한 일부 bradyzoite 마커가 활성화 macrophages 5,6 성장 등 다른 장기 응력 조건에서 표현되는 관찰되었다. 위의 방법은 T. 성장하는 방법을 설명합니다 gondii와 유도 발전 BMCs과 HFFs 모두에서 DBA 양성 낭종 벽 구조. 낭종 개발 경로가 다른 스트레스 자극에 의해 유도된 수 있습니다 이러한 결과는 강조 표시합니다.
때문에 T. gondii는 온혈 호스트에서 거의 모든 nucleated 셀에 성장할 수 많은 세포 유형은 T. 성장하는 데 사용할 수 있습니다 체외에서 gondii. 그들이 접촉 세포 라인을 저해하기 때문에 HFFs이 프로토콜에 사용되었습니다. 세포 배양 bradyzoite 개발가 삼일이 걸리므로, 그것은 크다되지 않습니다 세포 라인을 사용하는 것이 더 쉽습니다. HFFs은 무기한 교양 수없는 기본 세포입니다. 이상 HFFs가 조직 문화에 passaged 있으며, 덜 관대들은 높은 산도 매체로되며, 따라서 덜 사용할 수 없게 그들은 bradyzoite 전환된다. 최적의 결과를 얻으려면, 호스트 세포가 낮은 통과하고 합류 된 후 적어도 일주일 휴식을 허용한다. 숙주 세포 7 가지 영향을 bradyzoites을 개발 유도를위한 대체 방법이 있습니다.
T. gondii 많은 면역 세포 유형의 번성. 그들이 불멸화 8 시까지 도입되었을 수도 있습니다 아티팩트를 방지하기 때문에 일부 응용 프로그램에 대한, BMCs는 세포 라인을 대식 세포 것이 바람직합니다. 그들은 현미경으로보다 의무가 만드는 RAW264.7 세포에 비해 평면 형태를 가지고 있기 때문에 BMCs 또한 체외 실험에 유용합니다. 여기에서 설명한 기본 BMC 문화 방법은 다른 마우스 종자 9,10에서 BMCs 생산 등 다른 용도로 적용할 수 있습니다. IFNγ와 LPS로 본 활성화의 정도는 공급 업체에 따라 다를 심지어 많이 있습니다. 그러므로 최적의 일관성 성능을 활성화 매체에 사용되는 LPS와 IFNγ의 양을 적정하다하는 것이 필요합니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | heat inactivate |
Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin | Vector Laboratories | RL-1032 | |
Formaldehyde (16%) | Polysciences, Inc. | 18814 | |
Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
IFNγ | PeproTech Inc | 315-05 | Store in single use aliquots |
L-glutamine (200mM) | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Store in single use aliquots |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate) | GIBCO, by Life Technologies | 31800-022 | |
Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
VectaShield mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
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