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Toxoplasma gondii verwandelt sich in eine Zyste bilden als Reaktion auf Belastungen der Umwelt, die in Gewebekultur-Modellen nachgeahmt werden kann. Dieses Video zeigt Techniken, um Zystenwand Bildung durch Aktivierung des Knochenmarks-Makrophagen oder Ändern Wachstumsmedium pH in Fibroblasten-Zellen zu untersuchen.
Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazelluläre Parasiten, die jeder kernhaltigen Zelle des Warmblüter eindringen können. Während der Infektion, T. gondii verbreitet als schneller replizierende Form genannt tachyzoite. Tachyzoiten in eine langsam wachsende encystierten Form genannt bradyzoite durch eine Signalisierung, die nicht gut charakterisiert konvertieren. Innerhalb Tiere sind bradyzoite Zysten in das zentrale Nervensystem und Muskelgewebe und stellen die chronische Phase der Infektion. Die Umstellung auf Bradyzoiten können in Gewebekultur simuliert CO 2 Hunger, mit Medium mit hoher pH-Wert oder die Zugabe von Interferon-gamma (IFN &ggr;). Bradyzoiten werden durch die Anwesenheit einer Zystenwand, zu denen das Lektin Dolichos biflorus Agglutinin (DBA) bindet charakterisiert. Fluoreszenzmarkierten DBA wird die Zystenwand in Parasiten im menschlichen Vorhaut-Fibroblasten (HFFS), die zu niedrigen CO 2 und hoher pH-Milieu ausgesetzt waren, gewachsen zu visualisieren. Ebenso, wohnhaft Parasiten in murinen Knochenmark-Makrophagen (BMMS) zeigt eine Zystenwand nachweisbar durch DBA nach dem BMMS mit IFNy und Lipopolysaccharid (LPS) aktiviert werden. Dieses Protokoll wird zeigen, wie die Umwandlung von T. induzieren gondii zu Bradyzoiten mit einem hohen pH-Wachstumsmedium mit niedrigem CO 2 und die Aktivierung der BMMS. Wirtszellen wird auf Deckgläsern kultiviert werden, infiziert mit Tachyzoiten und entweder mit Zugabe von IFN &ggr; und LPS (BMMS) aktiviert oder die von einem hohen pH Wachstumsmedium (HFFS) für drei Tage. Nach Abschluss der Infektionen wird Wirtszellen fixiert, permeabilisiert werden, und blockiert. Cyst Wände werden visualisiert Rhodamin DBA mit Fluoreszenzmikroskopie.
1. Vorbereitung der menschlichen Vorhaut-Fibroblasten (HFF)-beschichteten Deckgläschen
2. Vorbereitung L929 konditioniertem Medium (CM) für BMC Entwicklung
3. Isolierung von Knochenmark-und Zellkultur von BMC
4. Infizieren Zellen mit T. gondii
5. Initiieren von T. gondii bradyzoite Entwicklung von Belastungen der Umwelt
6. Immunfluoreszenz-Nachweis
7. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt repräsentative DBA-Färbung von T. gondii in aktiviert BMMS und HFFS unter pH Stress. Beide zeigen DBA Färbung um Parasiten mit Vakuolen, die das Vorhandensein von Zystenwand Komponenten. Die aktivierte BMM Bild zeigt DBA Färbung, die mit der Oberfläche der Vakuole ist. Der Querschnitt des T. gondii in pH betonte HFFS zeigt die Zystenwand ohne internen Strukturen gefärbt.
Abbildung 1. DBA Färbung betont T. gondii. intrazelluläre Parasiten unter Stress-Bedingungen, aktiviert BMMS oder pH betonte HFFS wurden mit Rhodamin konjugiert DBA (rot) gefärbt. Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) zeigt den Umriss der Zyste und dem schwarzen Maßstab entspricht 2 pM.
Experimente an Tieren
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der University of Wisconsin Animal Care und Verwenden Ausschusses durchgeführt.
Während der Mechanismus der bradyzoite Entwicklung ist noch nicht vollständig verstanden, molekulargenetische Analysen von T. gondii Bühne Umwandlung in Gewebekultur hat zur Entdeckung von Genen, die in bradyzoite Zystenbildung 2,3,4 beteiligt sind geführt. Die Analysen auch auf die Beobachtung, dass einige bradyzoite Marker in anderen längeren Stress-Bedingungen, einschließlich des Wachstums in aktivierten Makrophagen 5,6 ausgedrückt werden geführt. Die oben genannten Methoden beschreiben, wie T. wachsen gondii und induzieren die Entwicklung eines DBA positive Zystenwand Struktur in beiden BMC und HFFS. Diese Ergebnisse unterstreichen, dass die Entwicklung von Zysten Weg durch verschiedene Stress-Stimuli induziert werden kann.
Da T. gondii kann in nahezu jeder kernhaltigen Zelle von warmblütigen Gastgeber wachsen, können viele Zelltypen verwendet, um T. wachsen gondii in vitro. HFFS wurden in diesem Protokoll verwendet, weil sie einen Kontakt gehemmt Zelllinie. Da Zellkultur bradyzoite Entwicklung dauert drei Tage, ist es einfacher, Zell-Linien, die nicht überwuchern verwenden wird. HFFS sind primäre Zellen, die nicht kultiviert unbegrenzt sein kann. Je länger HFFS in Gewebekultur sind passagiert, desto weniger tolerant werden sie zu hohen pH-Milieu und damit die weniger unbrauchbar werden sie für bradyzoite Schalten. Für optimale Ergebnisse sollte die Wirtszellen niedrigen Durchgang werden und ruhen können mindestens eine Woche, nachdem er konfluent. Es gibt alternative Methoden zur Induktion der Entwicklung bis zur Bradyzoiten, dass unterschiedliche Wirkungen auf die Wirtszelle 7 haben.
T. gondii gedeiht in vielen Zelltypen. Für manche Anwendungen sind BMCs vorzuziehen Zelllinien Makrophagen, weil sie Artefakte, die durch Immortalisierung 8 wurden eingeführt haben können, zu vermeiden. BMC sind auch nützlich für die in-vitro-Experimente, weil sie eine flache Morphologie im Vergleich zu RAW 264.7-Zellen haben macht sie zugänglich für Mikroskopie. Die grundlegende BMC Kultur hier beschriebene Methode kann für andere Zwecke angepasst werden, einschließlich der Erzeugung von BMC aus anderen Mausstämme 9,10. Der Grad der Aktivierung mit IFN &ggr; und LPS gesehen kann je nach Anbieter unterschiedlich und auch die Menge. Es ist daher notwendig, die Mengen von LPS und IFN &ggr; bei der Aktivierung Medium für eine optimale und konstante Leistung verwendet titrieren.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | heat inactivate |
Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin | Vector Laboratories | RL-1032 | |
Formaldehyde (16%) | Polysciences, Inc. | 18814 | |
Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
IFNγ | PeproTech Inc | 315-05 | Store in single use aliquots |
L-glutamine (200mM) | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Store in single use aliquots |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate) | GIBCO, by Life Technologies | 31800-022 | |
Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
VectaShield mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
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