Method Article
Toxoplasma gondii ממיר כדי ליצור ציסטה בתגובה מדגיש סביבתיים, אשר ניתן חיקה במודלים של תרביות רקמה. וידאו זה מדגים טכניקות כדי לבחון הקמת קיר הציסטה על ידי הפעלת מח עצם הנגזרות מקרופאגים או שינוי בינוני צמיחה pH בתאים פיברובלסטים.
Toxoplasma gondii הוא טפיל תאיים לחייב שניתן לפלוש בכל תא גרעיני של דם חם לבעלי חיים. במהלך זיהום, ט gondii מפיצה כמו צורה שכפול מהיר שנקרא tachyzoite. Tachyzoites להמיר לצורה הגדלים לאט encysted שנקרא bradyzoite בתהליך מאותת כי לא מאופיין היטב. בתוך בעלי חיים, ציסטות bradyzoite נמצאים במערכת העצבים המרכזית ורקמות שרירים מייצגים את שלב כרוני של זיהום. הסבת bradyzoites ניתן לדמות בתרבות רקמה ברעב CO 2, באמצעות מדיום עם pH גבוה, או תוספת של אינטרפרון גאמה (IFNγ). Bradyzoites מאופיינים על ידי נוכחות של קיר הציסטה, אשר לקטינים לבלב biflorus agglutinin (DBA) נקשר. DBA שכותרתו fluorescently משמש כדי להמחיש את קיר הציסטה ב טפילים הגדלים fibroblasts העורלה האדם (HFFs) כי נחשפו CO 2 נמוך ובינוני pH גבוה. באופן דומה, טפילים המתגוררים מח עצם Murine הנגזרות מקרופאגים (BMMs) להציג קיר הציסטה לזיהוי על ידי DBA לאחר BMMs מופעלים עם IFNγ ו lipopolysaccharide (LPS). פרוטוקול זה יהיה להדגים כיצד לגרום ההמרה של ט ' gondii כדי bradyzoites באמצעות מדיום הגידול pH גבוה עם CO 2 הפעלה נמוך של BMMs. תאים מארח יהיה מתורבת על coverslips, נגוע tachyzoites והופעל גם עם תוספת של IFNγ ו LPS (BMMs) או חשיפה בינונית צמיחה גבוה pH (HFFs) במשך שלושה ימים. עם השלמת זיהומים, התאים המארחים יהיה קבוע, permeabilized, וחסמו. קירות הציסטה יהיה דמיינו באמצעות DBA rhodamine עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
1. הכנת fibroblasts העורלה האדם (HFF) מצופה coverslips
2. הכנת L929 בינוני מותנה (CM) של BMC פיתוח
3. בידוד של מח עצם תרבית תאים של BMCs
4. מדביק תאים עם ט ' gondii
5. ייזום ט gondii bradyzoite פיתוח על ידי לחצים סביבתיים
6. Immunofluorescence זיהוי
7. נציג תוצאות
איור 1 מציג DBA נציג מכתים של ט ' gondii ב BMMs ו HFFs מופעל תחת לחץ pH. שני DBA להראות מכתים סביב טפיל המכיל vacuoles, המעידים על נוכחות של מרכיבים קיר הציסטה. התמונה BMM מופעל מראה מכתים DBA העולה בקנה אחד עם פני השטח של vacuole. חתך של ט ' gondii ב-pH הדגיש HFFs מציגה את קיר הציסטה ללא מבנים פנימיים מוכתם.
באיור 1. DBA מכתים של ט הדגיש gondii. טפילים תאיים בתנאי סטרס, BMMs מופעל או pH הדגיש HFFs, הוכתמו DBA מצומדות rhodamine (אדום). הפרעה דיפרנציאלי ניגודיות (DIC) מציגה את קווי המתאר של ציסטה לבין בר סולם שחור שווה 2 מיקרומטר.
לניסויים בבעלי חיים
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת ויסקונסין Animal Care ועדת שימוש.
בעוד מנגנון הפיתוח bradyzoite לא מובנת לחלוטין, מנתח גנטיקה מולקולרית של ט ' המרה gondii הבמה בתרבות רקמה הובילה לגילוי של גנים המעורבים ביצירת ציסטה bradyzoite 2,3,4. מנתח הוביל גם תצפית שכמה סמנים bradyzoite באים לידי ביטוי אחרים בתנאי עקה מתמשך, כולל גידול מקרופאגים מופעל 5,6. השיטות לעיל לתאר איך לגדל ט gondii ולגרום להתפתחות קיר DBA חיובי ציסטה מבנה בשתי BMCs ו HFFs. תוצאות אלו מדגישות כי מסלול התפתחות ציסטה יכול להיגרם על ידי גירויים שונים מתח.
בגלל ט gondii יכול לגדול כמעט בכל תא גרעיני של דם חם המארחים, סוגי תאים רבים ניתן להשתמש כדי לגדול ט gondii במבחנה. HFFs שימשו פרוטוקול זה כי הם קשר עכבות קו התא. מאז תרבית תאים פיתוח bradyzoite לוקח שלושה ימים, קל יותר להשתמש שורות תאים כי לא לגדול יותר. HFFs הם תאים ראשוניים כי לא יכול להיות מתורבת ללא הגבלת זמן. HFFs עוד הם passaged בתרבית רקמה, סובלנית פחות הם הופכים למדיום pH גבוה, ולכן הם הופכים להיות פחות שמיש למעבר bradyzoite. לקבלת תוצאות אופטימליות, התאים המארח צריך להיות מעבר נמוך מותר לנוח לפחות שבוע אחרי ונעשה ומחוברות. ישנן שיטות חלופיות גרימת פיתוח bradyzoites כי יש השפעות שונות על התא המארח 7.
ט gondii משגשג הרבה סוגי תאים חיסוניים. עבור יישומים מסוימים, BMCs עדיפים על macrophage שורות תאים כי הם נמנעים חפצים שעשויים הוכנסו על ידי הנצחה 8. BMCs שימושיים גם בניסויים במבחנה כי יש להם מורפולוגיה שטוח לעומת RAW264.7 תאים, מה שהופך אותם נוחים יותר מיקרוסקופית. השיטה תרבות בסיסיים BMC המתואר כאן ניתן להתאים לצרכים אחרים, לרבות ייצור של BMCs מן זנים אחרים עכבר 9,10. מידת הפעלת ראיתי עם IFNγ ו LPS עשוי להשתנות בהתאם לספק ואפילו הרבה. לכן צריך לכיל סכומי LPS ו IFNγ להשתמש במדיום הפעלה עבור ביצועים מיטביים עקבי.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | heat inactivate |
Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin | Vector Laboratories | RL-1032 | |
Formaldehyde (16%) | Polysciences, Inc. | 18814 | |
Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
IFNγ | PeproTech Inc | 315-05 | Store in single use aliquots |
L-glutamine (200mM) | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Store in single use aliquots |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate) | GIBCO, by Life Technologies | 31800-022 | |
Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
VectaShield mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved