おかげでメロディー ニーリー, ジョンアレン、バーゼルの Abuaita とドナ Runft ゼブラフィッシュ モデルの開発を助けることに彼らの努力のため。ここで報告された研究は、国立研究所のアレルギーと感染症 [受賞番号 R21AI095520 と R01AI127390 (ジェフリー ・ h. Withey) に健康の国民の協会によって支えられました。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ウェイン州立大学によって承認されています。このメソッドは最初に Runftらの説明12
1. 腸の植民地化のレベルの決定
注: 相対フィットネス系統のコレラまたは突然変異や遺伝子のノックアウトの効果を比較する使用できるように、腸の植民地化はゼブラフィッシュ モデルで最も有用な指標です。
<ol><li>浸漬によるゼブラフィッシュの接種 注: 露出のつまり感染症の自然経過と似ています。<ol>
<li>コレラの準備
		<ol>
<li>ホストゲノム スープ (LB)、分離のコレラとの 5 mL を接種する LB から植民地板し、6-8 時間 (夜間文化) 37 ° C (180 rpm) を揺れインキュベートします。</li>
			<li>上記の宿泊文化の 50 μ L で 250 mL の三角フラスコに新鮮なオートクレーブ LB 培地の 25 mL を接種します。それは揺れ (150 rpm) で 37 ° C で 16-18 時間孵化させなさい。</li>
			<li>600 の光学濃度を読む 1 mL あたりの菌数を推定するため一晩文化の 1/10 希釈の nm (外径600) (外径600 = 1 は 10 〜9 CFU/mL)。</li>
			<li>ピペットでメディア 6,000 g で 10 分間削除での遠心分離によって細胞を収穫したり消毒液にオフそれを注ぐ。目的の濃度は、通常の 1 x 107 1 x 10 の10 ml の PBS あたり間滅菌 PBS で細胞を再懸濁します。 注: ここでは、我々 はオートクレーブ逆浸透水滅菌感染水として 60 mg/L 海塩を含むを参照してください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
接種と培養
		<ol>
<li>滅菌感染水 200 ミリリットルを含む 400 mL ビーカーに 4 つまたは 5 つのゼブラフィッシュを配置します。</li>
			<li>感染水の 200 mL の目的感染濃度 (通常 5 × 104 5 x 107 CFU/mL) を取得する (ステップ 1.1.1.4) からのコレラの 1 mL を追加します。</li>
			<li>ジャンプから魚を防ぐために穴あきふた付きビーカーをカバーします。200 μ L チップ ボックスの上部はこのためにうまく動作します。</li>
			<li>各ビーカーにラベルを付けるし、実験の期間の 28 ° C で設定前面ガラスの定温器に配置します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
一時的な露出のための手順 注: 接種した細菌の除去が続くコレラ(通常 6 h) に一時的な露出は伝送を勉強し、排泄細菌のより正確な定量化するのに役立ちます。<ol>
<li>露出の 6 h 後魚を収集するために網タイツをビーカーの水を注ぐ。コレラを殺すために漂白剤の容器には、感染した水を破棄します。</li>
			<li>滅菌感染水の 200 mL のビーカーに削除された魚を配置します。魚魚から表面の細菌を除去するために 5 分でこのきれいな水で泳ぐことができます。</li>
			<li>Net 手順 (ステップ 1.2.2) を繰り返し、新しい滅菌感染水を 200 mL ビーカーに魚を置きます。このビーカーで実験の期間の魚を保ちます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>安楽死
	<ol>
<li>実験が目的のエンドポイントに達したら、感染のサンプル水を取る (15 mL は通常十分な) 排泄の細菌数と下痢 (ムチン アッセイ、たんぱく、OD など) の計測を可能にする場合に必要な (セクション 2)。</li>
		<li>(魚を集める) に網目を通して水の残りを注ぎ、コレラ水を殺すために漂白剤。</li>
		<li>感染水に加えて 336 μ g/mL のエチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸 (tricaine) を含むビーカーに魚を置き、室温に 20 分間この tricaine ソリューションで魚を孵化させなさい 注: フィッシュ ネット 10% の漂白剤溶液で殺菌されました。</li>
	</ol></li>
	<li>郭清
	<ol>
<li>魚の準備<ol>
<li>使い捨てのプラスチック スプーンで tricaine ソリューションから魚をすくうし、解離性の表面の上に置きます。</li>
			<li>位置の腹側を上向きに、ピンで魚体の中心から離れて角度ピンの鈍端と下顎を介して。別のピン配置も体から離れて角度、肛門にちょうど後部。</li>
		</ol>
</li>
		<li>腸管の露出<ol>
<li>綿棒 - リントフリーで魚の腹側表面は、70% エタノールに浸漬。</li>
			<li>70% エタノールに浸漬して、それらを炎のメスと Vannas のはさみを滅菌します。</li>
			<li>スケールを貫通し、メスを使用して皮膚のすぐ下の腹で縦の小切開を作る。腸管は皮膚のすぐ下に位置する、あまりにも深く切らないように注意してください。</li>
			<li>はさみを使って、皮膚レベルよりも深い切断の肛門を回避、体の長さに沿って慎重に切開を拡張します。</li>
			<li>切開の開くことを許可する魚の頭に向かってハサミで 2 つの水平カットを作る。</li>
			<li>体から、ピンを釣り、解離性表面に横切開の各側に皮膚をピンします。 注意: ピンの先端が以前アルコールとそれらを燃やすことによって殺菌します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
腸管の除去 注: 腸管が他の臓器の上に薄い、非常に薄いチューブとして表示されます。<ol>
<li>鉗子を火炎滅菌するし、全体の腸管の長さ (通常 12-15 mm) を削除するそれらを使用します。ガラスビーズ (手順 1.4.1–1.4.2 を参照) および PBS または氷の上のポンド x 1 の 1 mL を含む均質化管に腸管を配置します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>均質化
	<ol>
<li>均質化管の事前準備 1 mm ガラスビーズの注ぐ ~1.5 g で 2 mL にスクリュー キャップ チューブ (それらの約半分の方法を記入) し、オートクレーブに入れることによってそれらを殺菌しなさい。</li>
		<li>1 mL 滅菌ポンドまたは 1x PBS を追加します。</li>
		<li>ゼブラフィッシュ腸にされている追加 (手順を 1.3.3.1 詳細ページ)、チューブ、スクリュー キャップ、非常にしっかりと、渦ホモジナイザーでチューブを固定します。</li>
		<li>最大の設定で 1 分のサンプルを均質化し、クールで 1-2 分間氷の上にサイクルを繰り返すこの均質化もう一度完全な均質化のため。 注意: 均質化のためのいくつかの代替方法も稼働します。</li>
	</ol></li>
	<li>腸の植民地化のレベルを定量化
	<ol>
<li>磨砕液の連続希釈の管 (小さなガラス試験管や 1.5 mL 容マイクロ チューブ) を準備するには、各管に LB または 1x PBS の 900 μ L を追加します。それぞれの魚の 5-6 管を準備し、最初の管の磨砕液 100 μ L を追加することによって腸の磨砕液の 10 倍のシリアル希薄を作るボルテックス ミックス、および最初のチューブから 2 番目の管に 100 μ L を追加します。</li>
		<li>この手順を繰り返してすべての希釈液が用意されています。</li>
		<li>各希釈ストレプトマイシン (ストレプトマイシン耐性菌の場合) の 100 μ g/mL と X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) の 40 μ G/ml を含む LB 寒天培地プレート上の 100-200 μ L をプレートします。16-18 h 30 ° C でプレートを孵化させなさい。</li>
		<li>一晩インキュベートした後カウント; 植民地のカウントを手動でまたは自動コロニー カウンターを使用して、プレートのコロニーのコレラマーカー先端で数えられたコロニーをマークすることをお勧めします。</li>
		<li>メッキ量を考慮して、懸濁液の希釈倍率のプレート数を乗じて魚腸あたり CFU を決定します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 魚下痢の測定
注: 4 つの異なる評価指標を用いて魚下痢を評価する: 水、水、水13で、水と、コレラCFU の OD600の全体的な排泄タンパク質レベルで粘液のレベル。下痢は通常視覚的に明白になるコレラ前述のように、ゼブラフィッシュの暴露後約 6 時間。
<ol><li>
粘液のレベルを決定します。 注: 粘液分泌のコレラ植民地時代は誘導され、感染13の特に早い段階での排泄レベルの良い指標です。ムチン アッセイ マイクロタイター過ヨウ素酸シッフ アッセイ19のバリエーションであります。<ol>
<li>以下の資料を準備: 50% (w/v) 周期酸原液と 0.1% 水溶液作業の周期 (7% 酢酸 5 mL に添加 50% 過ヨウ素酸株式の 10 μ L-後すぐに使用)、ムチン基準、96 ウェル マイクロ プレート、シフ試薬です。<ol>
<li>ナトリウム酢酸緩衝液 (100 mM ナトリウム 5.5 氷酢酸と酢酸、5 ミリメートルの EDTA、pH) に次 (ブタの胃型 III) から粘液量を中断することにより粘液の基準を準備: 400 μ g/mL、300 μ g/mL、200 μ g/mL、150 μ g/mL、100 μ g/mL、75 μ g/mL、50 μ g/mL、25 μ g/mL、10 μ g/mL。 板を準備するには、次のように試金で使用される各ウェルに水感染の 100 μ L を追加することによって: 空白の 1x PBS。前述のように、ムチン基準や魚の感染症からの水のサンプル。3 通の各サンプルを行います。</li>
		</ol>
</li>
		<li>上下に数回ピペッティングで混ぜるし、それぞれよくマルチ チャンネル ピペットに新鮮な 0.1% 周期酸の 50 μ L を追加します。</li>
		<li>プレートをしっかりとラップで包み、1-1.5 h の 37 ° C でそれを孵化させなさい。</li>
		<li>各井戸と上下にそれをミックスするピペットにフクシン溶液 (シフの試薬) の 5-10 分を追加 100 μ L の室温までプレートを冷やします。</li>
		<li>プレートをラップで包み、インキュベートそれロッキング プラットフォームで室温まで色を開発してきました。色は 560 で吸光度を読み 20 分以内一般に開発される nm プレート リーダーを使用しています。</li>
		<li>ムチン標準曲線 (外径560対μ G/ml ムチン標準) をプロットします。各未知の外径560が標準曲線に該当の識別とその値に対応するムチン濃度未知のムチン レベルが決定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
タンパク質レベルを決定します。 注: 別にムチン、タンパク質レベルで水の全体的な魚によって生成される下痢 (曇り、液体便) のレベルの別のプロキシです。この手順では、標準のブラッドフォードの試金を使用して蛋白質のレベルを推定します。タンパク質レベルは、ウシ血清アルブミン (BSA) の標準曲線に基づいて推定されます。<ol>
<li>ミックス (下のメモを参照) BSA の標準の 1 つの 100 μ L または 100 μ L 水感染症 (感染した魚を含んでいるビーカーから水) のブラッドフォードの 900 μ L で使い捨てのキュベットの試金の試薬 (ピアス蛋白質の試金の試薬はこのためにうまく動作します)。すべてのサンプルを 2 分間室温で孵化させなさい。 注: 次の BSA の標準は使用された: 1,800 μ g/mL、1,000 μ g/mL、750 μ g/mL、500 μ g/mL、250 μ g/mL、125 μ g/mL、50 μ g/mL、25 μ g/mL。BSA の標準は、オートクレーブの蒸留水で希釈されました。</li>
		<li>各標準の OD660を読んだり、サンプルの分光光度計を使用してください。</li>
		<li>BSA の標準曲線 (660対OD μ g/mL) をプロットします。各未知の OD660が BSA の標準曲線に落ちるし、その値に対応するムチン濃度を読んで識別することによって未知の蛋白質のレベルを決定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
メジャーの OD600 注: いくつか h と OD600の簡易定量法は、これを定量化する使用ことができます後、下痢 (曇り、液体便) の存在は目に見えて明らか。<ol>
<li>内容を均等に数回感染水を含むチューブを反転します。使い捨てのキュベットに水サンプルの 1 ミリリットルを追加します。陰性対照として滅菌感染水 1 mL を使用します。</li>
		<li>600 で分光光度計を使用して「空白」の測定を行い陰性対照サンプルを使用して nm。600 nm でのレコードごとの水のサンプルを読んで結果。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
定量感染後のコレラCFU/mL の排泄 注: ゼブラフィッシュによって生成される下痢の主要成分は排泄のコレラ。CFU/mL の定量は、伝送実験の伝染性の線量の測定と魚の腸管内細菌の複製の推定などの目的で使用できます。このメジャーは最高、一過性感染が行われたときに行われます。感染症は 24 h を使用すると、この試金は複合菌に加えて、排泄のコレラ測ります。<ol>
<li>目的の時点で水サンプルを取るし、連続希釈して前述のよう。</li>
		<li>選択培地 (DCL または別の適切な抗生物質ストレプトマイシンを含む LB 寒天培地) のシリアル希薄をプレートし、30 ° C 24 時間でそれらを孵化させなさい。</li>
		<li>コロニーをカウントします。手順 1.5 mL の水当たり CFU を計算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

ゼブラフィッシュのコレラ研究の比較的新しいモデルですが、将来コレラ生物学および病因11,12,13の未知の側面の発見を多くの約束を保持しています。.アダルト ゼブラフィッシュ モデルに両方自然であることの利点は、そのままに、成熟した腸内細菌叢と環境モデルを含むホストのコレラ。モデルの欠点は、2 つの主要な人間の病原因子、コレラ毒素と毒素 coregulated 毛、ゼブラフィッシュ植民地や病因12必要ないことです。しかし、この見なすことができるまたは小説のコレラ菌の同定を有効にすることができるもう一つの利点として要因および他のコレラ毒素の研究を容易にします。これは特に非-O1/O139「環境」の大半に関連するコレラ菌、ほとんどない農産物コレラ毒素毒素 coregulated 毛かし、まだ病気20,21を引き起こすことができます。
このモデルを使用してに発生するほとんどの問題は、豊富な腸内細菌叢に関連付けられます。非選択的メディア上のめっきがこのモデルは本質的に使用できなくなるがコレラのコロニーを識別することが可能になります。ポンドに加えて、ストレプトマイシンや DCL など選択的または部分的に選択的なメディアを使用しても、腸内細菌叢からの植民地の背景に表示されます。それは TCBS など非常に選択的な媒体により少なく選択的メディアのメッキによって生成される植民地をパッチによってカウントされているコロニーがコレラ善意であることを確認することが欠かせません。また、関心の株のゲノムに良い選択マーカーの挿入が腸ホモジュネートからのコレラの同定を大幅に簡略化。
ゼブラフィッシュ下痢を定量化するために使用法の利点は、シンプルで安価な13を実行していることです。欠点ですこれらの試金は別に直接、排泄のコレラCFU カウント、主として非特異的下痢はコレラ発症原因が直接か他のストレッサーを決定する困難になることができます。.これらまたはその特異性は多分を改善するために他のアッセイのバリエーションの開発は将来的にゼブラフィッシュのコレラ発症の測定を支援します。

コレラは、散発的な下痢1,2と同様、人間の病気のコレラを引き起こす水生、グラム陰性細菌です。コレラは、しばしば他の水生生物に関連付けられている、世界中の多くの地域で環境にあります。プランクトン、昆虫の卵塊、貝、および脊椎動物の魚の種3,4,5,6、7これらの関連付けられた生物が含まれます。いくつかの研究はコレラの異なる地理的領域7,8,9,10魚の腸管から分離しています。魚のコレラの存在は、魚環境の貯水池として機能するかもしれないことを示します。魚は人間に病気を送信およびコレラ菌6の地理的な広がりにも関与する可能性が。
理解どのように魚と対話するコレラ、動脈分布としてよりもっとよく知られているゼブラフィッシュはコレラ対e11を研究するためのモデル システムとして開発されました。ゼブラフィッシュ、コレラの初期貯留層と考えられているベンガル湾の地域を含む南アジアにネイティブです。1817 年に最初コレラ大流行開始、する前にコレラはインドとバングラデシュは今外報告されていなかった。したがって、ゼブラフィッシュとコレラほぼ確実に関連付けられてお互い進化的時間スケールでそのゼブラフィッシュが自然環境12内のコレラのホストを示唆しています。
コレラのゼブラフィッシュ モデルが実行するシンプルで全体の病原性を研究するためのコレラのライフ サイクル。魚は、コレラの知られている数に接種されている水で入浴でコレラにさらされています。数時間以内腸の植民地化は下痢の生産に続いて、起こる。下痢は、粘液、蛋白質、排泄の細菌や他の腸の内容で構成されています。下痢の程度は、いくつかの簡単な測定13を用いて定量化することができます。コレラ感染魚が排泄されていることができますを行く素朴な魚に感染する感染のサイクルを完了します。したがって、ゼブラフィッシュ モデルはコレラ人間の病気プロセス12,14を繰り返します。
コレラ最も頻繁に使用される動物モデル マウスおよびウサギ14,15,16,17,18されてきました。これらのモデルは、コレラ発症の私達の知識に追加するのに尽力されています。ただし、自然のコレラはマウスおよびウサギのためのホストのコレラのライフ サイクルのどのような側面を学ぶことができますに制限があります。マウスおよびウサギのコレラ菌は通常、腸内細菌叢、腸内細菌叢を損傷するために抗生物質を用いる前処理の不在を必要とします。両方のモデルでは、消化管に細菌を導入する強制経口投与または直接腸に細菌を注入する手術操作のいずれかを必要があります。ゼブラフィッシュそのまま腸内細菌叢と成魚はすぐに植民地化および伝染のプロセスは、必要な操作をすることがなく、自然に起こりますという点で利点があります。
現在の仕事は、コレラ感染のモデルとしてのゼブラフィッシュの使用率を示しています。感染症、解離、植民地化のコレラの列挙およびコレラによる下痢の定量化説明12,13になります。このモデルは、コレラ病プロセスとコレラ環境生活の両方に興味がある科学者に有用である可能性が高いです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific, Edison, NJ</td>
			<td>Excella E25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>NUAIRE, Plymouth, MN</td>
			<td>Auto Flow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo, Waltham, MA</td>
			<td>Geaesys 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex homogenizer</td>
			<td>Minibeadbeater24</td>
			<td>112011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Machine</td>
			<td>Ohaus, Columbia, MD</td>
			<td>Adventurer Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Stirer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>automated colony counter</td>
			<td>REVSCI</td>
			<td>120417B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 ml glass beakers</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perforated lids</td>
			<td>Microtip holder with holes from tip box</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable plastic spoons</td>
			<td>Office Depot, Boca Raton, FL</td>
			<td>D15-25-7008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish Tank System</td>
			<td>Aquaneering, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RO Water Purifier</td>
			<td>Aqua FX</td>
			<td>TK001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish net</td>
			<td>Marina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fish food</td>
			<td>Tetra fin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine Shrimp</td>
			<td>Red jungle brand</td>
			<td>O.S.I. pro 80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td>
			<td>10000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td>
			<td>11223-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td>
			<td>15000-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml screw cap tubes</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>02-681-375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm glass beads</td>
			<td>Bio Spec</td>
			<td>11079110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads for spreading</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>18406-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate</td>
			<td>Fisher Brand, Hampton, NH</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml centrifuge tube</td>
			<td>Midsci, Valley Park, MO</td>
			<td>AVSS1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning Falcon, Corning, NY</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>9820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipette</td>
			<td>Fisher Brand, Hampton, NH</td>
			<td>13675K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pipettes</td>
			<td>Sartorius Biohit, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>m1000/m200/m20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td>
			<td>24-150RS/24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>VWR Life Science, Radnor, PA</td>
			<td>K813-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>10651745001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>84655-250 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>periodic acid</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>10450-60-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin from porcine stomach</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>M2378-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>9046-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660nm Protein Assay Reagent</td>
			<td>Thermo, Waltham, MA</td>
			<td>22660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teast Extract</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NACL</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCBS Agar</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>265020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCLS Agar</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>70135-500gm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft office</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying vibrio cholerae colonization and diarrhea in the adult zebrafish model

コレラは、コレラの人間の病気を引き起こす病原菌として有名です。人間のホストの外のコレラ主に存在する様々 な高い水生種のやり取り、水生環境で。脊椎動物の魚環境のホスト知られているで、本質的に潜在的なコレラの貯水池です。コレラゼブラフィッシュ、通称魚類種動脈分布、水生環境で長期にわたる相互作用を示唆しているインドの亜大陸から起きる。ゼブラフィッシュは、感染症を含む生物学の多くの側面を研究するための理想的なモデル生物です。ゼブラフィッシュことができます簡単かつ迅速に植民地化されるコレラによって水の暴露後。コレラによって腸の植民地化は、下痢の生産とレプリケートされたコレラの排泄に します。これらの細菌が排泄し、新たに魚のホストを植民地化するに行きます。ここでは、コレラを評価する方法を示します-ゼブラフィッシュとコレラを定量化する方法で腸の植民地化-ゼブラフィッシュ下痢を誘発します。植民地化モデルは興味の遺伝子が環境の生存および/またはホストの植民地化の重要な可能性があるかどうかを研究している研究者に役立つはずです。ゼブラフィッシュ下痢の定量化は、モデルとしてのゼブラフィッシュを探究することに興味を持っているすべての腸内の病原体を勉強して研究者に役立つはずです。

ゼブラフィッシュ腸管のコレラ菌
遵守する典型的な植民地化のレベルの例を提供するために 5 × 106エル Torのコレラパンデミック N16961 いくつかのゼブラフィッシュを含むビーカーの水の 200 ml の CFU を接種しました。感染症の 6 h 後魚は新鮮な水で洗浄されプロトコルで説明されているようにオートクレーブ感染水の 200 mL のビーカーに転送。18 h 転送 (または一次感染後 24 h) 後魚を安楽死させ、腸の植民地化のレベルを決定するのに運ばれました。約 10 魚腸あたりのセルのコレラ106 5通常、5 x 106接種量と腸管 24 h 後感染 (hpi) (図 1) で観察されました。
魚下痢の定量化
下痢は上記 4 つの単純なアッセイを用いて定量化。最初の試金、排泄のコレラCFU は図 1に示します。水 24 hpi のシリアル希薄だった、コレラCFU をカウントするメッキ。排泄のコレラの比較的高レベルが通常観察される;この例では、約 10 の5 mL の水当たりのコレラが検出されました。感染していない魚は、検出可能のコレラ(データは示されていない) は生成されません。
下痢を定量化するために使用 2 番目のアッセイは、排泄のムチンです。図 2を示しています 3 別のコレラ感染の影響は 24 hpi 水中ムチン量に投与。高感染用量水の中にムチンの高い排泄量と相関しています。コントロールとして 4 つの魚が、水の同じビーカー中に置かれたが、PBSのコレラ懸濁液の代わりに追加されました。魚には、非常に少しの粘液が排泄されます。
3 番目の下痢定量アッセイは、水 24 hpi の OD600です。図 3に示すとおり、この水の外径600はゼブラフィッシュコレラ Vよりも感染していないゼブラフィッシュを含むビーカー内に感染を含むビーカーで有意だった。
最後に、水で総蛋白レベルを測定しました。感染した魚を含んでいる水には、感染していない魚 (図 4) を含む水にみられる総蛋白レベルほぼ 2 倍にはが含まれています。総称して、これらの 4 つの試金はコレラ感染がゼブラフィッシュの排泄に及ぼす影響を示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57767/57767fig1.jpg"> 図 1:コレラによるゼブラフィッシュの腸管定着。魚が 6 h のために感染し、洗浄、合計 24 時間インキュベートします。図の左側にある 4 つの魚 (ブラック ドット) の腸あたり合計 CFU を示しています図の右側は、コレラCFU/mL 水 24 hpi (黒い正方形) で測定を示します大きい水平ラインと両方のデータ セットの平均と標準偏差は誤差範囲で示されます。<a href="/files/ftp_upload/57767/57767fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57767/57767fig2.jpg"> 図 2: ムチン アッセイ。異なる 3 つのコレラ感染用量使用された、感染していないコントロールxの下で示されているように-軸。シフ (PAS) アッセイ変更周期酸水で検出された粘液の平均値は、それぞれの伝染性の線量の上の黒いバーで示されます。誤差範囲は、標準偏差を示します。印はp < 0.05 学生によって決定される対になっていない t 検定。<a href="/files/ftp_upload/57767/57767fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57767/57767fig3.jpg"> 下痢のためのプロキシとして図 3: 外径600アッセイ。いずれかのコレラを含むビーカーから水の 1 mL の OD600感染または感染していない魚を測定しました。黒いバーは、平均値を示すし、エラーバーは標準偏差を示します。印はp < 0.05 学生によって決定される対になっていない t 検定。<a href="/files/ftp_upload/57767/57767fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57767/57767fig4.jpg"> 図 4: 水のタンパク質レベルを合計します。総蛋白は、前述のブラッドフォードの試金によって推定されました。黒いバーは、平均値を示すし、エラーバーは標準偏差を示します。印はp < 0.05 学生によって決定される対になっていない t 検定。<a href="/files/ftp_upload/57767/57767fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

ゼブラフィッシュが自然なコレラをホストし、要約し、トランス ミッションに植民地から全体の感染サイクルを研究する使用ことができます。ここでは、植民地化レベルのコレラを評価し、下痢ゼブラフィッシュを定量化する方法を示します。

コレラの植民地化と大人のゼブラフィッシュ モデルで下痢を定量化

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

quantifying-vibrio-cholerae-colonization-diarrhea-adult-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

8.3K ビュー.  Wayne State University School of Medicine. ゼブラフィッシュが自然なコレラをホストし、要約し、トランス ミッションに植民地から全体の感染サイクルを研究する使用ことができます。ここでは、植民地化レベルのコレラを評価し、下痢ゼブラフィッシュを定量化する方法を示します。

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Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin synthesis. They also supply the host with a considerable amount of nutrients, making this ecosystem an essential metabolic organ. In the context of increasing evidence of the link between the gut flora and the metabolic syndrome, understanding the metabolic interaction between the host and its gut microbiota is becoming an important challenge of modern biology.1-4
 Colonization (also referred to as normalization process) designates the establishment of micro-organisms in a former germ-free animal. While it is a natural process occurring at birth, it is also used in adult germ-free animals to control the gut floral ecosystem and further determine its impact on the host metabolism. A common procedure to control the colonization process is to use the gavage method with a single or a mixture of micro-organisms. This method results in a very quick colonization and presents the disadvantage of being extremely stressful5. It is therefore useful to minimize the stress and to obtain a slower colonization process to observe gradually the impact of bacterial establishment on the host metabolism.
 In this manuscript, we describe a procedure to assess the modification of hepatic metabolism during a gradual colonization process using a non-destructive metabolic profiling technique. We propose to monitor gut microbial colonization by assessing the gut microbial metabolic activity reflected by the urinary excretion of microbial co-metabolites by 1H NMR-based metabolic profiling. This allows an appreciation of the stability of gut microbial activity beyond the stable establishment of the gut microbial ecosystem usually assessed by monitoring fecal bacteria by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis).6 The colonization takes place in a conventional open environment and is initiated by a dirty litter soiled by conventional animals, which will serve as controls. Rodents being coprophagous animals, this ensures a homogenous colonization as previously described.7
 Hepatic metabolic profiling is measured directly from an intact liver biopsy using 1H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spectroscopy. This semi-quantitative technique offers a quick way to assess, without damaging the cell structure, the major metabolites such as triglycerides, glucose and glycogen in order to further estimate the complex interaction between the colonization process and the hepatic metabolism7-10. This method can also be applied to any tissue biopsy11,12.

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

A progressive colonization procedure is described to further assess its impact on the host hepatic metabolism. Colonization is monitored non invasively by evaluating the urinary excretion of microbial co-metabolites by NMR-based metabolic profiling while hepatic metabolism is assessed by High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profiling of intact biopsy.

無菌マウスでのプログレッシブ植民地時代に肝代謝変化を評価する 1 H NMR分光法

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

免疫・感染学

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

の植民地化 Euprymna scolopesイカでビブリオフィシャリ</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - 遺伝的に変更する方法<em&gt;コレラ菌</em&gt;自然形質転換およびFLP組換えに基づき

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

新生児と大人の中枢神経系から培養ミクログリア

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

使用肺炎球菌植民に対するプロバイオティクスの影響を調査<em&gt;体外</em&gt;接着アッセイ

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have been developed that permit engraftment of normal and malignant cells into irradiated, syngeneic, and immune compromised adult zebrafish. These models when coupled with optimized cell transplantation protocols allow for the rapid assessment of stem cell function, regeneration following injury, and cancer. Here, we present a method for cell transplantation of zebrafish adult skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS), a pediatric sarcoma that shares features with embryonic muscle, into immune compromised adult rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. Importantly, these animals lack T cells and have reduced B cell function, facilitating engraftment of a wide range of tissues from unrelated donor animals. Our optimized protocols show that fluorescently labeled muscle cell preparations from &#945;-actin-RFP transgenic zebrafish engraft robustly when implanted into the dorsal musculature of rag2 homozygous mutant fish. We also demonstrate engraftment of fluorescent-transgenic ERMS where fluorescence is confined to cells based on differentiation status. Specifically, ERMS were created in AB-strain myf5-GFP; mylpfa-mCherry double transgenic animals and tumors injected into the peritoneum of adult immune compromised fish. The utility of these protocols extends to engraftment of a wide range of normal and malignant donor cells that can be implanted into dorsal musculature or peritoneum of adult zebrafish.

Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells.

免疫低下アダルトゼブラフィッシュへの正常および悪性筋細胞移植

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

の検出のためのより高感度で特異的な発色性寒天培地の開発<em&gt;腸炎ビブリオ</em&gt;その他<em&gt;ビブリオ</em&gt;種

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

グループBのマウスモデル<em&gt;連鎖球菌</em&gt;膣植民地化

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.

バイオタイプの維持と差別化に使用される実験技術<em&gt;コレラ（Vibrio cholerae）</em&gt;臨床分離株

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

コレラの植民地化と大人のゼブラフィッシュ モデルで下痢を定量化

コレラの植民地化と大人のゼブラフィッシュモデルで下痢を定量化