著者らは、イカ施設をサポートするために、この原稿についてのコメント、マイケル·ハドフィールドとフィールドのコレクションの間に援助のケワロ海洋研究所およびこのプロトコルへの貢献のために、Rubyとマクフォール·ガイ研究所のメンバーのGyllborgマティアスに感謝します。マンデル研究所での作業は、NSF IOS-0843633によってサポートされています。

1。細菌接種の準備<ol><li> 0日 イカ接種、プレートLBS 13寒天の関連菌株の2日前まで。 </li><li> 25から28℃で一晩、細菌をインキュベートします。 </li><li> 1日目 それぞれの1つのコロニーのガラス培養チューブに3mlのLBS培地に接種V.感染のシャリ株 。バックアップとしてチューブを複製する準備をします。 </li><li> 2日目 （イカの手順3.7から3.10を有する細菌のステップ1.4から1.6に調整） 接種前に1時間、継代培養菌ガラス培養チューブに3mlのLBSに1:80（37.5μL）および曝気1時間成長します。 </li><li>接種前にサンプルのOD 600を測定します 。典型的な測定値が0.3から0.6株に依存している。 </li><li> 3〜5×10 3 CFU / mlのターゲット接種のために次のように接種量を計算します。接種量（μL）= 1.25 / OD 600（例えば、OD 600 = 0.5、計算された接種量= 1.25/0.5 = 2.5μl）を、この量は、ステップ4.1にイカを含む海水に直接追加されます。この計算ではVの異なる系統を調整する必要があるかもしれませんシャリまたはここで指定されたものより低い、または高いレベルでの接種のために。 </li></ol> 2。接種の列挙のために寒天プレートの準備<ol><li>それぞれの治療のために、ステップ4.1の接種のプレートのサンプルへのラベルLBSプレート（処理ごとに2つ）。 </li><li>プレートあたり5滅菌メッキビーズを追加します。 </li></ol> 3。 Squidの少年のコレクション<ol><li>屈折計を使用してInstant海の塩分濃度を測定し、35‰に調整します。 </li><li>フィルター滅菌インスタントオーシャン（FSIO）を生成し、濾過ユニットと接続された真空ラインや真空ポンプを使用してインスタントオーシャンのフィルタ1 L。各調剤に積極的に前に渦巻くによる水酸素を送り込む。番目のメールフィルターユニットは、2日間再利用することができます。 </li><li> 2（2）使い捨てサンプルボウルのそれぞれにアリコートFSIOの40〜50 mlを。ラベルが短縮さなどの1つとtimeliesとして1。 </li><li>最低の尾根（図3を参照）の上に、先端から約1cmピペットを切断することによって少年イカを取得するためのプラスチック製トランスファーピペットの過剰準備をします。これは、イカは、コレクションに渡すことができるを通じて、より広いエリアを容易にします。大まかな露出面がである任意の転送ピペットを破棄します。 </li><li>準備された転送ピペットを用いて、E.を収集一晩孵化FSIOの時間が短縮さのボウルに転送するscolopes。初期の孵化は1以上の時間卵システムになってと汚染によって植民地化の影響を受けやすいたV.卵·システム内のシャリ 。敏感な植民地化実験のための時間が短縮さを使用しないでください。 </li><li>卵のタンクに新しい幼体ごとに30-45分を確認してください。すべての孵化は各cの間にクリアされていることを確認してください一体。 FSIOのtimeliesボウルに転送ピペットで孵化し、預金を削除します。タイムリーに収集された動物は、植民地化実験のために用意されています。 </li><li>コレクションが終了したときに（〜45分夕暮れ後）は、主室にイカを転送します。経験的にそれが3時間の接種のために中断されない実験室の光条件の下で動物を植民地化するのが有利である。 </li><li>それぞれの治療のために、40ミリリットルFSIOとボウルを用意します。アッセイのためのボウル（ボウルあたりの最大はn = 40）にイカを追加します。 </li><li> aposymbiotic（負）のコントロールとして追加のボウルを用意してください。 </li><li>それぞれの治療のために専用のピペットを準備します。 </li><li> 2％のエタノールで余分なイカを安楽死させる。 </li></ol> 4。イカの植民地<ol><li> 2日目- P10ピペットマンを使用して、各治療のためにそれぞれのイカ丼（ステップ3.8）への細菌の計算されたアリコート（ステップ1.5）を分注する。直後に3時間のタイマーを起動します。第一接種。 </li><li>それぞれの治療のために、ボウルの縁の近くにピペットを置き、約10秒間水とイカを混ぜて繰り返しを上下にピペッティングすることにより、専用のピペットでボウルの &quot;渦&quot;を作成します。十分に混合することが重要です。 </li><li>ステップ2.2からLBS寒天プレート上に各鉢からプレートを50μl（技術のために、治療ごとにプレート2を50μlプレートを複製します）。 25から28℃で一晩インキュベートします。 </li><li>それぞれの治療のために洗浄ボウル（100ミリリットルFSIO / EA）を準備します。 </li><li>各イカのためにショウジョウバエバイアル（4ミリリットルFSIO / EA）を準備します。 </li><li>ちょうど3時間後、それぞれのウォッシュボウル（すべての治療のための完全な）にイカを転送します。これは、接種を停止します。 </li><li> FSIOを持つ独自のショウジョウバエのバイアルに、個々のイカを転送するために進んでください。それぞれの治療のために指定されたピペットを使用しています。 </li><li>日/ nに戻るにはイカ施設にショウジョウバエのバイアルトレイを移動するIGHTライトサイクルの動物は胚発生の間に経験した。 </li><li> 3日目-それぞれのイカのために準備ショウジョウバエバイアル（4ミリリットルFSIO / EA）。 </li><li> 22から24時間後接種で夕暮れ前に、新しいショウジョウバエのバイアルにそれぞれのイカを転送します。それぞれの治療のために指定されたピペットを使用しています。 </li><li> 4日目 -標識された1.5 mlのマイクロ遠心チューブ（1/squid）を準備します。 </li><li>前の46から48時間後接種は、メジャーでの夕暮れに、 ショウジョウバエのバイアル（6の統合と蓋の閉鎖で自動読み込みのためにルミノメーターセット）のそれぞれのイカの発光を記録します。 </li><li>バックグラウンド発光のための陰性コントロールとして、任意のイカが含まれていませんFSIOバイアルを測定します。 </li><li>ステップ4.12から1.5 mlのマイクロ遠心チューブに約700μlのボリューム内の各イカを転送します。段ボールフリーザーボックスに移動します。蓋は、ボックス上に配置されると、WELはありませんバクテリアの追放のための光手がかりとして、それを削除しないでくださいL-理解していた。 </li><li> -80°Cで一晩遠心管を凍結します。 </li></ol> 5。植民地化レベルの決定<ol><li>各イカの場合は、475μlのFSIO（または70％インスタントオーシャンをオートクレーブ）で2（2）マイクロチューブ、それぞれを準備します。 </li><li>第一杵をきれいにし、大まかな汚物を除去および/または組織を削除するには、キムワイプを使用して乳棒を準備します。 </li><li>場所は、95％エタノールを含む50 mlのビーカーに先端ダウン乳棒。エタノールは約3 cmの高さに追加する必要があります。 </li><li>各乳棒では、ビーカーから削除し、キムワイプで先端を拭きます。 </li><li>ディップは、エタノール浴中に戻って乳棒削除し、挿入（最大TIP）マイクロチューブのラックに約15分間完全に風乾することができます。 </li><li>マイクロチューブのラック（最大N = 8）でイカを解凍します。 </li><li>必要な場合は、700μlに音量を調整します。 </li><li>ステップ5.5から乳棒を用いて、インク嚢RUPまで、動物の組織を混乱させるTuresの（水が濁った灰色に変わります。） </li><li>杵を削除し、すべての組織がチューブに残っていることを確認してください。 </li><li>正確に10秒（タイマーを使用）のために簡単にボルテックス組織を。 </li><li>組織は10分間休憩することができます。組織が落ち着くし、細菌やインクは溶​​液中に残っています。続く計算では、細菌/インク·ソリューションは、[A]希釈（すなわち、700μlのE. scolopes光臓器ホモジネート）です。シリアル1:20希釈（[B]、[C]）以下に記載されています。 </li><li> [B]希釈する場合は、ステップ5.1で調製したマイクロ遠心チューブのいずれかに25μlの[A]を追加します。渦。 </li><li> [C]希釈する場合は、ステップ5.1で調製したマイクロ遠心チューブのいずれかに25μlの[B]を追加します。渦。 </li><li> LBS寒天培地上に各希釈液の50μlをプレート、2は、治療ごとに複製されます。 </li><li> 25から28℃で一晩培養する。 </li></ol> 6。データ解析<ol><li> CFU /発光器（LO）、国を計算するには10から400コロニーが存在し、適切な式を使用しているそれぞれの治療のためにプレート上のTコロニー： CFU / LO =（[A]プレート上のコロニー）×14、または CFU / LO =（[B]プレート上のコロニー）×280、または CFU / LO =（[C]プレート上のコロニー）×5600。 </li><li>対数スケール上の個々のデータ点と中央値をプロットします。 </li><li>データは、多くの場合、通常、分散が異なると、配布されていないと、外れ値が意味のある生物学的情報を含めることができます。したがって、非パラメトリックテストでは、治療が著しく異なるかどうかを判断するのに便利な方法を提供します。 </li><li>統計分析のためのグラフパッドプリズムソフトウェアを使用します。二つの治療については、ウィルコクソンの順位和検定を使用しています。以上の二つの試験治療間の比較については、適切な事後テストとクラスカル·ワリス検定を使用しています。 </li></ol> 7。代表的な結果サンプルのコロニー形成アッセイの結果を図4に示されています。の2系統<em&gt; V.発光の異なる相対レベルを示すシャリはaposymbiotic（uncolonized）コントロールを務めた6イカと一緒に、6イカに接種し、それぞれであった。 E. scolopesシンビオントは、ES114 14、明るくSepiolaロブスタシンビオントは、SR5 15,16。同様の接種レベル（図4A）3時間以内に100％の植民地化につながる。 48時間、発光レベル（図4B）とCFUカウントが（図4C）株のコロニー形成能力を評価するために決定した。特定の発光（図4D、当たり細菌）の決定は、共生時に各菌株の明るさの測定が可能になります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3758/3758fig1.jpg" /> 植民地化手順の図1のフローチャート。細菌とイカが指定さ接種で混合し、別々に収穫されます。 Squidは、その後3時間、24時間、および4で新しい水に移し、洗浄され、<html> 8時間後の接種。 48時間で表面殺菌し、動物に機能する、発光を測定し、動物が凍結されています。光オルガンは、細菌が-80℃で生存し続ける植民地°Cを1つ融解（追加の凍結融解サイクル）を通して。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3758/3758fig2.jpg" /> 均質化と細菌の希釈メッキを示す図2のフローチャート。シリアル20倍希釈では、植民地化細菌の列挙のための適切なダイナミックレンジを提供しています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3758/3758fig3.jpg" /> 図3。少年イカを損なうことになるナローボア（）に適切に狭いシャフトのテーパーでピペットを転送します。ハサミやカミソリの刃の狭いセクションをカットすることにより前処理（B）は、少年イカを転送するための適切なツールが得られます。 s/ftp_upload/3758/3758fig4.jpg &quot;/&gt; 図4コロニー形成アッセイのためのサンプルデータ。接種ボウルの中の細菌の（A）レベル。個々のイカの（B）発光。 （C）個々のイカのコロニーカウントされます。個々のイカの（D）特定の発光。 APO、Aposymbiotic（ネガティブコントロールをuncolonized）。

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	<li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+normal+bacterial+flora+of+the+oral+cavity.">Defining the normal bacterial flora of the oral cavity.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li><li>Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+regulatory+gene+is+sufficient+to+alter+bacterial+host+range.">A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range.</a> Nature. 458, 215-218 (2009).</li><li>Grice, E. A., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skin+microbiome.">The skin microbiome.</a> Nat. Rev. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiont+recognition+and+subsequent+morphogenesis+as+early+events+in+an+animal-bacterial+mutualism.">Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism.</a> Science. 254, 1491-1494 (1991).</li><li>Jones, B., Nishiguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterillumination+in+the+Hawaiian+bobtail+squid,+Euprymna+scolopes+Berry+(Mollusca:+Cephalopoda).">Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda).</a> Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).</li><li>Graf, J., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+amino+acids+support+the+proliferation+of+symbiotic+bacteria.">Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).</li><li>Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+squid+that+glows+in+the+night:+development+of+an+animal-bacterial+mutualism.">A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism.</a> J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).</li><li>Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hawaiian+bobtail+squid+(Euprymna+scolopes):+a+model+to+study+the+molecular+basis+of+eukaryote-prokaryote+mutualism+and+the+development+and+evolution+of+morphological+novelties+in+cephalopods.">The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li><li>Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vibrio+fischeri-Euprymna+scolopes+symbiosis:+a+model+marine+animal-bacteria+interaction.">The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction.</a> Recent Advances in Marine Science and Technology. , (2001).</li><li>Boettcher, K. J., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depressed+light+emission+by+symbiotic+Vibrio+fischeri+of+the+sepiolid+squid+Euprymna+scolopes.">Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes.</a> J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).</li><li>Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+niche+for+Vibrio+logei,+the+predominant+light+organ+symbiont+of+squids+in+the+genus+Sepiola.">A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola.</a> J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).</li><li>Bose, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+rapid+evolution+of+the+luxR-luxI+intergenic+region+to+the+diverse+bioluminescence+outputs+of+Vibrio+fischeri+strains+isolated+from+different+environments.">Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

説明され植民地化アッセイは、制御された実験室環境での自然共生プロセスの分析が可能になります。このように、それは異なった自然の菌株によって、さまざまな化学物質制度の下で、変異株によるコロニー形成を評価するために使用することができます。記載の実験のバリエーションは、一般的に共生の異なる側面を評価するために使用されています。植民地化の動力学は、一致検出器が除去されたシンチレーションカウンターで自動的に検出することができます最初の24時間、時の発光を調べることによって測定することができます。さらに、別の相対的な1株の相対的な植民地化能力は動物のセット内の2つの系統の出力比は、入力比（異なる抗生物質耐性による差動検出、蛍光に正規化された、競争力のある植民地化アッセイにより測定することができます、または[LacZ遺伝子/ Xgal]マーカーの発色）。最後に、植民地化は、共焦点MICRによって直接撮像することができます。oscopy。 それは実験のために健全な少年のイカを使用することが重要です。貧しいイカの健康行動の指標は、（動物を安楽死させる）サークルで泳いで、または白のままと暗い面（注意して使用）を茶色にする彼らの色素胞を変更しない動物が含まれています。ホストの個体数の変動が存在するとして、動物の小さい番号を持つ反復実験の数が多いほど、しばしば大規模なサンプルサイズの反復実験の数が少ないよりも価値がある。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ガラス培養管、16ミリメートルの直径</td><td> VWR </td><td> 47729-580 </td><td></td></tr><tr><td>ガラスの培養管用キャップ</td><td>フィッシャー</td><td> NC9807998 </td><td></td></tr><tr><td> OD 600を決定するための可視分光光度計</td><td> Biowave </td><td> CO8000 </td><td> OD 600を測定することができる任意の分光光度計は動作します。このユニットは、ガラス培養チューブに液体を直接のOD 600を測定することができます。接種計算のいくつかの調整は、使用する機器に応じて必要となる場合があります。 </td></tr><tr><td> GloMax 20分の20シングルチューブルミノメーター</td><td>プロメガ</td><td> E5311 </td><td>ターナーアプライドバイオシステムズ20/20nルミノメーターと同等の。マイクロ遠心チューブホルダーが含まれています。 </td></tr><tr><td> GloMax 20分の20ライト標準</td><td>プロメガ</td><td> E5341 </td><td>ルミノメーターのキャリブレーションのために。 </td></tr><tr><td>屈折計、ハンドヘルド</td><td>フォスターとスミス水泳</td><td> CD-14035 </td><td>脱イオン水でそれぞれ使用前に校正します。塩ビルドアップを防止するために、脱イオン水で使用後は洗い流してください。 </td></tr><tr><td>インスタントオーシャン（人工海水の濃縮物） </td><td>フォスター＆スミス水泳</td><td> CD-16881 </td><td> 0.2μmのSFCAフィルターを介してフィルタし、屈折計を使用して、脱イオン水に35‰を準備します。 </td></tr><tr><td>ろ過ユニット</td><td>ナルゲン</td><td> 158-0020 </td><td>界面活性剤フリー酢酸セルロース（SFCA）膜、0.2μmである。我々はいくつかの界面活性剤を含むPESフィルターで変数の結果を観察した。 </td></tr><tr><td>転送ピペット</td><td>フィッシャー</td><td> 13から711 -9AM </td><td>ハサミやカミソリの刃を使用して、ピペットの先端の直径を増加させ、イカの孵化を圧迫を避けるために第一のリッジの上にきれいに先端を切った。 </td></tr><tr><td>使い捨てサンプルボウル（プラスチックタンブラー） </td><td>彗星</td><td> T9S（9オンス） </td><td>彼らはイカが低酸素ニッチの中に閉じ込められてしまうことができる全く底リムを持っていないので、上部の直径が3¼ &quot;、下の直径2¼&quot;、高さ3 &quot;の接種のためのボウルは、ボウルは、同種の環境を作成します。サイズが最適化されています40 mlの接種。webstaurantstore.comで入手可能、＃619PI9。 </td></tr><tr><td> ショウジョウバエバイアル</td><td> VWR </td><td> 89092-720 </td><td>バイアルの直径は、ルミノメーターのPMTの開口部に一致します。 </td></tr><tr><td> 1.5 mlのマイクロ遠心チューブ</td><td> ISC Bioexpress </td><td> C-3217-1CS </td><td>チューブは、杵の形状に合わせなければなりません。 </td></tr><tr><td>エタノール、200プルーフ</td><td>フィッシャー</td><td> BP2818から100 </td><td></td></tr><tr><td>乳棒</td><td>キンブルチェイス/ Kontes </td><td> 749521-1500 </td><td></td></tr><tr><td>メッキビーズ、直径5 mm </td><td>キンブルチェイス</td><td> 13500 5 </td><td>チューブ、オートクレーブあたり5を準備します。 </td></tr></tbody></table>

colonization of euprymna scolopes squid by vibrio fischeri

特定の細菌は、動物の組織1-5アソシエーションに記載されています。このようなホストベースの細菌アソシエーション（共生）、（病原性）有害であるなしフィットネスセンター結果（共​​生）を持っていない、または（相利共生）有益であることができます。注目は、病原体の相互作用に与えてきたが、少しは環境からの有益な/共生細菌の再現性の買収を決定するプロセスについて知られています。海洋グラム陰性菌の間に光臓器共生V.シャリとハワイボブテイルイカ、E. scolopesは 、1つのホスト（E. scolopes）は、その生涯6,7の過程を通じて一細菌種（V.シャリ ）との共生関係を確立するには高度に特異的な相互作用を表しています。 V.によって生成された生物発光この相互作用中にシャリは大腸菌に抗捕食性の利点を提供しています夜行性の活動中scolopesながら8,9、栄養豊富な宿主組織を提供しますV.保護されたニッチ10とシャリ 。各ホストの生成時に、この関係は、このように共生発展のさまざまな段階で詳細に評価することができる予測可能なプロセスを表す、recapitulatedされています。研究室では、少年イカハッチaposymbiotically（uncolonized）、および、最初の30-60分以内に収集され、シンビオント-free水に転送する場合には、実験的な接種6による場合を除いて植民地化することはできません。この相互作用は、このように環境11,12から共生微生物の具体的な買収につながる個々のステップを評価するためにする有用なモデルシステムを提供します。 ここでは、新たにaposymbiotic E.孵化したときに発生し植民地化の程度を評価する方法について説明します。 scolopesは含まれている（人工）海水にさらされているV.シャリ。このシンプルなアッセイは、予防接種、自然感染、およびリカバリについて説明します。E.の初期の光の臓器から共生細菌のscolopes。ケアは特に水質と光の合図に関しては、共生の開発中に動物のための一貫性のある環境を提供するために取られます。説明した共生の人口を特徴付けるための方法は、細菌由来の生物発光の（1）測定、回収共生のカウント（2）ダイレクトコロニーが含まれています。

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Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

メソッドは、ハワイアンボブテイルイカ手順を概説<em&gt; Euprymna scolopes</em&gt;とその共生細菌、<em&gt;ビブリオフィシャリ</em&gt;別々に調達し、細菌によってイカの光器官の特定の植民地化を可能にするために導入されています。細菌由来の発光によって、ダイレクトコロニーカウントによって植民地化の検出は、記載されています。

の植民地化 Euprymna scolopesイカでビブリオフィシャリ</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

colonization-of-euprymna-scolopes-squid-by-vibrio-fischeri

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

19.8K ビュー.  Northwestern University. メソッドは、ハワイアンボブテイルイカ手順を概説 Euprymna scolopesとその共生細菌、ビブリオフィシャリ別々に調達し、細菌によってイカの光器官の特定の植民地化を可能にするために導入されています。細菌由来の発光によって、ダイレクトコロニーカウントによって植民地化の検出は、記載されています。

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Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin synthesis. They also supply the host with a considerable amount of nutrients, making this ecosystem an essential metabolic organ. In the context of increasing evidence of the link between the gut flora and the metabolic syndrome, understanding the metabolic interaction between the host and its gut microbiota is becoming an important challenge of modern biology.1-4
 Colonization (also referred to as normalization process) designates the establishment of micro-organisms in a former germ-free animal. While it is a natural process occurring at birth, it is also used in adult germ-free animals to control the gut floral ecosystem and further determine its impact on the host metabolism. A common procedure to control the colonization process is to use the gavage method with a single or a mixture of micro-organisms. This method results in a very quick colonization and presents the disadvantage of being extremely stressful5. It is therefore useful to minimize the stress and to obtain a slower colonization process to observe gradually the impact of bacterial establishment on the host metabolism.
 In this manuscript, we describe a procedure to assess the modification of hepatic metabolism during a gradual colonization process using a non-destructive metabolic profiling technique. We propose to monitor gut microbial colonization by assessing the gut microbial metabolic activity reflected by the urinary excretion of microbial co-metabolites by 1H NMR-based metabolic profiling. This allows an appreciation of the stability of gut microbial activity beyond the stable establishment of the gut microbial ecosystem usually assessed by monitoring fecal bacteria by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis).6 The colonization takes place in a conventional open environment and is initiated by a dirty litter soiled by conventional animals, which will serve as controls. Rodents being coprophagous animals, this ensures a homogenous colonization as previously described.7
 Hepatic metabolic profiling is measured directly from an intact liver biopsy using 1H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spectroscopy. This semi-quantitative technique offers a quick way to assess, without damaging the cell structure, the major metabolites such as triglycerides, glucose and glycogen in order to further estimate the complex interaction between the colonization process and the hepatic metabolism7-10. This method can also be applied to any tissue biopsy11,12.

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

A progressive colonization procedure is described to further assess its impact on the host hepatic metabolism. Colonization is monitored non invasively by evaluating the urinary excretion of microbial co-metabolites by NMR-based metabolic profiling while hepatic metabolism is assessed by High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profiling of intact biopsy.

無菌マウスでのプログレッシブ植民地時代に肝代謝変化を評価する 1 H NMR分光法

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

免疫・感染学

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks to human and animal health. Among cereal production, maize is arguably the most affected crop, due to pathogen-induced losses in grain integrity and mycotoxin seed contamination. The two most prevalent and problematic mycotoxins for maize growers and food and feed processors are aflatoxin and fumonisin, produced by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides, respectively.
Recent studies in molecular plant-pathogen interactions have demonstrated promise in understanding specific mechanisms associated with plant responses to fungal infection and mycotoxin contamination1,2,3,4,5,6. Because many labs are using kernel assays to study plant-pathogen interactions, there is a need for a standardized method for quantifying different biological parameters, so results from different laboratories can be cross-interpreted. For a robust and reproducible means for quantitative analyses on seeds, we have developed in-lab kernel assays and subsequent methods to quantify fungal growth, biomass, and mycotoxin contamination. Four sterilized maize kernels are inoculated in glass vials with a fungal suspension (106) and incubated for a predetermined period. Sample vials are then selected for enumeration of conidia by hemocytometer, ergosterol-based biomass analysis by high performance liquid chromatography (HPLC), aflatoxin quantification using an AflaTest fluorometer method, and fumonisin quantification by HPLC.

The devastation of cereal crops by seed-infecting fungi has prompted numerous research efforts to better understand plant-pathogen interactions. To study seed-fungal interactions in a laboratory setting, we developed a robust method for the quantification of fungal reproduction, biomass, and mycotoxin contamination using kernel bioassays.

真菌の植民地、減数、およびカーネルのバイオアッセイを用いたマイコトキシンの生産の定量化

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - 遺伝的に変更する方法<em&gt;コレラ菌</em&gt;自然形質転換およびFLP組換えに基づき

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

肺炎球菌による鼻腔内コロニー形成時の炎症反応の特徴

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

使用肺炎球菌植民に対するプロバイオティクスの影響を調査<em&gt;体外</em&gt;接着アッセイ

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

リステリア単球遺伝子を用いた感染マウスにおける培養および心臓コロニー形成における心臓細胞の細菌浸潤の評価

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

の検出のためのより高感度で特異的な発色性寒天培地の開発<em&gt;腸炎ビブリオ</em&gt;その他<em&gt;ビブリオ</em&gt;種

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

グループBのマウスモデル<em&gt;連鎖球菌</em&gt;膣植民地化

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.

バイオタイプの維持と差別化に使用される実験技術<em&gt;コレラ（Vibrio cholerae）</em&gt;臨床分離株

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ability to obtain single cells for fluorescence microscopy, which can be particularly challenging when imaging cells that exist within bacterial communities. For example, the human pathogen Vibrio parahaemolyticus exists as short rod-shaped swimmer cells in liquid conditions that upon surface contact differentiate into a subpopulation of highly elongated swarmer cells specialized for growth on solid surfaces. This paper presents a method to perform single cell fluorescence microscopy analysis of V. parahaemolyticus in its two differential states. This protocol very reproducibly induces differentiation of V. parahaemolyticus into a swarmer cell life-cycle and facilitates their proliferation over solid surfaces. The method produces flares of differentiated swarmer cells extending from the edge of the swarm-colony. Notably, at the very tip of the swarm-flares, swarmer cells exist in a single layer of cells, which allows for their easy transfer to a microscope slide and subsequent fluorescence microscopy imaging of single cells. Additionally, the workflow of image analysis for demographic representation of bacterial societies is presented. As a proof of principle, the analysis of the intracellular localization of chemotaxis signaling arrays in swimmer and swarmer cells of V. parahaemolyticus is described.

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

This protocol enables single cell microscopy of the differentially distinct Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. The method produces a population of swarmer cells easily available for single cell analysis and covers preparation of cell cultures, induction of swarmer differentiation, sample preparation, and image analysis.

細胞分化および単細胞イメージングの誘導<em&gt;腸炎ビブリオ</em&gt;スイマーとスマーマー細胞

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

の植民地化 Euprymna scolopesイカでビブリオフィシャリ

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無菌マウスでのプログレッシブ植民地時代に肝代謝変化を評価する¹ H NMR分光法

真菌の植民地、減数、およびカーネルのバイオアッセイを用いたマイコトキシンの生産の定量化

TransFLP - 遺伝的に変更する方法

肺炎球菌による鼻腔内コロニー形成時の炎症反応の特徴

使用肺炎球菌植民に対するプロバイオティクスの影響を調査

リステリア単球遺伝子を用いた感染マウスにおける培養および心臓コロニー形成における心臓細胞の細菌浸潤の評価

の検出のためのより高感度で特異的な発色性寒天培地の開発

グループBのマウスモデル

バイオタイプの維持と差別化に使用される実験技術

細胞分化および単細胞イメージングの誘導