תודה נילי מלודי, ג'ון אלן, באזל Abuaita, ו דונה Runft על מאמציהם בסיוע לפיתוח המודל דג זברה. המחקר דיווחו כאן נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של מכוני הבריאות הלאומיים תחת מספרי פרס R21AI095520 ו- R01AI127390 (כדי ג'פרי ה Withey). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של ווין סטייט. שיטה זו תוארה לראשונה בשנת Runft. et al. 12
1. קביעת רמות קולוניזציה מעיים
הערה: קולוניזציה מעיים הוא מדד שימושי ביותר במודל דג זברה כמו זה יכול לשמש כדי להשוות את הכושר היחסי של זנים שונים נ' cholerae או את ההשפעות של מוטציות או הסתרה ג'ין.
<ol><li>חיסון של דג זברה על ידי טבילה הערה: פירוש של חשיפה דומה את המסלול הטבעי של זיהום.<ol>
<li>הכנת נ' cholerae
		<ol>
<li>לחסן מ ל מרק lysogeny (ליברות) עם מבודדים נ' cholerae המושבה מ LB צלחת, תקופת דגירה זה ב 37 ° C עם טלטול (180 סל ד) של 6-8 h (לילה תרבות).</li>
			<li>לחסן 25 מ של טרי בינוני LB בלוק בבקבוקון חרוט 250 מ עם 50 µL של התרבות לילה לעיל. תקופת דגירה זה של 16 – 18 h ב 37 ° C עם טלטול (150 סל ד).</li>
			<li>לקרוא את הצפיפות האופטית-600 nm (OD600) של 1/10 לדילול של התרבות לילה כדי להעריך את מספר החיידקים לכל mL (ה OD600 = 1 הוא ~ 109 CFU/mL.)</li>
			<li>הקציר התאים על ידי צנטריפוגה ב 6,000 g עבור 10 דקות להסיר את המדיה עם פיפטה או שופכים אותו לתוך פתרון החיטוי. Resuspend התאים ב- PBS סטרילי לריכוז הרצוי, בדרך כלל בין 1 x 107 עונה 1 פרק 1010 מ"ל ל- PBS. הערה: הנה, אנחנו מתייחסים מים אוסמוזה הפוכה בלוק המכיל מלחי ים 60 מ ג/ליטר כ סטרילי זיהום מים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
חיסון, דגירה
		<ol>
<li>מניחים דג זברה ארבעה או חמישה לתוך גביע 400 מ ל המכיל 200 מיליליטר מים דלקת סטרילית.</li>
			<li>להוסיף 1 מ"ל של נ' cholerae (מתוך שלב 1.1.1.4.) כדי להכניס את ריכוז זיהום הרצוי (בדרך כלל 5 x 104 ל- 5 x 107 CFU/mL) 200 מ של זיהום מים.</li>
			<li>לכסות את. הספל עם מכסה מחורר כדי למנוע את הדגים קופצים החוצה; העליון של תיבה עצה 200 µL עובד עליו היטב.</li>
			<li>תווית לכל כוס כימית, למקם אותם לתוך חממה חזית הזכוכית שוכן בגובה 28 º C משך זמן הניסוי.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
נוהל חשיפה חלוף הערה: חלוף חשיפה נ' cholerae (בדרך כלל 6 h) ואחריו הסרת של החיידק לחסן שימושית עבור הלומדים את השידור, כימות מדויקת יותר של החיידקים מופרש.<ol>
<li>לאחר 6 שעות של חשיפה, שופכים את המים הספל דרך מחוך כדי לאסוף את הדגים. למחוק את המים נגועים לתוך מכולה של אקונומיקה כדי להרוג את נ' cholerae.</li>
			<li>מניחים את הדג שהוסר ב גביע 200 מיליליטר מים דלקת סטרילית. לאפשר את הדגים לשחות במים נקיים זה עבור 5 דקות כדי להסיר את החיידקים משטח של הדג.</li>
			<li>חזור על הפעולות נטו (שלב 1.2.2) ומניחים את הדגים בתוך החדש של 200 מ ל סטרילי זיהום מים. לשמור את הדגים בתוך זה משך זמן הניסוי.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>המתת חסד
	<ol>
<li>כאשר הניסוי הגיעה נקודת הסיום הרצוי שלו, לקחת דגימה של הזיהום מים (15 מ ל היא בדרך כלל מספקות) כדי לאפשר מופרש ספירת חיידקים ועל המידה של שלשול (כגון mucin assay, תכולת החלבון ו/או יתר), אם הרצויה (סעיף 2).</li>
		<li>יוצקים את שארית המים דרך מחוך (כדי לאסוף את הדגים) לתוך אקונומיקה כדי להרוג את נ' cholerae במים.</li>
		<li>מניחים את הדג לתוך גביע המכילים זיהום מים בתוספת µg 336/mL של אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine), דגירה הדג בפתרון זה tricaine למשך 20 דקות ב- RT. הערה: רשת הדיג חיטוי עם פתרון 10% מלבין.</li>
	</ol></li>
	<li>דיסקציה
	<ol>
<li>הכנת דגים<ol>
<li>סקופ דג מחוץ הפתרון tricaine עם כפית פלסטיק חד פעמיות ומניחים אותו על פני השטח ויבתר.</li>
			<li>מיקום הדג עם הצד הבטני פונה כלפי מעלה, pin זה דרך הלסת התחתונה, עם הצד הקהה של ה-pin בזווית מהמרכז של הגוף. במקום אחר pin רק האחורי עד פי הטבעת, גם בזווית, והגוף.</li>
		</ol>
</li>
		<li>חשיפה של מערכת העיכול<ol>
<li>ספוגית (גחוני) של הדג עם מגבון נטולת טבול 70% אתנול.</li>
			<li>לחטא סכין ומספריים Vannas על ידי טובלים אותם 70% אתנול בוער להם.</li>
			<li>עושים חתך קטן לאורכו בבטן רק מתחת לעור על ידי חדירה המאזניים באמצעות את האזמל. תיזהרי לא לחתוך יותר מדי עמוק, כמו מערכת העיכול ממוקם בדיוק מתחת לעור.</li>
			<li>בעזרת המספריים, להרחיב את החתך בקפידה לאורך הגוף, חיתוך לא עמוק יותר מאשר רמת העור והימנעות פי הטבעת.</li>
			<li>לעשות שני חתכים לרוחב עם המספריים לכיוון הראש של הדג כדי לאפשר פתיחה של החתך.</li>
			<li>להצמיד את העור בכל צד של חתכים לרוחב השטח ויבתר לדוג את הסיכות החוצה מהגוף. הערה: הקצוות של הסיכות בעבר חיטוי על ידי שלהוב אותם עם אלכוהול.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
הסרה של מערכת העיכול הערה: מערכת העיכול צריך להיות גלוי כמו צינור חיוור, רזה מאוד על האיברים האחרים.<ol>
<li>להבה-לעקר את המלקחיים ולאחר מכן להשתמש בהם כדי להסיר את כל מערכת העיכול (בדרך כלל 12-15 מ"מ אורך). מקם את המעי לתוך צינור המגון המכילה חרוזי זכוכית (ראה שלבים 1.4.1–1.4.2) ו 1 מ"ל של 1 x PBS או LB, על קרח.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>המגון
	<ol>
<li>להכין הצינורות המגון מראש מאת g ~1.5 השוטף של חרוזי זכוכית 1 מ מ לתוך 2 mL צינורות פקקי בורג (למלא אותם בערך בחצי הדרך), ואז לחטא אותם על-ידי autoclaving.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של LB סטרילי או 1 x PBS.</li>
		<li>ברגע במעי דג זברה היו מוסף (שלב 1.3.3.1) את הצינורות, בורג הפקקים בחוזקה, ולאחר מכן לאבטח את צינורות מהמגן מערבולת.</li>
		<li>Homogenize הדגימות עבור 1 דקות על ההגדרה המרבי, ולאחר מכן מגניב אותם על קרח דק 1-2 לחזור מחזור המגון זה פעם נוספת עבור המגון מלאה. הערה: מספר שיטות חלופיות המגון גם יעבוד.</li>
	</ol></li>
	<li>לכימות קולוניזציה מעיים רמות
	<ol>
<li>להכין צינורות (מבחנות זכוכית קטנים או צינורות microcentrifuge 1.5 mL) דילול homogenate טורי על-ידי הוספת µL 900 ק ג או 1 x PBS כל שפופרת. עבור כל דג, להכין 5 – 6 צינורות ולעשות דילולים טורי 10-fold של homogenate המעי על ידי הוספת µL 100 של homogenate הרכבת התחתית הראשונה, vortexing זה לערבב ולאחר מכן הוספת 100 µL ברכבת התחתית הראשונה הצינור השני.</li>
		<li>חזור על הליך זה עד דילולים כל היה מוכן.</li>
		<li>צלחת 100-200 µL של כל דילול על פלטות אגר LB המכיל 100 µg/mL של סטרפטומיצין (אם משתמשים זנים עמידים בפני סטרפטומיצין) ו- µg/mL 40 של X-גל (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). דגירה הלוחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h.</li>
		<li>לאחר לילה הדגירה, לספור מושבות נ' cholerae על הלוחות, באמצעות מונה הניתן המושבה אוטומטית או ידנית לספור את המושבות; זה עוזר לסמן את המושבות שנספרו עם טיפ סמן.</li>
		<li>לקבוע את CFU לכל דג המעי על ידי הכפלת הרוזן צלחת הגורם דילול של ההשעיה, לוקח בחשבון את עוצמת הקול זה היה מצופה.</li>
	</ol></li>
</ol>2. מדידה של דגים שלשול
הערה: ארבעה מדדים שונים שימשו להערכת דגים שלשול: רמות mucin המים, את רמות החלבון המופרשת הכוללת את המים, את יתר600 של המים, את נ' cholerae CFU מים13. שלשול בדרך כלל הופך להיות ראייה ברורה כ 6 שעות לאחר החשיפה של דג זברה כדי נ' cholerae כמתואר לעיל.
<ol><li>
לקבוע רמות mucin הערה: הפרשת Mucin הנגרמת במהלך הקולוניזציה נ' cholerae , הוא מדד טוב של רמות הפרשה, ובמיוחד בתחילת זיהום13. Mucin וזמינותו הינה וריאציה על החומצה המחזורית microtiter assay שיף19.<ol>
<li>להכין את החומרים הבאים: 50% (w/v) חומצה המחזורית פתרון מניות ו- 0.1% חומצה המחזורית הפתרון עובד (µL 10 של המניה המחזורית חומצה 50% יתווספו 5 מ ל חומצה אצטית 7% — להשתמש מיד לאחר ביצוע), mucin סטנדרטים, 96-ובכן microtiter צלחות, שיף מגיב.<ol>
<li>הכנת תקנים mucin על ידי השעיית הכמויות הבאות של mucin (מתוך הבטן חזירי סוג III) במאגר אצטט נתרן (100 מ מ סודיום אצטט, 5 מ מ EDTA, pH ל 5.5 עם חומצה אצטית): 400 µg/mL 300 µg/mL, 200 µg/mL, 150-µg/mL , µg 100/mL, µg 75/mL, µg 50/mL, µg 25/mL ו- 10 µg/mL. להכין הצלחת על-ידי הוספת µL 100 של זיהום מים כל טוב זה ישמש בבית וזמינותו כדלקמן: ריק 1 x PBS; סטנדרטים mucin כמתואר לעיל, או דגימת מים מן הזיהום דגים. כל מדגם דולר.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להוסיף 50 µL טריים 0.1% חומצה המחזורית לפתרון אחד טוב עם פיפטה רב-ערוצי ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים.</li>
		<li>עוטף את הצלחת היטב בניילון נצמד, דגירה זה ב 37 ° C עבור h 1-1.5.</li>
		<li>מגניב את הצלחת עד בטמפרטורת החדר במשך 5-10 דקות להוסיף 100 µL Fuchsin פתרון (ריאגנט של שיף) כל טוב, וכל pipet למעלה ולמטה כדי לערבב את הכל.</li>
		<li>עוטף את הצלחת בניילון נצמד, דגירה זה בטמפרטורת החדר על פלטפורמה נדנדה עד צבע פיתחה; הצבע הוא פותח בדרך כלל בתוך 20 דקות לקרוא את ספיגת-560 nm שימוש בקורא צלחת.</li>
		<li>להתוות עקומה סטנדרטי mucin (OD560לעומת µg/mL mucin רגיל). לקבוע את רמות mucin הנעלמים על ידי זיהוי איפה OD560 נודע לכל נופל על העקומה רגיל ולקרוא את הריכוז mucin המתאים עבור ערך זה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לקבוע רמות החלבון הערה: מלבד mucin, הכולל רמות חלבון במים הם proxy נוספת עבור הרמות של שלשול (צואה מעונן, נוזלי) המיוצר על ידי הדג. הליך זה משתמש assay ברדפורד סטנדרטיים כדי להעריך את רמות החלבון. רמות החלבון מוערך על פי עיקול רגיל אלבומין שור (BSA).<ol>
<li>מערבבים 100 µL של אחד הסטנדרטים BSA (ראה הערה להלן) או 100 µL של זיהום מים (מים מן כשהספל המכיל דגים נגועים) עם µL 900 של ברדפורד ריאגנט assay (פירס חלבון assay הכימית עובד עליו היטב) ב cuvette חד פעמיות. דגירה כל דוגמאות בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. הערה: תקני BSA הבאים שימשו: 1,800 µg/mL 1,000 µg/mL, µg 750/מ"ל, 500 µg/mL, µg 250/mL, µg 125/mL, µg 50/mL, 25 µg/mL. הסטנדרטים BSA היו מדולל במים מזוקקים בלוק.</li>
		<li>לקרוא את יתר660 של כל תקן או לטעום אותם באמצעות ספקטרופוטומטרים.</li>
		<li>מגרש העקומה סטנדרטי BSA (OD660לעומת µg/mL). לקבוע את רמות החלבון של הנעלמים על-ידי זיהוי איפה OD660 נודע לכל נופל על העקומה סטנדרטי BSA ולקרוא את הריכוז mucin המתאימים ביותר עבור ערך זה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מדד יתר600 הערה: הנוכחות של שלשול (צואה מעונן, נוזלי) ניכרת בעליל לאחר מספר h ונחישות פשוט OD600 יכול לשמש כדי לכמת את זה.<ol>
<li>היפוך הצינור המכיל את זיהום המים מספר פעמים לפיזור אחיד של התוכן. להוסיף 1 מ"ל של דגימת מים cuvette חד פעמיות. השתמש 1 מ"ל של מים דלקת סטרילית של הפקד שלילי.</li>
		<li>לבצע מדידה "ריק" באמצעות את ספקטרופוטומטרים ב 600 nm באמצעות המדגם שליטה שלילי. לקרוא כל מדגם המים ב 600 nm ולהקליט התוצאות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
קביעת מופרש נ' cholerae CFU/mL לאחר ההדבקה הערה: מרכיב עיקרי של השלשול שמפיק את דג זברה מופרש נ' cholerae. הקביעה של CFU/mL יכול לשמש למטרות כגון הערכת את שכפול חיידקים דגים העיכול וכן מידת המינון זיהומיות בניסויים שידור. פעולה זו נעשית כאשר זיהום חלוף התרחש. אם זיהום 24 שעות ביממה, וזמינותו הזה ימדוד את inoculum משולב בתוספת של excreted נ' cholerae.<ol>
<li>קח דגימת מים בנקודת הזמן הרצויים, באופן סדרתי למהול אותו כפי שתואר לעיל.</li>
		<li>לוחית רישוי של דילולים טורי במדיה סלקטיבית (המכיל סטרפטומיצין או אנטיביוטיקה מתאימה נוספת או DCLS אגר ליברות), דגירה אותם ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.</li>
		<li>לספור את המושבות. לחשב את CFU לכל מיליליטר מים כפי שמתואר בשלב 1.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera.">Cholera.</a> The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).</li><li>Dutta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+non-O1,+non-O139+serogroups+and+cholera-like+diarrhea,+Kolkata,+India.">Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India.</a> Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (2013).</li><li>Huq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+relationships+between+Vibrio+cholerae+and+planktonic+crustacean+copepods.">Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 45 (1), 275-283 (1983).</li><li>Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturable+and+VBNC+Vibrio+cholerae:+interactions+with+chironomid+egg+masses+and+their+bacterial+population.">Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population.</a> Microbial Ecology. 53 (2), 285-293 (2007).</li><li>Broza, M., Halpern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+reservoirs.+Chironomid+egg+masses+and+Vibrio+cholerae.">Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae.</a> Nature. 412 (6842), 40 (2001).</li><li>Halpern, M., Izhaki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+as+hosts+of+Vibrio+cholerae.">Fish as hosts of Vibrio cholerae.</a> Frontiers in Microbiology. 8 (282), (2017).</li><li>Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+as+reservoirs+and+vectors+of+Vibrio+cholerae.">Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae.</a> PLoS ONE. 5 (1), e8607 (2010).</li><li>Traore, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Vibrio+cholerae+in+fish+and+water+from+a+reservoir+and+a+neighboring+channel+in+Ouagadougou,+Burkina+Faso.">Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso.</a> The Journal of Infection in Developing Countries. 8 (10), 1334-1338 (2014).</li><li>Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Vibrio+cholerae+non-01+from+a+Somerset+farmworker+and+his+tropical+fish+tank.">Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank.</a> Journal of Infection. 20 (1), 55-57 (1990).</li><li>Torres-Vitela, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+Vibrio+cholerae+in+fresh+fish+and+ceviche+in+Guadalajara,+Mexico.">Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico.</a> Journal of Food Protection. 60 (3), 237-241 (1997).</li><li>Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+zoonotic+aquatic+pathogens.">Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 46 (1), 96-107 (2014).</li><li>Runft, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+natural+host+model+for+Vibrio+cholerae+colonization+and+transmission.">Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).</li><li>Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Vibrio+cholerae+enterotoxicity+in+a+zebrafish+infection+model.">Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model.</a> Applied and Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Klose, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+suckling+mouse+model+of+cholera.">The suckling mouse model of cholera.</a> Trends in Microbiology. 8 (4), 189-191 (2000).</li><li>Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn, H., Sprinz, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+with+Vibrio+cholerae+in+the+ligated+loop+of+the+rabbit+intestine.">Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine.</a> British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).</li><li>Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diarrhea+and+accumulation+of+intestinal+fluid+in+infant+rabbits+infected+with+Vibrio+cholerae+in+an+isolated+jejunal+segment.">Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment.</a> The Journal of Infectious Diseases. 120 (6), 645-651 (1969).</li><li>Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+adult+rabbit+model+for+Vibrio+cholerae+and+enterotoxigenic+Escherichia+coli+diarrhea.">Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea.</a> Infection and Immunity. 32 (2), 739-747 (1981).</li><li>Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+to+the+future:+studying+cholera+pathogenesis+using+infant+rabbits.">Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li><li>Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+acid-Schiff's+reagent+assay+for+carbohydrates+in+a+microtiter+plate+format.">Periodic acid-Schiff's reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 18-26 (2011).</li><li>Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+of+non+O1,+non+O139+Vibrios+isolated+from+fresh+water+bodies+in+Vellore,+south+India.">Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India.</a> Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).</li><li>Hasan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontoxigenic+Vibrio+cholerae+non-O1/O139+isolate+from+a+case+of+human+gastroenteritis+in+the+U.S.+Gulf+Coast.">Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 9-14 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

דג זברה היא מודל חדש יחסית ללמוד נ' cholerae אך טומן בחובו הרבה הבטחה הגילוי העתידי של היבטים לא מוכרת של נ' cholerae ביולוגיה ו פתוגנזה11,12,13 . המודל דג זברה למבוגרים יש את היתרונות של להיות טבעי שני מארח נ' cholerae המכיל microbiota מעיים ללא פגע, בוגרת ומודל סביבתיים. החסרונות של המודל הם שני הגורמים העיקריים התקפה אלימה אנושי, הרעלן כולרה, הרעלן-coregulated pilus, אינם נדרשים עבור דג זברה מושבת או פתוגנזה12. עם זאת, זה יכול לחלופין כתוצר יתרון נוסף המאפשרים יכולת הזיהוי של הרומן נ' cholerae קולוניזציה גורמים וכדי להקל על המחקר של רעלים אחרים נ' cholerae . זה רלוונטי במיוחד על הרוב המכריע של הלא-O1/O139 סביבתית" נ' cholerae זנים, אשר רובם לא לייצר רעלן כולרה או רעלן-coregulated pilus, עדיין יכול עדיין לגרום מחלות20,21.
סביר להניח להיווצר באמצעות מודל זה הבעיות קשורות את microbiota מעיים שופע. ציפוי במדיה nonselective יגרום מודל זה בעצם בלתי שמיש כפי שזה יהיה בלתי אפשרי לזהות את המושבות נ' cholerae . אפילו באמצעות מדיה סלקטיבית או סלקטיבי חלקית כגון LB פלוס סטרפטומיצין או DCLS, רקע של מושבות של המעי microbiota יהיה נוכח. זה חיוני כדי לוודא המושבות להיות הנספרות שלהם בתום-לב נ' cholerae על ידי תיקון המושבות המיוצר על ציפוי במדיה פחות סלקטיבי על גבי מדיום מאוד סלקטיבי כגון TCBS. לחלופין, ההוספה של סמן סלקטיבית יותר לתוך הגנום של זן של עניין מפשטות מאוד הזיהוי של נ' cholerae מ homogenates מעיים.
היתרון מבחני משמש לכמת שלשול דג זברה היא שהם פשוט וזול לבצע13. החיסרון הוא כי מבחני אלה הן במידה רבה ספציפי, מלבד לספור מופרש נ' cholerae CFU ישירות, זה יכול להיות קשה לקבוע אם השלשול הוא כתוצאה ישירה נ' cholerae פתוגנזה, או כמה הלחץ אחרים . הפיתוח של וריאציות של אלה או אחרים מבחני לשיפור שלהם צפויה ירידה לפרטים לסייע בעתיד מדידות של נ' cholerae פתוגנזה דג זברה.

ויבריו cholerae הוא חיידק הימית, גראם שליליים, הגורמת של מחלות אנושיות כולרה, כמו גם שלשול נמשך "טפטוף"1,2. (פ') cholerae נמצא בסביבה בתחומים רבים של העולם, קשורה לעיתים קרובות עם אורגניזמים ימיים אחרים. אורגניזמים שיוך אלה כוללים פלנקטון, ביצה חרקים ההמונים, רכיכה חוליות דגים מינים3,4,5,6,7. מספר מחקרים שללו נ' cholerae מ ספינלי מעיים של דגים ב אזורים גאוגרפיים שונים7,8,9,10. הנוכחות של נ' cholerae בדגים מציין כי דגים עשוי לפעול כמו מאגר הסביבה. גם יכול להיות מעורב דגים בהעברת המחלה לבני, פיזור גיאוגרפי נ' cholerae זנים6.
כדי להבין טוב יותר איך נ' cholerae אינטראקציה עם דגים, רזבורה rerio, הידועה יותר בשם דג זברה, פותחה כמערכת מודל לימוד נגד כולרהe11. דג זברה הם ילידי דרום אסיה, כולל באזור מפרץ בנגל, אשר נחשב מאגר המוקדם של נ' cholerae. עד הראשון כולרה מגיפה בשנת 1817, כולרה לא דווח כי מחוץ מה שעכשיו הודו ובנגלדש. לכן, דג זברה, נ' cholerae כמעט בוודאות הקשורים אחד לשני על סולמות אבולוציוני, רומז כי דג זברה הם שורה נ' cholerae הסביבה הטבעית12.
דג זברה המודל נ' cholerae פשוטה לביצוע והוא יכול לשמש כדי לחקור את כל פתוגניים נ' cholerae מחזור החיים. דגים נחשפים נ' cholerae על ידי רחצה במים אשר חיסנה עם מספר ידוע של נ' cholerae. בתוך מספר שעות, קולוניזציה מעיים מתקיים, ואחריו את הייצור של שלשול. שלשול מורכב mucin, חלבונים, החיידקים מופרש ותוכן מעיים אחרים. ניתן לכמת את מידת שלשול באמצעות מדידות פשוטות מספר13. (פ') cholerae זה יש כבר מופרש על ידי דגים נגועים יכול להמשיך להדביק לדגים נאיביים, להשלמת המעגל זיהומיות. לפיכך, המודל דג זברה recapitulates נ' cholerae מחלות אנושיות תהליך12,14.
בשימוש לעתים קרובות ביותר נ' cholerae חייתיים היו עכברים וארנבות,14,15,16,17,18. מודלים אלה סייעו בהוספת לידע שלנו של נ' cholerae פתוגנזה. עם זאת, כי עכברים וארנבות, אינם טבעיים נ' cholerae מארחים, קיימות מגבלות אילו היבטים של מחזור חיי נ' cholerae יכול להילמד. הקולוניזציה נ' cholerae של עכברים וארנבות, דורש בדרך כלל העדר של microbiota מעיים או רעלני באנטיביוטיקה כדי לפגוע microbiota של המעי. שני הדגמים דורשים gavage להציג לחיידקים מערכת העיכול או מניפולציה כירורגי ישירות להחדיר את החיידקים לתוך המעיים. דג זברה יש יתרון בכך דג בוגר עם microbiota מעיים ללא פגע הם התנחלו בקלות תהליך זיהומיות קורה באופן טבעי, ללא כל פעולה הדרושה.
העבודה הנוכחית ממחישה את הניצול של דג זברה כמודל באיזמיר נ' cholerae זיהום. הזיהום, דיסקציה, ספירה של להמדינות נ' cholerae, כימות של שלשול הנגרם על ידי נ' cholerae יהיה לתאר12,13. מודל זה סביר להניח שתהיה שימושית למדענים מעוניין תהליך המחלה נ' cholerae והן בסגנון נ' cholerae סביבתיים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific, Edison, NJ</td>
			<td>Excella E25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>NUAIRE, Plymouth, MN</td>
			<td>Auto Flow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo, Waltham, MA</td>
			<td>Geaesys 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex homogenizer</td>
			<td>Minibeadbeater24</td>
			<td>112011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Machine</td>
			<td>Ohaus, Columbia, MD</td>
			<td>Adventurer Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Stirer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>automated colony counter</td>
			<td>REVSCI</td>
			<td>120417B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 ml glass beakers</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perforated lids</td>
			<td>Microtip holder with holes from tip box</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable plastic spoons</td>
			<td>Office Depot, Boca Raton, FL</td>
			<td>D15-25-7008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish Tank System</td>
			<td>Aquaneering, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RO Water Purifier</td>
			<td>Aqua FX</td>
			<td>TK001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish net</td>
			<td>Marina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fish food</td>
			<td>Tetra fin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine Shrimp</td>
			<td>Red jungle brand</td>
			<td>O.S.I. pro 80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td>
			<td>10000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td>
			<td>11223-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td>
			<td>15000-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml screw cap tubes</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>02-681-375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm glass beads</td>
			<td>Bio Spec</td>
			<td>11079110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads for spreading</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>18406-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate</td>
			<td>Fisher Brand, Hampton, NH</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml centrifuge tube</td>
			<td>Midsci, Valley Park, MO</td>
			<td>AVSS1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning Falcon, Corning, NY</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>9820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipette</td>
			<td>Fisher Brand, Hampton, NH</td>
			<td>13675K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pipettes</td>
			<td>Sartorius Biohit, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>m1000/m200/m20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td>
			<td>24-150RS/24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>VWR Life Science, Radnor, PA</td>
			<td>K813-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>10651745001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>84655-250 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>periodic acid</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>10450-60-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin from porcine stomach</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>M2378-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>9046-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660nm Protein Assay Reagent</td>
			<td>Thermo, Waltham, MA</td>
			<td>22660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teast Extract</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NACL</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCBS Agar</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>265020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCLS Agar</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>70135-500gm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft office</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying vibrio cholerae colonization and diarrhea in the adult zebrafish model

ויבריו cholerae ידועה בתור הסוכן זיהומיות הגורמת הכולירע מחלות אנושיות. בחוץ הפונדקאי. האנושי, נ' cholerae בעיקר קיימת בסביבה המימית, איפה זה מקיים אינטראקציה עם מגוון מינים ימיים גבוה יותר. דגים חוליות ידועים להיות מארח הסביבה והם פוטנציאל נ' cholerae מאגר בטבע. גם נ' cholerae וגם מיני דגים teleost רזבורה rerio, הידוע בכינויו דג זברה, מקורן היבשת ההודית, רומז על אינטראקציה ארוכת שנים בסביבות מימיות. דג זברה הם אורגניזם מודל אידיאלי ללמוד היבטים רבים של ביולוגיה, כולל מחלות זיהומיות. דג זברה יכול בקלות, במהירות קולוניה נ' cholerae לאחר חשיפה במים. קולוניזציה מעיים מאת נ' cholerae מוביל את הייצור של שלשול הפרשה של משוכפלים נ' cholerae. אלה מופרש חיידקים יכולים אז קדימה ליישב פונדקאים חדשים של דגים. כאן, אנחנו מדגימים כיצד להעריך נ' cholerae-קולוניזציה מעיים דג זברה ואיך לכמת נ' cholerae-induced דג זברה שלשול. המודל קולוניזציה צריך להועיל לחוקרים הלומדים אם הגנים של עניין עשוי להיות חשוב עבור המארח קולוניזציה ו/או להישרדות סביבתיים. כימות של דג זברה שלשול צריך להיות שימושי החוקרים ללמוד כל פתוגן מעיים המעוניינים לחקור את דג זברה כמערכת מודל.

(פ') cholerae התיישבות ספינלי מעיים דג זברה
כדי לספק דוגמה של רמות קולוניזציה אופייני שלנו להתבונן, אנחנו מחוסן 5 x 106 CFU של מגיפת באל תור נ' cholerae המתח N16961 ב 200 מ של מים בתוך המכיל מספר דג זברה. לאחר 6 שעות של זיהום, הדגים היו נשטפים במים מתוקים והועבר לתוך גביע 200 מיליליטר מים זיהום בלוק כמפורט בפרוטוקול. 18 h לאחר העברה (או 24 שעות לאחר ההדבקה העיקרית), הדגים היו מורדמים, והמעיים שלהם נלקחו כדי לקבוע את רמות קולוניזציה. כ 105 עד6 10 נ' cholerae תאי המעי דגים נצפו בדרך כלל ב- מערכת העיכול 24 שעות לאחר הפגיעה (מדד מחירי הבתים של) (איור 1) עם 5 x 106 inoculum גודל.
כימות של דגים שלשול
שלשול היה לכמת באמצעות את מבחני פשוטה ארבע שתוארו לעיל. הבדיקה הראשונה, CFU של מופרש נ' cholerae, מוצג באיור1. דילולים טורי של המים 24 מדד מחירי הבתים של מצופים לספור את נ' cholerae CFU. בדרך כלל הם נצפו רמות גבוהות יחסית של מופרש נ' cholerae ; בדוגמה זו, כ 105 נ' cholerae לכל מיליליטר מים זוהו. דגים נגוע אינם מייצרים detectible נ' cholerae (נתונים לא מוצג).
וזמינותו השני משמש לכמת שלשול הוא מופרש mucin. איור 2 מציג ההשפעות של שלושה שונים נ' cholerae זיהומיות מינונים על רמות mucin במים מדד מחירי הבתים של 24 שעות ביממה. מינון גבוה יותר זיהומיות הוא מתואם עם הפרשת mucin גבוהה יותר למים. פקד, ארבעה דגים היו ממוקמים בתוך הספל זהה מים, אך PBS נוספה במקום נ' cholerae ההשעיה. הדג שליטה מופרש mucin מעט מאוד.
וזמינותו כמת diarrheal השלישי הוא ה OD600 של המים 24 מדד מחירי הבתים. כפי שמוצג באיור3, ה OD600 של מים אלה היה גבוה משמעותית במיכל המכיל דג זברה נגוע נ' cholerae מאשר במיכל המכיל דג זברה נגוע.
לבסוף, נמדדו רמות החלבון הכולל במים. מים המכילים דגים נגועים הכיל רמות החלבון הכולל כמעט כפול שתצפית במים המכיל את הדגים נגוע (איור 4). באופן קולקטיבי, מבחני ארבע אלה להדגים את השפעת זיהום נ' cholerae יש על דג זברה הפרשה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57767/57767fig1.jpg"> איור 1: קולוניזציה מעיים של דג זברה מאת נ' cholerae. הדגים היו נגוע במשך 6 שעות, ואז לשטוף, מודגרות בסך 24 שעות ביממה. הצד השמאלי של האיור מדגים את CFU הכולל לכל המעי של ארבעה דגים (נקודות שחורות). הצד הימני של הדמות מציין נ' cholerae CFU לכל mL נמדד במדד מחירי הבתים של מים 24 (ריבועים שחורים). האמצעי של שתי קבוצות נתונים מוצגים עם קו אופקי גדול, סטיית התקן מסומנים באמצעות קווי שגיאה. <a href="/files/ftp_upload/57767/57767fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57767/57767fig2.jpg"> איור 2: Mucin assay. שלושה שונים נ' cholerae מינונים זיהומיות שימשו, יחד עם פקד נגוע, כפי שמצוין תחת ה- x-ציר. ערכי כלומר mucin זוהה בתוך המים על ידי החומצה המחזורית ששונה assay שיף (PAS) מסומנים באמצעות בפסי שחור מעל כל מנה זיהומיות. קווי השגיאה מצביעות על סטיית התקן. הכוכביות מציינות p < 0.05 כפי שנקבע על ידי תלמיד של אינטראקצית-t-test. <a href="/files/ftp_upload/57767/57767fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57767/57767fig3.jpg"> איור 3: OD600 assay כמדד נגד שלשול. ה OD600 של 1 מ"ל מים בקבוקונים המכילים גם נ' cholerae נגוע או דגים נגוע נמדדה. בפסי שחור לציין את הערך הממוצע וציין קווי השגיאה סטיית התקן. הכוכביות מציינות p < 0.05 כפי שנקבע על ידי תלמיד של אינטראקצית-t-test. <a href="/files/ftp_upload/57767/57767fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57767/57767fig4.jpg"> איור 4: סה כ רמות החלבון במים. החלבון הכולל הוערך על ידי שיטת ברדפורד כמתואר. בפסי שחור מציינים את הערכים רשע וציין קווי השגיאה סטיית התקן. הכוכביות מציינות p < 0.05 כפי שנקבע על ידי תלמיד של אינטראקצית-t-test. <a href="/files/ftp_upload/57767/57767fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model at JoVE.com

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

דג זברה הם טבעיים ויבריו cholerae לארח והוא יכול לשמש מסכם את הדברים וללמוד כל מחזור זיהומיות של קולוניזציה שידור. כאן, אנחנו מדגימים כיצד להעריך נ' cholerae קולוניזציה רמות ולכמת שלשול אצל דג זברה.

לכימות ויבריו cholerae קולוניזציה ושלשולים במודל דג זברה למבוגרים

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

quantifying-vibrio-cholerae-colonization-diarrhea-adult-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

8.3K Views.  Wayne State University School of Medicine. דג זברה הם טבעיים ויבריו cholerae לארח והוא יכול לשמש מסכם את הדברים וללמוד כל מחזור זיהומיות של קולוניזציה שידור. כאן, אנחנו מדגימים כיצד להעריך נ' cholerae קולוניזציה רמות ולכמת שלשול אצל דג זברה.

Video: Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin synthesis. They also supply the host with a considerable amount of nutrients, making this ecosystem an essential metabolic organ. In the context of increasing evidence of the link between the gut flora and the metabolic syndrome, understanding the metabolic interaction between the host and its gut microbiota is becoming an important challenge of modern biology.1-4
 Colonization (also referred to as normalization process) designates the establishment of micro-organisms in a former germ-free animal. While it is a natural process occurring at birth, it is also used in adult germ-free animals to control the gut floral ecosystem and further determine its impact on the host metabolism. A common procedure to control the colonization process is to use the gavage method with a single or a mixture of micro-organisms. This method results in a very quick colonization and presents the disadvantage of being extremely stressful5. It is therefore useful to minimize the stress and to obtain a slower colonization process to observe gradually the impact of bacterial establishment on the host metabolism.
 In this manuscript, we describe a procedure to assess the modification of hepatic metabolism during a gradual colonization process using a non-destructive metabolic profiling technique. We propose to monitor gut microbial colonization by assessing the gut microbial metabolic activity reflected by the urinary excretion of microbial co-metabolites by 1H NMR-based metabolic profiling. This allows an appreciation of the stability of gut microbial activity beyond the stable establishment of the gut microbial ecosystem usually assessed by monitoring fecal bacteria by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis).6 The colonization takes place in a conventional open environment and is initiated by a dirty litter soiled by conventional animals, which will serve as controls. Rodents being coprophagous animals, this ensures a homogenous colonization as previously described.7
 Hepatic metabolic profiling is measured directly from an intact liver biopsy using 1H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spectroscopy. This semi-quantitative technique offers a quick way to assess, without damaging the cell structure, the major metabolites such as triglycerides, glucose and glycogen in order to further estimate the complex interaction between the colonization process and the hepatic metabolism7-10. This method can also be applied to any tissue biopsy11,12.

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

A progressive colonization procedure is described to further assess its impact on the host hepatic metabolism. Colonization is monitored non invasively by evaluating the urinary excretion of microbial co-metabolites by NMR-based metabolic profiling while hepatic metabolism is assessed by High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profiling of intact biopsy.

הערכת שינויים מטבוליים כבדית במהלך להתיישבות מתקדמת של עכבר נבט בחינם על ידי 1 H NMR ספקטרוסקופיה

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

קולוניזציה של Euprymna scolopes קלמארי על ידי Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - שיטה גנטית לשינוי<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; בהתבסס על שינוי הטבעי וFLP-רקומבינציה

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

חוקר את ההשפעות של פרוביוטיקה על דלקת ריאות התיישבות שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay דבקות

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have been developed that permit engraftment of normal and malignant cells into irradiated, syngeneic, and immune compromised adult zebrafish. These models when coupled with optimized cell transplantation protocols allow for the rapid assessment of stem cell function, regeneration following injury, and cancer. Here, we present a method for cell transplantation of zebrafish adult skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS), a pediatric sarcoma that shares features with embryonic muscle, into immune compromised adult rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. Importantly, these animals lack T cells and have reduced B cell function, facilitating engraftment of a wide range of tissues from unrelated donor animals. Our optimized protocols show that fluorescently labeled muscle cell preparations from &#945;-actin-RFP transgenic zebrafish engraft robustly when implanted into the dorsal musculature of rag2 homozygous mutant fish. We also demonstrate engraftment of fluorescent-transgenic ERMS where fluorescence is confined to cells based on differentiation status. Specifically, ERMS were created in AB-strain myf5-GFP; mylpfa-mCherry double transgenic animals and tumors injected into the peritoneum of adult immune compromised fish. The utility of these protocols extends to engraftment of a wide range of normal and malignant donor cells that can be implanted into dorsal musculature or peritoneum of adult zebrafish.

Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells.

השתלת תאי שריר נורמלית וממאירים לחיסון חלש למבוגרים דג הזברה

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

פיתוח בינוני אגר chromogenic רגיש וספציפי יותר לצורך זיהוי של<em&gt; Parahaemolyticus Vibrio</em&gt; ו אחר<em&gt; Vibrio</em&gt; מינים

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

מודל Murine של הקבוצה B<em&gt; סטרפטוקוקוס</em&gt; נרתיקי Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.

טכניקות מעבדה המשמשות לשמירה על ביו-טיפוסים של<em&gt; ויבריו כולרה</em&gt; בידוד קליני ואיכותי

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...