Graças a melodia Neely, Jon Allen, Abuaita de Basileia e Donna Runft por seus esforços em ajudar a desenvolver o modelo de zebrafish. A pesquisa relatada aqui foi apoiada pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas do institutos nacionais da saúde sob números do prêmio R21AI095520 e R01AI127390 (para Jeffrey H. Withey). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Wayne State University. Esse método foi descrito pela primeira vez em Runft et al . 12
1. determinação dos níveis de colonização Intestinal
Nota: Colonização Intestinal é a métrica mais útil no modelo de zebrafish como ele pode ser usado para comparar a adequação relativa de diversas variedades de V. cholerae ou os efeitos de mutações ou nocautes de gene.
<ol><li>Inoculação de zebrafish por imersão Nota: Este meio de exposição assemelha-se o curso natural da infecção.<ol>
<li>Preparação do V. cholerae
		<ol>
<li>Inocular 5ml de caldo lisogenia (LB) com um isolado V. cholerae colônia de um LB da placa e incubar a 37 ° C, com agitação (180 rpm) para 6-8 h (cultura durante a noite).</li>
			<li>Inocule 25 mL de meio fresco de LB esterilizado em um Erlenmeyer de 250 mL com 50 µ l de cultura acima durante a noite. Incube-16 – 18 h a 37 ° C, com agitação (150 rpm).</li>
			<li>Ler a densidade óptica em 600 nm (OD600) de uma diluição de 1/10 da cultura durante a noite para estimar o número de bactérias por mL (o OD600 = 1 é 10 ~9 UFC/mL.)</li>
			<li>Colher as células por centrifugação a 6.000 g durante 10 min. remover a mídia com uma pipeta ou derramá-lo fora em uma solução desinfetante. Ressuspender as células em PBS estéril para a concentração desejada, tipicamente entre 1 x 107 a 1 x 1010 por ml de PBS. Nota: Aqui, nos referimos a autoclavado osmose reversa água contendo sais de 60 mg/L do mar como água estéril de infecção.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Inoculação e incubação
		<ol>
<li>Colocar um copo de 400 mL, contendo 200 mL de água estéril infecção zebrafish quatro ou cinco.</li>
			<li>Adicione 1 mL de V. cholerae (da etapa 1.1.1.4.) para obter a concentração desejada de infecção (tipicamente 5 x 104 a 5 x 107 UFC/mL) em 200 mL de água de infecção.</li>
			<li>Cobrir o recipiente com uma tampa perfurada para evitar que os peixes saltem para fora; parte superior de uma caixa de dica de 200 µ l funciona bem para isso.</li>
			<li>Etiquete cada copo e colocá-los em uma incubadora de vidro da frente regulado a 28 ° C, para a duração do experimento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Procedimento para a exposição transitória Nota: Uma exposição transitória para o V. cholerae (tipicamente de 6 h) seguida da remoção das bactérias inoculando é útil para estudar a transmissão e para a quantificação mais precisa de bactérias excretadas.<ol>
<li>Após 6 h de exposição, deite fora a água do copo através de uma rede para recolher os peixes. Descarte a água infectada dentro de um recipiente de água sanitária para matar o V. cholerae.</li>
			<li>Coloque o peixe removido em um copo de 200 mL de água estéril de infecção. Permitir que os peixes a nadar nessa água limpa por 5 min remover as bactérias de superfície do peixe.</li>
			<li>Repita o procedimento líquido (etapa 1.2.2) e coloque o peixe em um novo copo de 200 mL de água estéril de infecção. Mantenha o peixe este copo para a duração do experimento.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Eutanásia
	<ol>
<li>Quando o experimento alcançou seu ponto final desejado, tirar uma amostra da infecção água (15 mL é geralmente suficiente) permitir excretadas contagens bacterianas e a medição de diarreia (tais como o ensaio de mucina, teor de proteínas e/ou OD), se desejado (secção 2).</li>
		<li>Despeje o restante da água através de um arrastão (para recolher os peixes) em água sanitária para matar o V. cholerae na água.</li>
		<li>Coloque o peixe em um béquer contendo água de infecção mais 336 µ g/mL de Metanossulfonato de 3-aminobenzoato de etilo (tricaina) e incube-os peixes nesta solução tricaina por 20 min no RT Nota: As redes de pesca foram esterilizados com uma solução de água sanitária 10%.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissecação
	<ol>
<li>Preparação de peixes<ol>
<li>Escave um peixe para fora a solução tricaina com uma colher de plástico descartável e coloque-o na superfície de dissecação.</li>
			<li>Posição o peixe com o seu lado ventral virada para cima e pino através do maxilar inferior, com a extremidade romba do pino angular longe do centro do corpo. Coloque outro pino só posterior ao ânus, também em ângulo longe do corpo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Exposição do trato intestinal<ol>
<li>Limpe a superfície ventral do peixe com uma limpeza de fiapos, embebida em etanol 70%.</li>
			<li>É necessário esterilize um bisturi e Tesoura Vannas mergulhando-os em etanol a 70% e em chamas-los.</li>
			<li>Faça uma pequena incisão longitudinal na barriga apenas sob a pele, penetrando as escalas e usando o bisturi. Tenha cuidado para não cortar muito profundamente, como o trato intestinal está localizado logo abaixo da pele.</li>
			<li>Usando a tesoura, estenda a incisão cuidadosamente ao longo do comprimento do corpo, evitando o ânus e a corte não mais profundo do que o nível da pele.</li>
			<li>Fazer dois cortes laterais com a tesoura em direção a cabeça do peixe para permitir uma abertura da incisão.</li>
			<li>Pino da pele de cada lado das incisões laterais à superfície dissecação, dobrando os pinos para fora, longe do corpo. Nota: As pontas dos pinos foram previamente esterilizadas por flamejante-los com álcool.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Remoção do trato intestinal Nota: O trato intestinal deve ser visível como um tubo pálido, muito fino, em cima de outros órgãos.<ol>
<li>Flama-esterilizar o fórceps e então usá-los para remover todo trato intestinal (geralmente de 12 a 15 mm de comprimento). Coloque o intestino em um tubo de homogeneização contendo grânulos de vidro (ver passos 1.4.1–1.4.2) e 1 mL de 1X PBS ou LB, no gelo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Homogeneização
	<ol>
<li>Preparar os tubos de homogeneização com antecedência pelo derramamento ~1.5 g de grânulos de vidro de 1 mm em 2 mL tampa de rosca tubos (preenchê-los aproximadamente na metade do caminho) e então esterilizá-los em autoclave.</li>
		<li>Adicione 1 mL de LB estéril ou 1X PBS.</li>
		<li>Uma vez que os intestinos de zebrafish tem sido parafuso adicionado (etapa 1.3.3.1) para os tubos, as tampas na muito firmemente e prenda os tubos num homogeneizador vórtice.</li>
		<li>Homogeneizar as amostras por 1 min na configuração máxima e, em seguida, fixe-los no gelo para 1 a 2 min. Repita este ciclo de homogeneização mais uma vez para uma homogeneização completa. Nota: Vários métodos alternativos para homogeneização também irão funcionar.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificar os níveis de colonização intestinal
	<ol>
<li>Prepare tubos (tubos de ensaio de vidro pequeno ou tubos de microcentrifuga de 1,5 mL) para a diluição serial do homogenate adicionando 900 µ l de LB ou 1X PBS a cada tubo. Para cada peixe, preparar tubos de 5 – 6 e fazer 10 vezes diluições em série do homogenate intestinal adicionando-se 100 µ l de homogeneizado para o primeiro tubo, num Vortex para mistura e em seguida, adicionar 100 µ l do tubo do primeiro para o segundo tubo.</li>
		<li>Repita este procedimento até que todas as diluições foram preparadas.</li>
		<li>Placa de 100 a 200 µ l de cada diluição em placas de ágar LB contendo 100 µ g/mL de estreptomicina (se usando cepas resistentes de estreptomicina) e 40 µ g/mL de X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Incube as placas a 30 ° C para 16 – 18 h.</li>
		<li>Após a incubação durante a noite, contagem das colónias V. cholerae nas placas, usando um contador de colônia automática ou manualmente, contando as colônias; é útil marcar as colônias contadas com uma ponta de marcador.</li>
		<li>Determine o CFU por intestino de peixe multiplicando-se a contagem de placa pelo factor de diluição da suspensão, tendo em conta o volume que foi chapeado.</li>
	</ol></li>
</ol>2. medição de diarreia de peixe
Nota: Quatro métricas diferentes foram usadas para avaliar a diarreia de peixe: os níveis de mucina na água, os níveis de proteína excretados geral em água, o OD600 da água e o V. cholerae CFU na água13. Diarreia normalmente torna-se visualmente evidente aproximadamente 6 h após a exposição do zebrafish para V. cholerae conforme descrito acima.
<ol><li>
Determinar os níveis de mucina Nota: A secreção de mucina é induzida durante a colonização de V. cholerae e é uma boa medida de níveis de excreção, especialmente no início de infecção13. O ensaio de mucina é uma variação sobre o ácido periódico microtiter Schiff ensaio19.<ol>
<li>Preparar os seguintes materiais: solução de ácido periódico a 50% (p/v) e solução de 0,1% ácido periódico trabalho (10 µ l do estoque 50% ácido periódico adicionado a 5 mL de ácido acético 7% — usar imediatamente depois de fazer), padrões de mucina, placas de microtitulação 96 poços, Schiff reagente.<ol>
<li>Preparar padrões de mucina, suspendendo as seguintes quantidades de mucina (a partir de um tipo de suínos estômago III) em um tampão de acetato de sódio (100 mM de sódio acetato, 5mM EDTA, pH 5.5 com ácido acético glacial): 400 µ g/mL, 300 µ g/mL, 200 µ g/mL, 150 µ g/mL , 100 µ g/mL, 75 µ g/mL, 50 µ g/mL, 25 µ g/mL e 10 µ g/mL. Preparar a placa adicionando-se 100 µ l de infecção a água a cada poço que será usado no ensaio da seguinte forma: em branco 1X PBS; padrões de mucina conforme descrito acima, ou uma amostra de água da infecção de peixe. Fazer cada amostra em triplicado.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adicione 50 µ l de solução de ácido periódico fresca de 0,1% para cada um bem com uma pipeta multicanal e misturá-lo pipetando subindo e descendo várias vezes.</li>
		<li>Embrulhe em filme plástico da placa e incubar a 37 ° C para 1-1.5 h.</li>
		<li>Fixe a placa até à temperatura de 5 a 10 min. Adicione 100 µ l de solução de fucsina (do reagente de Schiff) a cada poço e pipeta para cima e para baixo misturá-lo.</li>
		<li>Embrulhe o prato em filme plástico e incube-lo à temperatura ambiente em uma plataforma de balanço até que desenvolveu a cor; a cor é geralmente desenvolvida dentro de 20 min. ler a absorvância a 560 nm, utilizando um leitor de placa.</li>
		<li>Traça uma curva padrão de mucina (OD560vs µ g/mL mucina padrão). Determine os níveis de mucina do soldado desconhecido, identificando onde o OD560 cada desconhecido cai na curva padrão e ler a concentração de mucina correspondente para esse valor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinar os níveis de proteína Nota: Além de mucina, níveis de proteína total na água são outro proxy para os níveis de diarreia (fezes nublado, líquido) produzidos pelos peixes. Este procedimento usa um ensaio de Bradford padrão para estimar os níveis de proteína. Níveis de proteína são estimados com base em cima de uma curva padrão de albumina de soro bovino (BSA).<ol>
<li>Misture 100 µ l de uma das normas de BSA (ver nota abaixo) ou 100 µ l de água de infecção (água do Béquer contendo o peixe infectado) com 900 µ l de Bradford reagente de ensaio (Reagente de ensaio da proteína de Pierce funciona bem para isso) em uma cubeta descartável. Incube as amostras à temperatura ambiente por 2 min. Nota: As seguintes normas de BSA foram utilizadas: 1.800 µ g/mL, 1.000 µ g/mL, 750 µ g/mL, 500 µ g/mL, 250 µ g/mL, 125 µ g/mL, 50 µ g/mL e 25 µ g/mL. Os padrões de BSA foram diluídos em água destilada esterilizada.</li>
		<li>Leia o OD660 de cada norma, ou prove-los usando um espectrofotômetro.</li>
		<li>Traça a curva padrão BSA (OD660vs µ g/mL). Determine os níveis de proteína do soldado desconhecido, identificando onde OD660 cada desconhecido cai sobre a curva padrão de BSA e ler a concentração de mucina correspondente para esse valor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medida OD600 Nota: A presença de diarreia (fezes nublado, líquido) manifesta-se visivelmente após vários h e uma simples determinação de600 OD podem ser usados para quantificar isso.<ol>
<li>Inverta o tubo contendo água a infecção várias vezes para distribuir o conteúdo. Adicione 1 mL da amostra de água para uma cubeta descartável. Use 1 mL de água estéril infecção como controlo negativo.</li>
		<li>Realizar uma medição "em branco", utilizando o espectrofotômetro a 600 nm, utilizando a amostra de controlo negativo. Leia cada amostra de água a 600 nm e registar os resultados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinação de excretada V. cholerae UFC/mL após a infecção Nota: Um componente importante da diarreia produzida pelo zebrafish é excretado V. cholerae. A determinação da CFU/mL pode ser utilizada para fins tais como estimar a replicação bacteriana no trato intestinal peixe e como uma medida de uma dose infecciosa em experimentos de transmissão. Esta medida é feita melhor quando uma infecção transitória tem ocorrido. Se uma infecção de 24 h é usada, este ensaio medirá o inóculo combinado, mais o excretados V. cholerae.<ol>
<li>Tirar uma amostra de água no ponto de tempo desejado e diluí-la em série conforme descrito anteriormente.</li>
		<li>As diluições de série em meios selectivos (ágar-ágar LB contendo estreptomicina ou outro antibiótico apropriado ou DCLS) da placa e incube-os a 30 ° C por 24 h.</li>
		<li>Conte as colônias. Calcule o UFC / mL de água, conforme descrito na etapa 1.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

O peixe-zebra é um modelo relativamente novo para o estudo V. cholerae , mas é uma grande promessa para a futura descoberta de aspectos anteriormente desconhecidos de V. cholerae biologia e patogênese11,12,13 . O modelo de zebrafish adulto tem as vantagens de ser ambos um natural V. cholerae host que contém microbiota intestinal intacta, madura e um modelo ambiental. Desvantagens do modelo são que os dois fatores de virulência humano principais, toxina da cólera e toxina-coregulated pilus, não são necessárias para zebrafish colonização ou patogênese12. No entanto, este como alternativa poderia ser visto como uma outra vantagem que poderia permitir a identificação do romance V. cholerae colonização fatores e facilitar o estudo de outras toxinas de V. cholerae . Isto é especialmente relevante para a grande maioria dos não-O1/O139 "ambiental" V. cholerae estirpes, a maioria dos quais fazer não produzir toxina da cólera ou pilus toxina-coregulated e ainda pode ainda causar doença20,21.
Os problemas mais prováveis de surgir usando este modelo estão relacionados com a microbiota intestinal abundante. Chapeamento em meios não seletivos fará este modelo essencialmente inutilizável como será impossível identificar as colônias de V. cholerae . Mesmo usando mídia seletiva ou parcialmente seletiva como LB plus estreptomicina ou DCLS, um fundo de colônias da microbiota intestinal estará presente. É essencial para verificar se as colônias que estão sendo contadas estão bona fide V. cholerae , Emendando as colônias produzidas pelo chapeamento na mídia menos selectivo num suporte muito seletiva como TCBS. Alternativamente, a inserção de um melhor marcador seletivo no genoma de uma estirpe de interesse seria simplificar a identificação do V. cholerae de homogenates intestinal.
A vantagem dos ensaios utilizados para quantificar o zebrafish diarreia é que eles são simples e barata para executar13. A desvantagem é que estes ensaios são largamente inespecíficos, além de contagem excretados V. cholerae CFU diretamente, e pode se tornar difícil determinar se a diarreia é diretamente devido à patogênese de V. cholerae , ou a algum outro fator de estresse . O desenvolvimento de variações destes ou outros ensaios para melhorar a sua vontade de especificidade provável ajuda no futuro medições de V. cholerae patogênese no zebrafish.

Vibrio cholerae é uma bactéria Gram-negativa aquática que provoca a cólera de doenças humanas, bem como diarreia esporádica1,2. V. cholerae é encontrado no ambiente em muitas áreas do globo, muitas vezes associado com outros organismos aquáticos. Estes organismos associados incluem plâncton, massas de ovos de insetos, moluscos e vertebrados peixes espécie3,4,5,6,7. Vários estudos têm isolado V. cholerae do trato intestinal de peixes em diferentes zonas geográficas7,8,9,10. A presença de V. cholerae em peixes indica que o peixe pode atuar como um reservatório ambiental. Peixes também poderiam ser implicados na transmissão da doença aos seres humanos e na disseminação geográfica de V. cholerae estirpes6.
Para entender melhor como o V. cholerae interage com peixe, Danio rerio, mais conhecido como peixe-zebra, foi desenvolvido como um sistema modelo para estudar V. cólerae11. Zebrafish são nativas do Sul da Ásia, incluindo a região da Baía de Bengala, que é pensado para ser o mais antigo reservatório de V. cholerae. Antes do início primeiro cólera pandemia, em 1817, a cólera não tinha sido relatada fora do que é hoje a Índia e Bangladesh. Portanto, zebrafish e V. cholerae quase certamente associado com o outro em escalas de tempo evolutivo, sugerindo que zebrafish são uma série de V. cholerae no ambiente natural12.
O modelo de zebrafish para o V. cholerae é simples de executar e pode ser usado para estudar a patogenicidade de todo o ciclo de vida V. cholerae . Peixes são expostos para o V. cholerae por tomar banho na água que tenha sido inoculado com um número conhecido de V. cholerae. Dentro de algumas horas, colonização intestinal ocorre, seguido pela produção de diarreia. Diarreia consiste de mucina, proteínas, bactérias excretadas e outro conteúdo intestinal. O grau de diarreia pode ser quantificado usando algumas medições simples13. V. cholerae que tem sido excretado pelos peixes infectados pode então ir para infectar os peixes ingênuo, completando o ciclo infeccioso. Portanto, o modelo de zebrafish recapitula o V. cholerae doença humana processo12,14.
O mais frequentemente usado V. cholerae modelos animais têm sido, historicamente, ratos e coelhos14,15,16,17,18. Esses modelos têm sido fundamentais para adicionar ao nosso conhecimento de V. cholerae patogênese. No entanto, porque os ratos e coelhos não são naturais V. cholerae anfitriões, existem limitações a que aspectos do ciclo de vida V. cholerae podem ser estudados. A V. cholerae colonização de ratos e coelhos, normalmente, requer a ausência da microbiota intestinal ou um tratamento prévio com antibióticos para danificar a microbiota intestinal. Ambos os modelos requerem ou gavagem para introduzir as bactérias para o sistema digestivo ou manipulação cirúrgica para injetar diretamente as bactérias no intestino. Zebrafish têm uma vantagem em que peixes adultos com uma microbiota intestinal intacta prontamente são colonizados e o processo infeccioso acontece naturalmente, sem qualquer manipulação necessária.
O presente trabalho demonstra a utilização do zebrafish como modelo em V. cholerae infecção. A infecção, dissecação, enumeração de colonizar V. choleraee a quantificação de diarreia causada pelo V. cholerae será descrito12,13. Este modelo é provável que seja útil para os cientistas interessados no processo de doença V. cholerae e o V. cholerae ambiental estilo de vida.

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		<tr>
			<td>Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific, Edison, NJ</td>
			<td>Excella E25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>NUAIRE, Plymouth, MN</td>
			<td>Auto Flow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo, Waltham, MA</td>
			<td>Geaesys 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex homogenizer</td>
			<td>Minibeadbeater24</td>
			<td>112011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Machine</td>
			<td>Ohaus, Columbia, MD</td>
			<td>Adventurer Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Stirer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>automated colony counter</td>
			<td>REVSCI</td>
			<td>120417B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 ml glass beakers</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perforated lids</td>
			<td>Microtip holder with holes from tip box</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable plastic spoons</td>
			<td>Office Depot, Boca Raton, FL</td>
			<td>D15-25-7008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish Tank System</td>
			<td>Aquaneering, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RO Water Purifier</td>
			<td>Aqua FX</td>
			<td>TK001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish net</td>
			<td>Marina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fish food</td>
			<td>Tetra fin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine Shrimp</td>
			<td>Red jungle brand</td>
			<td>O.S.I. pro 80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td>
			<td>10000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td>
			<td>11223-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td>
			<td>15000-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml screw cap tubes</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>02-681-375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm glass beads</td>
			<td>Bio Spec</td>
			<td>11079110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads for spreading</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>18406-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate</td>
			<td>Fisher Brand, Hampton, NH</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml centrifuge tube</td>
			<td>Midsci, Valley Park, MO</td>
			<td>AVSS1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning Falcon, Corning, NY</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>9820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipette</td>
			<td>Fisher Brand, Hampton, NH</td>
			<td>13675K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pipettes</td>
			<td>Sartorius Biohit, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>m1000/m200/m20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td>
			<td>24-150RS/24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>VWR Life Science, Radnor, PA</td>
			<td>K813-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>10651745001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>84655-250 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>periodic acid</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>10450-60-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin from porcine stomach</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>M2378-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>9046-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660nm Protein Assay Reagent</td>
			<td>Thermo, Waltham, MA</td>
			<td>22660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teast Extract</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NACL</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCBS Agar</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>265020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCLS Agar</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>70135-500gm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft office</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying vibrio cholerae colonization and diarrhea in the adult zebrafish model

Vibrio cholerae é conhecido como o agente infeccioso que causa a cólera de doenças humanas. Fora do hospedeiro humano, V. cholerae principalmente existe no ambiente aquático, onde interage com uma variedade de espécies aquáticas superiores. Vertebrados peixes são conhecidos por serem um host ambiental e são um reservatório potencial de V. cholerae na natureza. Tanto V. cholerae e as espécies de peixes teleósteos Danio rerio, comumente conhecidas como peixe-zebra, originam o subcontinente indiano, sugerindo uma interação de longa data em ambientes aquáticos. Zebrafish são um organismo modelo ideal para estudar muitos aspectos da biologia, incluindo doenças infecciosas. Zebrafish pode ser facilmente e rapidamente colonizado por V. cholerae após exposição na água. Colonização intestinal por V. cholerae leva à produção de diarreia e a excreção de replicada V. cholerae. Estas excretada bactérias pode, em seguida, vão para colonizar novos hospedeiros de peixe. Aqui, demonstramos como avaliar V. cholerae-colonização intestinal no zebrafish e como quantificar V. cholerae-induzida do zebrafish diarreia. O modelo de colonização deve ser útil para pesquisadores que estão estudando se os genes de interesse podem ser importantes para a colonização do hospedeiro e/ou de sobrevivência ambiental. A quantificação do zebrafish diarreia deve ser útil para pesquisadores estudando qualquer patógeno intestinal que estão interessados em explorar o zebrafish como um sistema modelo.

V. cholerae colonização do trato intestinal de zebrafish
Para fornecer um exemplo dos níveis típicos de colonização que observamos, nós inoculado 5 x 106 UFC da pandemia EL Tor V. cholerae estirpe N16961 em 200 mL de água numa proveta contendo vários zebrafish. Após 6 h de infecção, os peixes foram lavados em água doce e transferidos para um copo de 200 mL de água esterilizada infecção conforme descrito no protocolo. 18 h após a transferência (ou 24 h após a infecção primária), os peixes foram sacrificados e seus intestinos foram levados para determinar os níveis de colonização. Aproximadamente 105 a 106 V. cholerae células por intestino de peixes foram observadas normalmente a pós-infecção de 24h de trato intestinal (hpi) (Figura 1) com o tamanho do inóculo 5 x 106 .
Quantificação de diarreia de peixe
Diarreia foi quantificada utilizando os quatro ensaios simples descritos acima. O primeiro ensaio, o CFU de excretados V. cholerae, é mostrado na Figura 1. Diluições em série de hpi de 24 a água foram chapeadas para contar o V. cholerae CFU. Níveis relativamente elevados de excretados V. cholerae são geralmente observados; Neste exemplo, aproximadamente 105 V. cholerae por mL de água foram detectados. Peixe não infectados não produzem detectados V. cholerae (dados não mostrados).
O segundo ensaio usado para quantificar a diarreia é mucina excretada. A Figura 2 mostra os efeitos de três diferentes V. cholerae infecciosas doses nos níveis de mucina na água 24 hpi. Uma maior dose infecciosa está correlacionada com uma maior excreção de mucina na água. Como um controle, quatro peixes foram colocado em um béquer idêntica de água, mas PBS foi adicionado ao invés da suspensão de V. cholerae . O peixe de controle excretada mucina muito pouco.
O terceiro ensaio de quantificação diarreicas é o OD600 de hpi de 24 a água. Como mostrado na Figura 3, o OD600 desta água foi significativamente maior no copo contendo zebrafish infectado com o V. cholerae do que no copo contendo zebrafish não infectado.
Finalmente, os níveis de proteínas totais foram medidos na água. Água que contém os peixes infectados continha níveis de proteína total quase o dobro que o observaram na água contendo os peixes não infectados (Figura 4). Coletivamente, estes quatro ensaios ilustram os efeitos de V. cholerae infecção tem na excreção de zebrafish.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57767/57767fig1.jpg"> Figura 1: Colonização Intestinal de zebrafish por V. cholerae. Os peixes foram infectados por 6h, então lavados e incubados durante um total de 24 h. O lado esquerdo da figura ilustra o total CFU por intestino de quatro peixes (pontos negros). O lado direito da figura indica o V. cholerae CFU / mL medido em água 24 hpi (quadrados pretos). Os meios de ambos os conjuntos de dados são mostrados com uma grande linha horizontal e o desvio padrão são indicados por barras de erro. <a href="/files/ftp_upload/57767/57767fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57767/57767fig2.jpg"> Figura 2: ensaio de mucina. Três diferentes V. cholerae doses infecciosas foram usados, juntamente com um controle não infectado, conforme indicado sob o x-eixo. Os valores médios da mucina detectado na água pelo ácido periódico modificados do ensaio Schiff (PAS) são indicados por barras pretas acima cada dose infecciosa. As barras de erro indicam o desvio padrão. Os asteriscos indicam p < 0,05 conforme determinado pelo aluno é unpaired t-teste. <a href="/files/ftp_upload/57767/57767fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57767/57767fig3.jpg"> Figura 3: Ensaio de600 OD como um proxy para diarreia. O OD600 de 1 mL de água a partir do Béquer contendo qualquer V. cholerae infectados ou não infectado peixe foi medido. As barras pretas indicam o valor médio e as barras de erro indicam o desvio padrão. Os asteriscos indicam p < 0,05 conforme determinado pelo aluno é unpaired t-teste. <a href="/files/ftp_upload/57767/57767fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57767/57767fig4.jpg"> Figura 4: Total de níveis de proteína na água. A proteína total foi estimada por um ensaio de Bradford conforme descrito. As barras pretas indicam os valores médios e as barras de erro indicam o desvio padrão. Os asteriscos indicam p < 0,05 conforme determinado pelo aluno é unpaired t-teste. <a href="/files/ftp_upload/57767/57767fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Zebrafish são um natural Vibrio cholerae hospedar e pode ser usado para recapitular e estudar o ciclo infeccioso de colonização para transmissão. Aqui, demonstramos como V. cholerae níveis de colonização de avaliar e quantificar a diarreia no zebrafish.

Quantificar a colonização de Vibrio cholerae e diarreia no adulto modelo de Zebrafish

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

quantifying-vibrio-cholerae-colonization-diarrhea-adult-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

8.3K visualizações.  Wayne State University School of Medicine. Zebrafish são um natural Vibrio cholerae hospedar e pode ser usado para recapitular e estudar o ciclo infeccioso de colonização para transmissão. Aqui, demonstramos como V. cholerae níveis de colonização de avaliar e quantificar a diarreia no zebrafish.

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Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin synthesis. They also supply the host with a considerable amount of nutrients, making this ecosystem an essential metabolic organ. In the context of increasing evidence of the link between the gut flora and the metabolic syndrome, understanding the metabolic interaction between the host and its gut microbiota is becoming an important challenge of modern biology.1-4
 Colonization (also referred to as normalization process) designates the establishment of micro-organisms in a former germ-free animal. While it is a natural process occurring at birth, it is also used in adult germ-free animals to control the gut floral ecosystem and further determine its impact on the host metabolism. A common procedure to control the colonization process is to use the gavage method with a single or a mixture of micro-organisms. This method results in a very quick colonization and presents the disadvantage of being extremely stressful5. It is therefore useful to minimize the stress and to obtain a slower colonization process to observe gradually the impact of bacterial establishment on the host metabolism.
 In this manuscript, we describe a procedure to assess the modification of hepatic metabolism during a gradual colonization process using a non-destructive metabolic profiling technique. We propose to monitor gut microbial colonization by assessing the gut microbial metabolic activity reflected by the urinary excretion of microbial co-metabolites by 1H NMR-based metabolic profiling. This allows an appreciation of the stability of gut microbial activity beyond the stable establishment of the gut microbial ecosystem usually assessed by monitoring fecal bacteria by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis).6 The colonization takes place in a conventional open environment and is initiated by a dirty litter soiled by conventional animals, which will serve as controls. Rodents being coprophagous animals, this ensures a homogenous colonization as previously described.7
 Hepatic metabolic profiling is measured directly from an intact liver biopsy using 1H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spectroscopy. This semi-quantitative technique offers a quick way to assess, without damaging the cell structure, the major metabolites such as triglycerides, glucose and glycogen in order to further estimate the complex interaction between the colonization process and the hepatic metabolism7-10. This method can also be applied to any tissue biopsy11,12.

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

A progressive colonization procedure is described to further assess its impact on the host hepatic metabolism. Colonization is monitored non invasively by evaluating the urinary excretion of microbial co-metabolites by NMR-based metabolic profiling while hepatic metabolism is assessed by High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profiling of intact biopsy.

Avaliar as alterações metabólicas hepáticas Durante a colonização progressiva de Germ-free Mouse 1 H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Imunologia e Infecção

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

Colonização de Euprymna scolopes Squid por Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - um método para modificar geneticamente<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Com base Transformação Natural e recombinação FLP-

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Investigando os efeitos dos probióticos sobre pneumocócica Colonização Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Adesão Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have been developed that permit engraftment of normal and malignant cells into irradiated, syngeneic, and immune compromised adult zebrafish. These models when coupled with optimized cell transplantation protocols allow for the rapid assessment of stem cell function, regeneration following injury, and cancer. Here, we present a method for cell transplantation of zebrafish adult skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS), a pediatric sarcoma that shares features with embryonic muscle, into immune compromised adult rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. Importantly, these animals lack T cells and have reduced B cell function, facilitating engraftment of a wide range of tissues from unrelated donor animals. Our optimized protocols show that fluorescently labeled muscle cell preparations from &#945;-actin-RFP transgenic zebrafish engraft robustly when implanted into the dorsal musculature of rag2 homozygous mutant fish. We also demonstrate engraftment of fluorescent-transgenic ERMS where fluorescence is confined to cells based on differentiation status. Specifically, ERMS were created in AB-strain myf5-GFP; mylpfa-mCherry double transgenic animals and tumors injected into the peritoneum of adult immune compromised fish. The utility of these protocols extends to engraftment of a wide range of normal and malignant donor cells that can be implanted into dorsal musculature or peritoneum of adult zebrafish.

Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells.

Normais e malignas Transplante de Células Muscle em imunológico comprometido Adulto Zebrafish

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Desenvolvimento de uma mais sensível e específica Cromogênico Agar para a detecção de<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; E outro<em&gt; Vibrio</em&gt; Espécies

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Um modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonização Vaginal

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.

Técnicas de laboratório usadas para manter e diferenciar biótipos de<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Isolados clínicos e ambientais

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...