この作品は費補助金科学研究 (15 K 07147、17 K 07419) 日本学術振興会から (洋石本、佐野寛子) (HI) に稲盛財団研究助成金、共同利用・共同研究センターのプログラムでサポートされる発生発達医学分子発生学・遺伝学 (HS) に熊本大学研究所。イメージング システムを使用して彼らの助け、上川内あづさ先生と山田大地さんに感謝します。

1. 幼虫の脳外植片の準備
<ol><li>イメージング室を作る。 注: 脳外植片が係留される安定した記録が必要です。ここでは、低コスト、手作りのイメージング商工会議所は、Ca2 +イメージング システムで使用されます。<ol>
<li>鉗子を使用して、取り付け簡単 (手順 1.3,図 1) を作る幼虫の脳の腹側神経節の凹みを作成するプラスチック製培養皿 (35 mm × 10 mm) の底面の中心を傷つけます。</li>
		<li>、つまようじでくぼみの両側に瞬間接着剤の小さなドロップを配置し、タングステン棒 (径 0.125 mm、6 〜 7 mm 長さ) を接着剤に添付します。</li>
		<li>パテのような再利用可能な接着剤の小さなピースを使用して、作る円形の壁 (10 mm 径、高さ 3 mm) 周囲の凹み (図 1)。 注: 壁の内側の空間が後で満ちるリン酸緩衝生理食塩水 (PBS; 0.14 M NaCl、0.0027 M KCl、0.01 M PO43 -、pH 7.4 ± 0.05 25 ° C で)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>動物の準備 注: カルシウム イメージング、カルシウム インジケーター、GCaMP6s は組織特異 GAL4 とUA GCaMP6sの組み合わせを使用して実現されます一般的興味のセル型で表されます。信号が候補受容体を通して仲介されることを確保するため、GCaMP6s も変異受容体の欠陥で表されます。<ol>
<li>野生型と変異体など異なる遺伝子型の実験的比較が必要な場合、GCaMP6 式レベル変動と生理学的な発達段階の違いを避けるために一致テスト幼虫を年齢します。</li>
		<li>食品の表面に産卵を許可する 8 h の標準的なはえの食糧を含む文化バイアルに親のハエ (各性のため 30 ハエ) をしてください。質量 25 ° C と 60-70% の相対湿度で 12 時間の明暗周期下における幼虫の文化。</li>
	</ol>
</li>
	<li>幼虫の脳の解剖<ol>
<li>90-120 h 産卵 (AEL) 後、幼虫を収集し、付着性の食べ物のかすを除去する蒸留水で少なくとも 3 回洗ってください。</li>
		<li>場所 1.5 インチ正方形時計ガラスの幼虫は、氷冷 PBS でいっぱい。 注: 次の 2 つの手順この時計ガラスの解剖顕微鏡下で実行されます。</li>
		<li>幼虫の中央部を優しくつかむ鉗子を使用します。口フックを取得し、別の体の残りの部分から脳を含む幼虫の前方の部分に優しく口フックを引くもう一つの鉗子を使用します。 注: また、外科はさみ使用できます。</li>
		<li>鉗子で前方の先端を押し、幼虫を裏返しします。成虫ディスク、脂肪体、リング腺など、脳に付着した余分な組織を削除します。口器から脳を優しきます。</li>
		<li>200 μ L の PBS をイメージングの商工会議所のパテのような再利用可能な接着剤は、リングの内側に適用されます。パスツール ピペットに PBS で切り裂かれた脳を優しく吸うし、部屋に転送。</li>
	</ol>
</li>
	<li>部屋に脳を設定<ol>
<li>鉗子を使用して、腹側の神経節から伸びる筋線維をつかみます。タングステン線の下に凹みに脳をゆっくり挿入します。</li>
		<li>プル タングステン線は別鉗子を使用すると、(図 1) をイメージングのため適切な位置に脳にもわずかに配置しています。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ca2 +蛍光画像の取得
注: 脳外植片 PBS 中に浸漬、水浸対物レンズ × 20 を搭載した蛍光顕微鏡を使ってイメージ化 (n. a. = 0.5)。PBS は、脳細胞をアクティブにしません。Z 軸のイメージが必要な場合圧電アクティブ レンズ発動機を対物レンズを搭載します。回転のディスク共焦点ヘッドは、時間分解能を高めるために使用されます。低光イメージングのため電荷結合素子カメラを掛けて電子顕微鏡がマウントされます。GCaMP6s 蛍光イメージング (励起/蛍光: 488/509 nm) 励起発光フィルターとダイクロイック ビーム ・ スプリッターの 488 nm レーザーが必要です (e.g。, 528 ± 38 nm 帯域バンドパス フィルター)。
<ol><li>顕微鏡下で脳外植体を含むイメージングのチャンバーを配置します。</li>
	<li>それが PBS に触れるまでは、対物レンズを下げます。明視野照明下における脳の位置し、焦点に持って来る。蛍光灯に切り替えて、GCaMP6s というラベルの付いたセルにフォーカスを調整します。 注: GCaMP6s の基部の緑の蛍光性が見えるはずです。</li>
	<li>250 ms で集録を開始/水冷モードで適正な取得ソフトウェアを使用して 512 × 512 ピクセルの解像度でフレーム (e.g。、µManager)。16 ビット画像 (ダイナミック レンジ 0 65,535) と CCD カメラのダイナミック レンジ内の蛍光値を取得がない 1000 (任意の単位) より低い露出時間を調整します。 注: GCaMP6s の光退色を最小限に抑える低露光時間を使用ください。露光時間を最適化して、GCaMP6 の発現と検出システムの感度にかかっており各実験でください。それは私たちを用いた実験で 100 ms dilp2 > GCaMP6s です。Z セクションが指定した深さでイメージングに必要ないくつかの z 断面画像は露出時間とフレームの間隔によって取得できます。カメラに十分な空間分解能がある場合は、露出時間を短縮するビニング サイズ (1 つデジタル ピクセルにビンがオンチップ レジスタの数) を増やしてください。</li>
	<li>撮像パラメーターが決まったら、基準信号強度 (F0) を検出するペプチド投与前に、1 分の画像を取る。</li>
	<li>テスト ペプチドを適用します。このため、PBS におけるペプチド溶液 100 μ L を溶解し、最適濃度をもたらす幼虫お風呂に直接ピペットします。 注: ペプチド ソリューションゆっくり注入する必要があります (例えば流率 20 μ L/s) にピペットを使用してバス ソリューション。PBS に溶解した無関係の合成ペプチドは、ネガティブ コントロールとして使用されます。</li>
	<li>数分の GCaMP6s 排出量を記録します。</li>
</ol>3. データ分析
注: 画像データは、ImageJ とオフライン分析されます。時間経過イメージ投射の間を移動する幼虫の脳を引き起こすピペッティングします。したがって、解析の前にシリアルの画像の位置異常を修正必要があります。補正は、ImageJ、プラグイン、TurboReg を次のように使用して実行できます。
<ol><li>解析ソフトウェアを開き、参照イメージとして (ペプチッドのアプリケーション) の前に最初のフレームを使用します。</li>
	<li>プラグインを選択 |登録 |TurboReg。</li>
	<li>ソースとしてシリアル イメージ ファイルとターゲットとして参照イメージを選択します。</li>
	<li>それぞれ剛体(平行変位と画像の回転) と正確性(「高速」は代わりに高速な解析粗いです) を処理方法と品質を確認します。</li>
	<li>バッチ画像処理を開始するをクリックします。</li>
	<li>分析を用いた関心 (ROIs) の複数の領域を選択 |ツール |ROI マネージャー ImageJ で。</li>
	<li>もっとをクリックしてピクセル強度を測定 |マルチ メジャー |OK ROI マネージャー] ウィンドウで。</li>
	<li>計算 ΔF/F0 = (F - F0)/F0、どこ F ROI 強度刺激時と F0は特定の実験的イベントの直前の時間帯での強度 (例えば30 前のフレーム、刺激開始)。</li>
	<li>複数の脳サンプルを使用して、平均と各時点での平均 (SEM) の標準エラーを取得する統計処理を行う実験を繰り返します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Morton, G. J., Schwartz, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+the+central+nervous+system+control+of+glucose+metabolism.">Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).</li><li>Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+regulation+of+food+intake.">Hormonal regulation of food intake.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).</li><li>Goodman, W. G., Cusson, M., Gilbert, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+juvenile+hormones.">The juvenile hormones.</a> Insect Endocrinology. , 310-365 (2012).</li><li>Lafont, R., Dauphin-Villemant, C., Warren, J. T., Rees, H., Gilbert, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysteroid+chemistry+and+biochemistry.">Ecdysteroid chemistry and biochemistry.</a> Insect Endocrinology. , 106-176 (2012).</li><li>Smith, W., Rybczynski, R., Gilbert, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protothoracicotropic+hormone.">Protothoracicotropic hormone.</a> Insect Endocrinology. , 1-62 (2012).</li><li>Claeys, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+neuropeptide+and+peptide+hormone+receptors:+current+knowledge+and+future+directions.">Insect neuropeptide and peptide hormone receptors: current knowledge and future directions.</a> Vitamins and Hormones. 73, 217-282 (2005).</li><li>Gade, G., Goldsworthy, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+peptide+hormones:+a+selective+review+of+their+physiology+and+potential+application+for+pest+control.">Insect peptide hormones: a selective review of their physiology and potential application for pest control.</a> Pest Management Science. 59 (10), 1063-1075 (2003).</li><li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster.">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).</li><li>Park, D., Veenstra, J. A., Park, J. H., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+peptidergic+cells+in+Drosophila:+where+DIMM+fits+in.">Mapping peptidergic cells in Drosophila: where DIMM fits in.</a> PLoS One. 3 (3), 1896 (2008).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling.">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies:+growth+and+diabetic+phenotypes.">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296 (5570), 1118-1120 (2002).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Nassel, D. R., Kubrak, O. I., Liu, Y., Luo, J., Lushchak, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+regulate+insulin+producing+cells+and+their+output+in+Drosophila.">Factors that regulate insulin producing cells and their output in Drosophila.</a> Frontiers in Physiology. 4, 252 (2013).</li><li>Sano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nutrient-Responsive+Hormone+CCHamide-2+Controls+Growth+by+Regulating+Insulin-like+Peptides+in+the+Brain+of+Drosophila+melanogaster.">The Nutrient-Responsive Hormone CCHamide-2 Controls Growth by Regulating Insulin-like Peptides in the Brain of Drosophila melanogaster.</a> PLoS Genetics. 11 (5), 1005209 (2015).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Ex+Vivo+Culture+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Imaginal+Discs.">Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs.</a> PLoS One. 11 (9), 0163744 (2016).</li><li>Sabado, V. a. N., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Resolution+Fluorescence+Live+Imaging+of+Drosophila+Circadian+Clocks+in+Larval+Brain+Culture.">Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 131, e57015 (2018).</li><li>Apostolopoulou, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+Taste+Signaling+in+Drosophila+Larvae.">Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193 (2016).</li><li>Cao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits.">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154 (4), 904-913 (2013).</li><li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation.">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).</li><li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li></ol>

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Ca2 +イメージング法は、ここで説明した脳のホルモンの機能をテストするための便利なシステムです。生体内で、脳は様々 な内分泌腺からホルモンを受け取ります。さらに、脳は常に自発神経活性化を引き起こす感覚情報を昇順を認識します。この前のヴィヴォシステムは、このようなノイズを排除し、生体内イメージングより良い信号/ノイズ比が得られます。このシステムは、単独または組み合わせて分子をテストできます。ペプチド ホルモンに加えて天然または合成化合物を含む任意の水溶性分子は脳外植体に適用できます。
Ca2 +イメージング、脳外植片が係留される必要があります。ポイントの低融点アガロースこの目的のため作られたゲルのマトリックスまたはフィブリンが従来の16,17。これらのゲルのマトリックスがサンプルを安定保持できる、30 ° C 以上に組織を加熱するただし、この温度は、昆虫などの poikilothermic の動物の熱ショック応答を引き起こします。熱ストレスを避けるためには、脳を物理的に係留することができます。キューティクルに接続されている脳は、昆虫ピン18に固定されます。タングステン線を用い, 提案法は、シンプルで安定したサンプルの保持を提供します。このシステムが準備を簡単で再利用、および覚醒剤ゲルを埋め込み法と比較してより簡単に標的細胞に到達することができます。したがって、これはリガンドのスクリーニングのため役に立つでしょう。
蛍光指示薬の選択は、ターゲット ニューロン受容体ニューロンと取り上げられている生物学的質問で表される型の型によって異なります。様々 な時間的 Ca2 +動態を検出するために最適化された GCaMP6 亜種のシリーズは、生成された13をされています。特に、GCaMP6 亜種は、その応答速度: GCaMP6s (低速)、GCaMP6m (中) と GCaMP6f (高速)。GCaMP6s と 6 m の減衰時間が比較的遅い (すなわち。、海馬スライス標本における 10 活動電位後 τ1/2 ) 一方、GCaMP6f は高速 (τ1/2 1 活動電位の後)。EPAC キャンプ (キャンプ)、シナプト pHluorin (シナプス リリース)、アークライト (膜電位)19,20,21などの他の種類の神経活動のできる蛍光インジケーター。これらの遺伝的コード化蛍光プローブは、特定の細胞型で表現できます。Ex vivoイメージング システムしたがって、機能目的ニューロンで様々 な反応を検出できます。
このプロトコルではいくつかの重要な手順があります。最初に、余分な組織は、明確な画像を得るには、脳から削除する必要があります。シャープ鉗子、手術用はさみの使用は、繊細な作業を軽減します。第二に、切り裂かれた脳は位置に固定する必要があります。時折、脳のサンプルは、若干 (範囲約 5 μ m) をピペッティングから移動します。脳の移動を防ぐために脳サンプルのサイズにイメージングのチャンバーにタングステン線の高さを調整する必要があります。また、重力フィード灌流システムは、穏やかな刺激のインストールでした。第三に、脳機能イメージングの結果は慎重に解釈すべき。配位子の脳に適用可能性があります順番ターゲット ニューロンをアクティブに可能性があります予期しないニューロンを刺激します。特定のニューロンにホルモンの直接の影響を検出するには、受容体必要があることをノックダウン、targetneurons で。この場合、蛍光指示薬の式は、RNAi Gal4/UAS システムを使用して受容体のと組み合わせることができます。
このプロトコルのマイナーな制限は、イメージングの期間は脳サンプルの最終的な損傷のため限られることです。私たちの手では、このプロトコルを使用して約 60 分までのショウジョウバエ脳をイメージすることができます。HL3.1 生理食塩水22やレーザー強度など、体液のようなソリューションが長期的なイメージングを有効にします。さらに、現在の画像の設定は同じサンプルの反復的な刺激のため適していません。そのような実験の灌浴をされる可能性があります。
最後に、このプロトコルには、さまざまなアプリケーションがあります。部屋を変更すると、成人の脳と他のショウジョウバエのティッシュまたは他の動物の組織を描出できた。非モデル生物における遺伝的ツールの欠如したゲノムに蛍光プローブを導入することは困難。しかし、最近開発された CRISPR/Cas9 ゲノム編集技術は、これらの動物の遺伝子工学への扉を開いています。したがって、このプロトコルが使用して、臓器間シグナル動物の広い範囲を勉強します。

臓器器官のコミュニケーションは、環境の変化に対処するための恒常性を維持するための進化上保存された戦略です。人間、内分泌腺からホルモン直火のさまざまな循環に。これらのホルモンの多くは代謝過程と1,2を供給など基本的な動作を調節する脳の視床下部をターゲットします。多くのホルモンは、哺乳類のモデルを使用して発見されています。しかし、彼らの行動は、彼らが参加、特に interorgan ネットワークのメカニズムはほとんど不明します。
キイロショウジョウバエは、臓器器官のコミュニケーションを研究するための有用なモデルとして登場しました。昆虫では、多くの生理学的なプロセスはホルモンによって制御されます。成長と変容に着目した初期の研究では、大型の昆虫を使用しました。これらの研究で削除または特定の臓器の移植は、臓器間のシグナリング分子の存在を予言その後、幼若ホルモン (JH)、Prothoracicotropic ホルモン (PTTH) とエクダイソン生化学的精製3,4,5をだった。細胞内情報伝達の大家族は、昆虫のライフ サイクル6、7の中に様々 な生理学的なイベントに関与すると考えられます。これらのペプチドのほとんどは、特定の Gpcr が従来のアプローチを使用して識別するために最初に困難な G タンパク質共役受容体 (Gpcr) に関する法律します。ショウジョウバエゲノム シーケンス8の出版物は、他の昆虫に見られる彼らの相同性に基づくショウジョウバエ生理活性ペプチドの同定に有効な画期的なだった。さらに、いくつかのペプチド受容体は、Gpcr 細胞・培養技術を用いた GPCR リガンド結合アッセイを使用してゲノムの予測から同定された.次に、発現解析は、これらのペプチド受容体によって誘発される臓器に経路を予測しました。特に、推定ペプチド受容体の多くは脳で脳はペプチド ホルモン9の主要なターゲットであることを示唆するいると表現されます。また、ショウジョウバエで高度な遺伝学的ツールは、ペプチド GPCR の組み合わせの生理的な役割の同定に貢献しました。例えば、GAL4 と LexA ベースのバイナリ転写システム時空間制御された方法では遺伝子ノックダウンまたは過剰発現を有効。 にします。酵母で識別される転写因子 GAL4 を上流活性化シーケンス (UAS) と呼ばれる特定のシス配列にバインドします。GAL4/UAS システム ドライバー ライン提供組織固有または段階における発現 GAL4 とレスポンダー ライン ドライブ shRNA 発現する構造や興味の遺伝子の上流の UAS を運ぶ。LexA/LexAop システムは、同様のメカニズムに基づいています。組織特異ペプチド ノックダウンおよび組織固有の GPCR ノックダウン動物の表現型解析は、ペプチド GPCR シグナル モードおよびアクションのサイトに関する情報を表示できます。ただし、遺伝的データによってだけ達することができる結論は制限されます。その一方で、特定のペプチド ホルモンの推定の対象は、組織または細胞の種類に絞られて、一度ペプチド GPCR シグナリングを介した臓器にコミュニケーションを明らかにする前のヴィヴォカルシウム器官外植体のイメージングを使用できます。Gq 共役 GPCR の活性化、ER10からの Ca2 +の放出による細胞内 Ca2 +濃度が増加します。脳神経の活性化はまた細胞内 Ca2 +濃度を高めます。このような Ca2 +増加はカルシウム センサー GCaMP は、Ca2 +蛍光発光11の結果の存在下での構造変化を経るによって検出できます。
この記事では、カルシウム イメージングを用いたショウジョウバエの脳外植片を説明します。特定のニューロンを作動するペプチドの機能をテストするテスト ペプチドは GCaMP 表現脳植に適用され、共焦点顕微鏡による蛍光の変化を監視します。GPCR が関与し、GPCR に欠けている突然変異体の脳を使用して同じアッセイを行って確認します。イメージングと遺伝学の組み合わせは、ペプチドによる臓器器官のコミュニケーションに関する正確な情報を提供しています-Gpcr。 可能な変更およびこのプロトコルのアプリケーションについても説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1033px;" width="1032">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">Tungsten rod</td>
			<td style="width:327px;">A-M systems, Sequim, WA, USA</td>
			<td style="width:165px;">717000</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blu Tack</td>
			<td>Bostik, Paris, France</td>
			<td>3049100</td>
			<td>putty-like reusable adhesives</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Watch glass, square, 1 5/8 in</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA</td>
			<td>742300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan</td>
			<td>T900</td>
			<td>Phosphated buffered salts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CCHa2</td>
			<td>SCRUM Inc., Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Custum-synthesized peptide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ghrerin</td>
			<td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td>
			<td>4372-s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nociceptin</td>
			<td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td>
			<td>4313-v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Axio Imager A2</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Axio Imager A2</td>
			<td>fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>420957-9900-000</td>
			<td>water-immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P-725 PIFOC objective scanner with long travel range</td>
			<td>Physik Instrumente GmbH &#38; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>piezoelectric-activated lens mover</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Confocal Scanner Unit CSU-W1</td>
			<td>Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td>CSU-W1</td>
			<td>spinning disc confocal head</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImagEM C9100-13</td>
			<td>Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td>EM-CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">OBIS 488 nm LS 60 mW</td>
			<td>Coherent, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>1178770</td>
			<td>488-nm laser</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock, Rochester, NY, USA</td>
			<td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td>
			<td>dichroic beam splitter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock, Rochester, NY, USA</td>
			<td>FF01-528/38-25</td>
			<td>emission filter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#181;Manager</td>
			<td>Open Imaging, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://micro-manager.org</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImageJ</td>
			<td>U. S. National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TurboReg</td>
			<td>Philippe Th&#233;venaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne</td>
			<td>N/A</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila

内分泌シグナルによる臓器に通信たとえば、脳に周囲からは恒常性を維持するために不可欠。内分泌研究のためのモデルとして、キイロショウジョウバエ、遺伝学的ツールとゲノム情報が洗練された、これがますます使用されています。この資料では、ショウジョウバエ脳外植体のカルシウム イメージング法について説明します。このメソッドは、脳にホルモンの直接シグナルを検出できます。多くのペプチッド ホルモン行動を通じて G タンパク質共役受容体 (Gpcr) が活性化は、細胞内 Ca2 +濃度の増加を引き起こすことが知られています。神経活性化は、細胞内の Ca2 +濃度 Ca2 +流入の Ca2 +細胞質網状質 (ER) に格納されているリリースからも高めます。カルシウム センサー、GCaMP は、これらの Ca2 +変更を監視できます。この方法で GCaMP は関心のニューロンで表現され GCaMP 表現する幼虫の脳は解剖、養殖前のヴィヴォ。テストのペプチドが脳植に適用されますし CCD カメラを装備して回転ディスク共焦点顕微鏡を用いた GCaMP の蛍光変化を検出する.このメソッドを使用すると、任意の水溶性分子をテストことができますと適切な蛍光インジケーターを使用して神経の活性化に関連付けられている様々 な携帯電話イベントをイメージすることができます。また、他のショウジョウバエや他の動物の臓器を画像に、イメージングのチャンバーを変更すると、このメソッドを使用できます。

このプロトコルを使用すると、ペプチド ホルモン、CCHa2、インスリン産生細胞脳 (IPCs) の活性化を調べた。GCaMP6s とラベル付けされた野生型脳の IPCs dilp2 -GAL412 (ルイグソン博士からの贈り物) とUA GCaMP6s13 (キム博士からの贈り物) の組み合わせを使用します。合成 CCHa2 ペプチドと扱われた幼虫の脳外植体と GCaMP6s からの蛍光は、リアルタイムで記録されました。この実験では、1 つの焦点平面から画像を得た。各 IPC クラスターを含む約 14 セル14、および 3 から 6 セルまでの信号が検出されました。GCaMP6s 信号強度は CCHa2 管理 (図 2A、映画 1) に劇的に増加しました。野生型の脳はグレリンやノシセプチンに明らかな反応を示さなかった (映画 2 および 3、それぞれ)、ショウジョウバエ相同遺伝子のない哺乳類ペプチド ホルモンであります。CCHa2 で IPCs の観察されたライセンス認証が CCHa2 に固有の応答であることが示唆されました。CCHa2 CCHa2 R を通して行動するかどうかを明らかにするには、CCHa2 R 変異脳を使用して同様の分析を行った。突然変異体の脳 (映画 4) CCHa2 投与後その信号強度の増加は認められなかった。統計解析は、野生型とCCHa2 R変異脳信号強度の違い CCHa2 塗布後は 2 分以内で顕著となった、少なくとも 7 分 (図 2B) 維持したことを示した。IPCs は特にから CCHa2 R CCHa2 によってアクティブ化されるこれらの結果を示す本研究で使用されるすべてのペプチドは、収量 10-9 M の最終的な集中に PBS で希釈されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57701/57701fig1.jpg"> 図 1.イメージング商工会議所 (A)は、小さなへこみとテザリング ロッド皿 (35 mm × 10 mm) を文化します。パテのような再利用可能な接着剤で作られた (B) リング状壁(C) A 幼虫脳植イメージング室に挿入します。<a href="/files/ftp_upload/57701/57701fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57701/57701fig2.jpg"> 図 2.幼虫の脳外植体のカルシウム イメージング 野生型 (dilp2 Gal4/UA GCaMP6s) 脳は、CCHa2、グレリン、ノシセプチンにさらされました。CCHa2 R変異 (dilp2 Gal4 CCHa2 Rタル 34/UA GCaMP6s、CCHa2 Rタル 34) CCHa2 に脳がさらされました。IPCs で GCaMP6s 信号は 250 ms/フレーム共焦点顕微鏡法によって検出されました。まだ選択した時点の画像は、(A) に表示されます。画像は異なる信号強度を見やすくします pseudocolored.ΔF/F0時間の各ポイントでは、(B) でプロットしました。ΔF/F0は、10 の異なる準備に 5 から計算しました。・ ロワは、同じ面上で検出された細胞体に設定されました。5 に 10 のサンプルの平均値を示す実線と点線マーク平均の標準誤差の上限と下限の制限。影の部分は、実験では信号の変化を示します。スケール バーは、50 μ m を示します。図は、佐野らから適応15.<a href="/files/ftp_upload/57701/57701fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie1.jpg"> ムービー 1。CCHa2 にさらされる野生型 IPCsこのビデオを表示する15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S1_WT_CCHa2.avi" target="_blank">をここでクリックしてください。(右クリックしてダウンロード)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie2.jpg"> ムービー 2。グレリンにさらされる野生型 IPCsこのビデオを表示する15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S2_WT_Ghrelin.avi" target="_blank">をここでクリックしてください。(右クリックしてダウンロード)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie3.jpg"> ムービー 3。ノシセプチンにさらされる野生型 IPCsこのビデオを表示する15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S3_WT_Nociceptin.avi" target="_blank">をここでクリックしてください。(右クリックしてダウンロード)</a>
<img alt="Movie 4" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie4.jpg"> 映画 4.CCHa2 RCCHa2 にさらされる変異 IPCs15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S4_CCHa2_mutant_CCHa2.avi" target="_blank">このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロード)</a>

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Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivoショウジョウバエにおける内分泌シグナル伝達する脳の反応を可視化するためのカルシウム イメージング

本稿では、ショウジョウバエの脳のカルシウム イメージング前のヴィヴォのプロトコルについて説明します。この方法で天然または合成化合物は、脳の特定の神経細胞をアクティブにする能力をテストするバッファーに適用できます。

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

ex-vivo-calcium-imaging-for-visualizing-brain-responses-to-endocrine

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

9.1K ビュー.  Nagoya University. 本稿では、ショウジョウバエの脳のカルシウム イメージング前のヴィヴォのプロトコルについて説明します。この方法で天然または合成化合物は、脳の特定の神経細胞をアクティブにする能力をテストするバッファーに適用できます。

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Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

の臭気誘発応答のカルシウムイメージングショウジョウバエ触角葉

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

神経科学

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivoセル固有カルシウム マウス ダイヤフラムの三者のシナプスでシグナル伝達のイメージング

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

行動と刺激反応の間に全脳イメージングのための成人ショ ウジョウバエメラノガスター を準備する

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

マウスの神経節神経節ニューロン反応のインビボカルシウムイメージングが味覚刺激に反応する

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

インビボ マウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

生体内のトランスジェニックマウスにおける脳ペリサイトカルシウムと血行力学イメージング

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Ex Vivoショウジョウバエにおける内分泌シグナル伝達する脳の反応を可視化するためのカルシウム イメージング

Ex Vivoショウジョウバエにおける内分泌シグナル伝達する脳の反応を可視化するためのカルシウムイメージング