改善し、実際の状態にこれらのテクニックを絞り込むに役立つ演習の古いメンバーに感謝したい: 博士シーリア ・ マルティネス-モーラ;博士アンナ Mrowiec、博士カタリナ ルイス自慢、博士アントニア ・ アルカラス ガルシア。これらの技術の開発を強く支援病院臨床ウニベルシタリオ ビルゲン デ ラ Arrixaca にお世話になっております。セルバンテス ・ デ ・またサラッド カルロス 3 世、フォンド ・ デ ・研究 Sanitarias。Estatal を計画私 + D + 私とセルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス III Subdirección 一般 06 y 開発デ ラ危惧 (許可番号: PI13/00794);www.isciii.es. Fondos ・ フェダー「Una manera デ hacer エウロパ」。我々 も行政も支援をグァテマラ ・ デ ・ ムルシア、IMIB Arrixaca、外国金融機関に感謝します。最後に、我々 は博士イサベル ・ マルチネス-Argudo と Facultad デ芸術報 Ambientales y Bioquímica、キャンパス ′ デ ラ Fábrica デ アルマス、グァテマラ カスティーリャ ・ ラ ・ マンチャ州、トレド喜んで譲ることで彼らの親切なサポートのおかげでスペシャルを与えたい、バイオ医薬品と本稿の撮影の一部を実現するためのバイオ テクノロジー研究室。

1. 人工傷スクラッチ アッセイ定量的研究
<ol>
	<li>セル膜の準備
	<ol>
		<li>無菌状態の下で働いて、シードし、血清添加培地を用いた培養フラスコに Mv1Lu または HaCaT 上皮細胞を成長します。一度、すべての 24-48 h 媒体を更新します。電池が 80% の合流点に達する後、適切な方法、すなわちtrypsinization9を使用してセルをデタッチします。 注: Mv1Lu と実装された EMEM と DEMEM の培養液を使用して上皮細胞株を培養している HaCaT それぞれ 2 mM L-グルタミンを添加したし、5% CO2の制御された雰囲気と 37 ° C で培養しました。すべての細胞株は細胞濃度と完全 confluency に達するに必要なタイミングを決定する徹底的に試金する必要があります。通常 Mv1Lu または HaCaT 細胞の x 10 の4または 104細胞/ウェル、x 4-6 2 4 それぞれがシード 175 cm2培養用フラスコのと最大 35 x 106 Mv1Lu または 1 × 107 HaCaT 細胞 80% で合流点が得られます。</li>
		<li>どちらかの 12、または 24 ウェル培養プレートの各ウェルの細胞の 2 mL の種子します。すべて 24-48 h. 確認セル番号が 2 または 3 日後 100% の合流点に到達するために十分に高い媒体を更新します。</li>
		<li>細胞に達すると合流、血清添加培地を取り除き、新鮮な無血清培地で 2 回洗います。スクラッチ前に 24 h の無血清培地で細胞を保ちます。 注: Mv1Lu または HaCaT 細胞に特殊な基板の要件はありません。ただし、セルライン無血清条件下で自発的にデタッチに影響を受けやすいためポリ L リジン溶液を用いた培養プレート面の塗装の前処理する必要があります10と見なされます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>単分子膜傷
	<ol>
		<li>しっかりと 20 μ L またはスクラッチの幅に応じて、200 μ L 滅菌ピペット先端の狭い端をドラッグして文化単層をスクラッチ無菌環境で作業します。先端のギャップの均質性を最大化する文化面に垂直を維持します。<ol>
			<li>明らかに単層細胞を監視する暗い表面上培養皿に置きます。必要な場合は、各ウェル 4 移行の領域まで勉強するの (十字型) 2 つの垂直の傷を実行します。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>軽く培と優しく追加新鮮な無血清培地を削除して剥離細胞を洗ってください。2 回繰り返す最も接続されていないセルを削除するまで、または。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>実験の手順とデータ収集
	<ol>
		<li>まあ CCD カメラを組み込んだ倒立位相差顕微鏡を使用して各からスクラッチのギャップを中心とした最大 4 前処理参照画像を取る。傷の隣接する交差点に顕微鏡フィールドの端を合わせて、関心領域を選択します。 注: 通常、画像を用いている 10 倍の倍率、1,280 x 1,024 ピクセルのイメージ サイズ。前述のローカライズを容易およびウェルあたり最大 4 測定法の検証のために役立ちますようの関心領域を選択します。</li>
		<li>一度すべての画像を取得、指定治療井戸;選択した治療法を含む新鮮な培地で井戸に培地を交換します。 注: また、化学物質や培養液の均質性を邪魔しないで化合物は、治療できます再接種される培養液に直接。</li>
		<li>観測範囲 90% スクラッチ ギャップ閉鎖条件まで傷プレート (5% CO2を含む制御された雰囲気の 37 ° C) を孵化させなさい。完全な閉鎖を避けるため。 注: 合計ギャップ閉鎖の後処理の画像コレクションを無効リファレンス領域が検出されないし、ギャップの閉鎖のために参照を確立できません。Mv1Lu または HaCaT 細胞の場合 16-19 h は 90% の合流点に到達する必要があります。</li>
		<li>したセルを固定することによって細胞遊走を停止します。優しく実験の培養液を 1 mL の PBS で 4% ホルマリンに置き換えます。室温 15 分間インキュベートします。</li>
		<li>過剰なホルマリンは; を削除するセルを洗浄して軽く新鮮な PBS の井戸にソリューションを取り付けます。2 回以上を繰り返します。 注: この段階で封止後プレートが 4 ° C で不明確に保存されます。</li>
		<li>傷後キャプチャ元の参照領域から各ウェルの治療後の参照画像を取る。同じ機器 (倒立光学位相差顕微鏡 CCD カメラを組み込んだ) と一致する画像の設定 (倍率とデジタル解像度/密度) を使用します。 注: 個々 のセル移行速度の計算ができる可能性があります時間コース画像を個別に移行し、フロントがコヒーレント (例えば、MDA MB 231 乳房癌細胞) の形成とは無関係のギャップを埋める細胞としていること。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移行の画像解析と定量
	<ol>
		<li>画像処理ソフトウェア (例えばImageJ) を使用すると、スクラッチ ギャップ制限を定義し、治療前の写真で 4 つまでの測定のための gap 表面を決定します。「表面前処理ギャップ」としてデータを記録 (PREGAP)。治療後の写真は、同じ手順を繰り返します。「治療後ギャップの表面」としてデータを記録 (POSTGAP).<ol>
			<li>ImageJ を使用して記録された画像を開きます。「画像」メニューで画像の種類を 8 ビットに設定します。「プロセス」メニューで「フィルター」サブメニューに移動し、、"変動"のフィルターを適用。</li>
			<li>「画像」メニューで"調整"サブメニュー黒と白に設定されたしきい値を入力してください (B &#38; W)、「暗い背景」が選択されていないことを確認します。「プロセス」メニューの"バイナリ"サブメニューに移動し、「穴を埋める」を選択します。</li>
			<li>「分析」メニュー「測定を設定」を選択、「エリア」アクティブに。測定領域次のギャップを区切る移行のエッジの輪郭を描画します。</li>
			<li>「分析」メニューの「粒子の分析」を選択し、描画エリア表面の「合計領域」の値を記録します。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>ギャップ表面測定の差として個々 のサンプルのセットごとに絶対移行を定量化するスプレッドシートの PREGAP、POSTGAP の総面積値を紹介: プリギャップ − POSTGAP [任意単位]。さらに、各コントロールのサンプル条件の絶対移行データを正規化: (サンプル ・制御) * 100 [%]。 注: セルを個別に移行し、フロントがコヒーレント (例えば、MDA MB 231 乳房癌細胞) の形成とは無関係のギャップを埋める、絶対移行により計算できる中央に侵入セルをカウントのいずれかのストリップコントロールまたは扱われたサンプル。</li>
		<li>(図 1参照) 数量出力をプロットします。必要であれば、統計分析を実行します。</li></ol></li></ol>2 つの条件または条件の大きい数のための分散分析のテストを比較するときは、スチューデントの t 検定を検討してください。
	
	

2. 人工移行フロント アッセイ地形の研究
<ol>
	<li>セル膜の準備
	<ol>
		<li>無菌状態での作業は、プレートの表面が完全に覆われるまで空培養皿に滅菌ラウンド coverslips の 1 つのレイヤーを配置します。 注: 12 と 33 coverslips までに収まる 5 cm と 10 cm 径プレート、それぞれ。</li>
		<li>培養プレートに 2 〜 3 日後 100% 合流ができる濃度で細胞の十分な量を優しくシードします。Coverslips が滅菌ピペット先端で穏やかな圧力を適用することによって浮遊するを防ぐし、coverslip が隣接 coverslips 重なっていないかどうかを確認します。媒体ごとの 24-48 時間を更新します。 注: すべてのセルの行を徹底的にで検定して細胞濃度と完全 confluency に達するに必要なタイミングを決定する必要があります。通常 Mv1Lu または HaCaT 細胞の 2-3 x 10 の6または 10 の6セル/10 cm 径プレート x 2.5-4、それぞれシードされます。小さめの皿で細胞数をスケール ダウンする必要があります。</li>
		<li>細胞に達すると合流、血清添加培地を取り除きし、新鮮な無血清培地に置き換えます。人工傷を実行する前に、24 h の無血清培地で細胞を維持します。 注: Mv1Lu または HaCaT 細胞に特殊な基板の要件はありません。ただし、細胞無血清条件下で自発的にデタッチの影響を受けやすいのポリ L リジン溶液を用いた培養面の塗装の前処理する必要があります10と見なされます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>単分子膜を傷つける
	<ol>
		<li>滅菌ピンセットを使用して、優しく新鮮な無血清培地を含むクリーン 10 cm プレートに観察を移動します。ピンセットで周囲に、coverslip を保持することによって、単分子膜の損傷を防ぐ。Coverslip 破損の恐れのある過度の圧力を避けます。</li>
		<li>人工傷を作成するには、coverslips の中央に横ラインの殺菌かみそりの刃をドラッグします。中央の単分子膜のストリップを完全に削除するために戻って来たり、3-4 mm をドラッグします。細胞の残骸残って負傷のエッジに接続されていないことを確認します。 注: 12 mm 径の coverslip、ラウンド、切開で、半ば、カバーガラスの。以下の手順でカバーガラスの傾斜を避けるために (少なくとも 2 mm 幅) 十分に大きい主な正面の反対側セルの連勝を残してください。</li>
		<li>きれいな 6 ウェル プレート含む少なくとも 2 mL 新鮮な無血清培地に、上向きのセルと負傷者 coverslips を転送します。最大 4 負傷 coverslips/よくに合います。</li>
		<li>水洗いして 2 回使用新鮮な無血清培地戸建のセルを削除します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>実験方法及びサンプリング
	<ol>
		<li>優しく選択した治療法を含む新鮮な培地で井戸に培地を交換します。 注: また、化学物質や培養液の均質性を邪魔しないで化合物は、治療できます再接種される培養液に直接。任意の潜在的な細胞の剥離を避けるために慎重に進みます。</li>
		<li>目的の実験的タイミング (37 ° C、5% CO2) セル インキュベーター内のプレートを保ちます。</li>
		<li>したセルを固定することによって細胞遊走を停止します。優しく実験の培養液を 1 mL の PBS で 4% ホルマリンに置き換えます。室温 15 分間インキュベートします。 注: コース実験の時間のため培養プレートからサンプルを削除、その他、継続的な実験条件に影響を及ぼすホルマリン煙を避けるために別皿でそれらを修正します。</li>
		<li>過剰なホルマリンは; を削除するセルを洗浄して軽く新鮮な PBS の井戸にソリューションを取り付けます。2 回以上を繰り返します。 注: この段階で封止後プレートが 4 ° C で不明確に保存されます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛍光抗体法 (IF) とトポロジー解析
	<ol>
		<li>IF の染色を行いとして個々 coverslips にイメージングは別記3,4,11。<ol>
			<li>Coverslips PBS で 0.3% トリトン X-100 溶液を浸すことによって 10 分間 permeabilize します。</li>
			<li>次のブロックのソリューションを使用して 30 分間ブロック: 0.3% ウシ血清アルブミン。10% 牛胎児血清;5% のスキムミルク。PBS で 0.3% トリトン X-100 溶液。 注: ミルクなし解決を妨げること事前に準備ができ-20 ° C で保存</li>
			<li>牛乳無料ブロッキング液で希釈した一次抗体と湿ったチャンバ内の室温で 1 時間インキュベートします。Coverslips に逆さまの状態で適切な配分を確保するため 15 μ L 抗体溶液を配置します。 注: 抗体作業希釈は、変数は、使用している抗体に依存します。たとえば、ウサギ抗 c 6 抗体は 1/100 希釈を必要とします。</li>
			<li>PBS での 0.1% トリトン X-100 溶液で coverslips を浸すことによって 3 回を洗浄します。</li>
			<li>30 分間無料のミルク ブロック バッファーで希釈した二次抗体に coverslips を孵化させなさい。 注: 抗体作業希釈は、変数は、使用している抗体に依存します。たとえば、ヤギ抗うさぎ (488) は、最適な解像度の 1/400 希釈を必要とします。ヘキスト 33258 ファロイジンなど他の標識化合物は、この段階でインキュベーション バッファーに追加できます。</li>
			<li>PBS で 0.1% トリトン X-100 溶液 coverslips を浸すことによって 3 回を洗浄します。</li>
			<li>Coverslips 逆さまの状態で 10 μ L マウント メディア ドロップ (例えばVectashield) 顕微鏡スライド上に配置をマウントします。取付中硬化一晩室温で暗闇の中でスライドを残します。その後、無期限に暗闇の中で 4 ° C で保存します。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>落射蛍光または移行の前面の端で発生した構造変化の共焦点顕微鏡画像のいずれかを取得します。 注: トポロジー研究は、内側の膜に移行する前から写真を並べて実行できます。半定量的な研究がローカル蛍光強度に基づくソフトウェア分析によって可能です。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Singer, A. J., Clark, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+wound+healing.">Cutaneous wound healing.</a> N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).</li><li>Davidson, J. 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著者は、利害の対立がないことを宣言します。

皮膚または粘膜の破壊、線維芽細胞、上皮や免疫細胞など、様々 な細胞タイプの行動によってバリア機能が復元されます。相まって、これらの細胞を受ける複雑なアポトーシス、増殖、分化、重要なは、線維芽細胞を含むプロセスと上皮細胞の移行、混乱の組織の修復のための責任の究極のメカニズムであると表在性上皮ギャップ1,12細胞遊走を勉強したがっての閉鎖も傷の治療の調節の可能性を決定する際に上皮細胞の生理学的な現象を正確に記述することができます。癒し。
生理的条件2の近くでこの複雑なプロセスのレプリケーションおよびこうしていくつかの病理学の条件の評価や医薬品の効果の研究の動物モデルに人工傷を実行できるように治療13。しかし、このアプローチは多くの場合遅延ファッション13のデータを生成する可能性が負担の実験プロシージャと同様に、高価で複雑な物流の結果します。それどころか、体外培養は、創傷治癒過程で細胞の挙動を調査するためより便利なフレームワークを提供します。上皮細胞の初代培養では、実行可能な選択肢が構成する間を取得し、データ収集を複雑にすることができます細胞を処理することは困難ことです。例えば、初代培養の典型的な低通過制限に加えて、プライマリ ヒト角は線維芽細胞成長体外3層を供給を必要があります。Mv1Lu や HaCaT のような確立された上皮細胞培養は並ぶ初代培養細胞3,4のそれらのような特性、機能動作の障害自由な研究モデルを構成するどころか、 14,15。正確には、創傷治癒に関する研究のこれらの 2 つの細胞株は移行して合流16,17時に細胞間連絡阻害による増殖を停止する能力の重要な特性を保持します。
スクラッチ アッセイは、異なる種類の細胞、特に上皮やがん細胞の渡り鳥の機能を定量化するための信頼性と汎用性の高い方法です。癌細胞の場合、浸潤能の評価のためスクラッチ法が提案されています。ただし、このアプローチは、細胞外マトリックス18,19を貫通に必要な分解酵素の発現に依存するより具体的な方法と比較して侵襲性の指標としては足りない。逆に、スクラッチの試金は上皮細胞の渡り鳥のパフォーマンスとこの特性のさまざまな治療法の効果を評価するための信頼できます。癌細胞ラインと対照をなして頻繁凝集度の不足、その他上皮細胞線しっかりと関連付けられたフォーム「成長島」、両方によってプロセスでそのマージンを拡大、HaCaT、Mv1Lu いくつかの層に成長する能力を表示します。増殖、しかし、もっと重要なことに細胞の移動。したがって、スパースまたはサブ コンフルエントの細胞密度条件使用されている渡り鳥生理学; さまざまな治療法の効果の研究特にその後の分子生物学の技術を適用すると、このセルとして環境が最小化接触阻害細胞積極的に移行の割合を最大化しながら。ただし、上皮細胞の非合流条件はエピジェネティック制御の形で、例えば、重要な既存の接触阻害影響を除くのリスクをもたらします。したがって、創傷治癒を勉強する合流条件はモデルの忠実度の増加を与えます。
正確な見積もりを得るためには、上皮細胞層の構造に影響を与えるまたは移行に貢献して併用の要因を対処すべき。合流が望まれる中、これらの条件に悪影響を与える可能性がありますので、過剰な細胞密度や多層文化を避けるために重要です。したがって、増殖が一般的または制御されて血清自由な媒体の飢餓による不可逆的 DNA 架橋3,20,細胞の増殖を阻止するマイトマイシン C のような化学物質の添加による21. どちらか一方の使用が特定のセル行の動作に依存します。マイトマイシン C は血清添加が大規模な細胞の剥離を避けるために必要が減少したときに特に示されます。HEK 293 t 細胞の場合、事前ポリ L リジンを使用して文化面にコーティング Mytomycin C 治療を避けるために良いオプションです。移行を変えることができる炎症性因子のリリースも対処する必要があります。主にスクラッチ アッセイ22達成上皮表面の中断を模倣するシリコン挿入に基づいて、異なる戦略が使用されています。挿入は、シリコン部分を削除した後のセルの移行を許可する既存のギャップを生成する、スクラッチ法いくつかのギャップを生成する上皮膜の除去に直接依存しています。好みのギャップを生成する方法についても可能性があります損傷した細胞から要因の放出を最小限に抑えながら、傷の間に損傷から文化表面コーティング (すなわち、培養プレートやポリ L リジン) を保護するために挿入の能力に依存します。細胞文化行動23を危険にさらします。これらの特性は、すなわち、移行する癌細胞の能力を評価するいくつかの実験的設定の役に立つかもしれないが我々 の経験でわかった重大な欠点創傷治癒の研究で挿入を使用するため。Mv1Lu 細胞はシリコンの挿入外表面には、意図せずシリコン部分の除去時に細胞膜の断裂の結果にアタッチできます。また、細胞は、シリコーンには接続しないでください、挿入によるギャップに移行するこれらの細胞の能力が低下した我々 発見します。程度、炎症と移行は、密接に関連付けられての反応と HaCaT 細胞における創傷治癒のコンテキストに一緒に重要でこれらが表示されます。また、HaCaT 細胞の場合、ギャップを再作成する細胞の能力上に培養面の傷のためプラスチックのヒントを適用することがある明白な結果ないのでそのような行動を示唆しているギャップの細胞外マトリックスの残党が移行をガイドがあります。自然傷の真皮と同様のファッション。ただし、変動の主な情報源はまま傷を作るプラスチックの先端の使用が常に同じサイズのギャップをレンダリングされませんスクラッチ プロシージャ自体です。我々 は圧力の矛盾とスクラッチの時に先端の位置のための異なるサンプルの間で 20% までの変化を観察しました。これらのバリエーションはより剛体と単分子膜を負傷で対処できます。ただし、プラスチックの表面にキズ、細胞の自由な移動を危険にさらすでしょう。だから、初期の最初の変化する必要があります考慮する移行を計算するには通常、条件ごとの測定数増。
細胞遊走の分子プロセスを評価するには定量化、に加えて古典的な場合のテクニックと共に負傷の手順を適用する質的。Coverslips に成長する上皮細胞の機能はよく知っています。過去には、スクラッチのバリエーション続いて修正、傷傷実験セットアップ24内比較染色さまざまな条件にさらされる coverslips に移行する関与して細胞の試金します。ここでは、実験時間コース3,4,7を拡張するためできる coverslips に成長して単分子膜における広いギャップを作成することがわかった。さらに、これらの実験が増加可能性があります、正確な細胞および細胞内メカニズムを研究するプロシージャの検出機能、およびこの手法に適した抗体性による制限だけで、興味のセル。Coverslips 場合用のサンプルは、拡張保護を可能にする顕微鏡のスライド マウントされます。「タイリング」方法紹介されてここと他3,47のような長い研究期間必要とする実験のセットアップのアプリケーションに役立ちます。ソフトウェア分析ツールの実装は、ローカル蛍光値による半定量的な評価を提供する「タイル」戦略は、時系列データの移行に関与するメカニズムを再構築するための空間パターンを統合し中、強度、得られる情報の質のさらなる充実。我々 の経験でタイルはまたこのタイプの試金蛋白質の発現のセル位置情報の研究の可能性を提供しています。この位置情報は、理解し、上皮細胞の位置は、渡り鳥の行動3 を決定する非常に重要なセットアップを中心に、細胞の移動における異なる剤の効果をより良い翻訳を重要であると示されています。 ,4,14,15。
説明した両方の手順は、品質データの生産と同様、単純な実装では、大きな利便性を示します。したがって、顕微鏡を用いた研究に基づいていますこれらのアプローチは、ダイナミクスと上皮細胞の動作に関与する形態的変化の両方を研究するユニークでパワフルなフレームワークを提供し、中に治療への応答は創傷治癒します。

上皮のギャップの最終的な閉鎖と混乱の表面1の修復を担当しており、細胞遊走は創傷治癒に必要です。動物モデルにおける人工傷を実行できるように生理的条件2の近くでこの複雑なプロセスを複製するため。しかし、このアプローチは多くの場合コストがかかり、複雑な実験の手順、可能性のある創傷治癒過程の複雑な性質のための明確なプロセスの研究の精度を欠いている結果します。
上皮細胞の体外培養は、創傷治癒や処理セルの回遊行動に及ぼす影響のこれらの細胞が果たす役割を研究するため動物モデルの有用な代替を提供します。上皮細胞の生理学は非合流文化3,4,5,6; を使用して分子技術によってよく勉強しました。ただし、上皮整合性の破壊は結構機械的切開により通常。細胞培養、細胞のほとんどの数は、傷のギャップにさらされるかもしれないし、彼らは分子生物学の技術のための余りに小さいサンプルを表すこれを意味します。ただし、これらの病変は、ミンク肺上皮細胞 (Mv1Lu) または自然不死化ひと表皮細胞 (HaCaT) セルなど、いくつかの上皮細胞ラインの生得的な渡り鳥の特性を利用して、顕微鏡のスケールで学ぶことができます。ライン。
ここでは創傷治癒の3,4,7,8のコンテキストにおける上皮細胞の移行に関する定量的データを取得する適切な顕微鏡法について述べる。また、移行上皮膜で発生した質的分子および形態学的変化を研究に役立つその他の方法を提案する.全体的にみて、これらのメソッドは、創傷治癒過程におけるダイナミクスと上皮細胞の挙動と治療への応答に関与の形態的変化を研究するためのフレームワークを提供します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td>L0102-500</td>
			<td>Optional 10 % FBS supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagles&#8217;s Minimum Essential Medium (EMEM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12 -662F</td>
			<td>Optional 10 % FBS supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td>Use at 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>DE17603A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Dilute as appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14200-067</td>
			<td>Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plates</td>
			<td>BD FALCON//SARSTED</td>
			<td>734-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Used 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass</td>
			<td>MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>MENZCB00120RA020</td>
			<td>SHORT DEPTH OF FIELD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reinforced razor blade no. 743</td>
			<td>Martor (through VWR)</td>
			<td>MARO743.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l sterile aerosol pipet tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-0541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;l sterile aerosol pipet tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-0528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera coupled phase contrast microscope</td>
			<td>Motic Spain</td>
			<td>Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>ZEISS Microimaging, Germany</td>
			<td>LSM 510 META</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Culture dish</td>
			<td>BD FALCON</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-1694</td>
			<td>Used 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Used 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33258</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>14530</td>
			<td>Used 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12381</td>
			<td>Used 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-2323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>BD DIFCO</td>
			<td>232100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td>Release 1.50i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen LSM 510 image processing software</td>
			<td>ZEISS Microimaging, Germany</td>
			<td>Release 5.0 SP 1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy based methods for the assessment of epithelial cell migration during in vitro wound healing

細胞遊走は、創傷治癒に必須の側面です。人工を作成する傷を研究の動物モデルにコストがかかり、複雑な実験手順の結果にしばしば潜在的精度に欠けている間。上皮細胞の体外培養は、創傷治癒と細胞の治療法の影響で細胞の回遊行動の研究のため適切なプラットフォームを提供します。上皮細胞の生理学は非合流条件でよく勉強しました。ただし、このアプローチは、自然治癒で条件に類似しないかもしれない。機械的手段によって上皮の整合性を中断することは現実的なモデルを生成しますが、分子技術のアプリケーションを妨げることがあります。したがって、顕微鏡技術は上皮細胞の遊走を勉強に最適体外。ここで我々 は, 上皮細胞の渡り鳥の性能に関する量的・質的データを入手できる人工移行フロント アッセイ、人工傷スクラッチ試験 2 つの特定の方法を詳しく説明します。

定量的研究のため人工傷スクラッチ試金: 移行上皮成長因子 (EGF) 推進を評価します。
EGF は、上皮細胞の増殖と移行、およびこうして移行推進を定量化するための肯定的な制御のよく知られている誘導です。Mv1Lu と HaCaT 細胞膜が傷傷試金で使用された、治療前の写真が得られました。10 ng/ml の EGF, 接種後のセルは固定と治療後の写真の前に 19 時間培養。増殖は、血清飢餓条件を維持することによって最小に保たれました。ImageJ を用いた画像の前処理および後処理のセット分析し、中央ギャップ領域を調べた。重複しているためにも、各 4 つのサイズを登録するのに実験を実行します。表面の差として算出した絶対移行の定量化: (プリギャップ − POSTGAP)。刺激 HaCaT 細胞 (図 1 b) と比較して刺激 Mv1Lu 細胞 (図 1 a) に大きな渡り鳥可能性があった。違いはセル源によって説明されて粘膜上皮細胞、ケラチノ サイト、それぞれの皮膚します。
地形の研究人工移行フロント試金: 細胞骨格構造と C 6 月の空間表現のバリエーション。
細胞の移動は、セルの変位を維持するために細胞骨格構造の継続的かつ深い変化を伴います。HaCaT 細胞膜は、コントロールおよび刺激条件下における移行フロント試金で使用されました。EGF と治療を促進する場合によって観察される、レーザ走査顕微鏡 (LSM; 細胞骨格の動態図 2 a)。EGF トリートメントは、堅牢な Mitogen-Activated 蛋白質 (地図) キナーゼ シグナル伝達と C-JUN の発現にもなります。空間パターンの構成 LSM の画像を並べて表示できます。移行する前に隣接するセルで 6 月の c の発現の増加することができます簡単にソフトウェア イメージ分析によって明らかにされます。ここでは、c 6 月ラベル (図 2 b) に対応する緑のチャンネルにレインボー スケールを実施しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56799/56799fig1.jpg"> 
図 1。Mv1Lu および HaCaT 細胞における EGF による移行の推進です。Mv1Lu の負傷した領域の位相差顕微鏡像 (A) と (B) 細胞の制御条件の下で撮影されたし、10 ng/mL で EGF 19 h の無血清条件下で細胞の画像と比較して。代表的な顕微鏡は、スクラッチのギャップと 20 μ L マイクロ ピペット チップと負傷後に得られる閉鎖の範囲を示します。倍率 = 10 x;スケールバー = 100 μ m ですセル移行は定量化され、治療とコントロールのサンプルそれぞれの試金 (任意の単位; のための地域違いのバリエーションとして表されます。AU)。プロットは、条件ごとに 8 つの独立した測定の代表です。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56799/56799fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56799/56799fig2.jpg"> 
図 2。アクチン フィラメントと移行する細胞に EGF によって促進される c 6 月式変更します。(A) 一晩 10 ng/mL EGF 治療移行 HaCaT 細胞内アクチン フィラメント構造の深遠な変更を促進します。細胞制御条件の移行前にしっかりと構造化されたアクチン フィラメントの細胞骨格を描く、EGF で細胞治療移行前で貧しいアクチン フィラメントの構造を示します。倍率 = 63 x;スケール バー = 20 μ m. F アクチンは色分けされた赤、ヘキストは青色で表されます。(B) タイル組成が空間的発現パターンを明らかにする免疫蛍光を移行細胞に 10 ng/mL EGF 治療後 c 6 月表現を勉強する LSM イメージングとの組み合わせで使用する場合。C 6 月蛍光 (緑) の画像は擬似カラー c 6 月染色の強さを示すために変えられました。カラー レインボー スケールは、c - ジュン、EGF とコントロールの右側のパネルにカラーマップに対応する蛍光強度を表します。ファロイジン (赤) とヘキスト 33258 (ブルー) 染色は細胞の構造と核をそれぞれ表示する使用されました。共焦点顕微鏡画像が撮影されました。6 月 c 核移行前に近づいている地区の増加の表現のレベルに注意してください。スケール バー = 40 μ m.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56799/56799fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

本稿では培養上皮細胞は、どのように切開のような病変便利なモデルの傷癒しの in vitro、共焦点イメージングを可能にするについて説明しますまたはレーザ走査顕微鏡と高品質を提供することができます。細胞の挙動と移行に関与するメカニズムの両方の研究のための質的・量的データ。

顕微鏡法によるIn Vitro創傷が治癒過程における上皮移行の評価

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

microscopy-based-methods-for-assessment-epithelial-cell-migration

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

9.2K ビュー.  IMIB-Arrixaca. 本稿では培養上皮細胞は、どのように切開のような病変便利なモデルの傷癒しの in vitro、共焦点イメージングを可能にするについて説明しますまたはレーザ走査顕微鏡と高品質を提供することができます。細胞の挙動と移行に関与するメカニズムの両方の研究のための質的・量的データ。

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Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

三次元異<em&gt; in vitroで</em卵巣がんの発生と進行中に間質相互作用の上皮&gt;モデリング

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

医学

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

創傷治癒のマウスモデル

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

マウス内視鏡検査のため<em&gt;インビボ</em&gt;発がんと腸の評価のマルチモーダルイメージング創傷治癒および炎症

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The etiology of IBD remains unknown and current therapeutic strategies are based on the unspecific suppression of the immune system. The development of treatments that specifically target intestinal inflammation and epithelial wound healing could significantly improve management of IBD, however this requires accurate detection of inflammatory changes. Currently, potential drug candidates are usually evaluated using animal models in vivo or with cell culture based techniques in vitro. Histological examination usually requires the cells or tissues of interest to be stained, which may alter the sample characteristics and furthermore, the interpretation of findings can vary by investigator expertise. Digital holographic microscopy (DHM), based on the detection of optical path length delay, allows stain-free quantitative phase contrast imaging. This allows the results to be directly correlated with absolute biophysical parameters. We demonstrate how measurement of changes in tissue density with DHM, based on refractive index measurement, can quantify inflammatory alterations, without staining, in different layers of colonic tissue specimens from mice and humans with colitis. Additionally, we demonstrate continuous multimodal label-free monitoring of epithelial wound healing in vitro, possible using DHM through the simple automated determination of the wounded area and simultaneous determination of morphological parameters such as dry mass and layer thickness of migrating cells. In conclusion, DHM represents a valuable, novel and quantitative tool for the assessment of intestinal inflammation with absolute values for parameters possible, simplified quantification of epithelial wound healing in vitro and therefore has high potential for translational diagnostic use.

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

デジタルホログラフィック顕微鏡とマルチモーダル定量位相イメージングは​​、正確に腸の炎症および上皮創傷治癒を評価します

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients with impeded blood flow or with large wounds might be prolonged. Cell-based therapies have appeared as a new technique for the treatment of diabetic ulcers, and cell-sheet engineering has improved the efficacy of cell transplantation. A number of reports have suggested that adipose-derived stem cells (ASCs), a type of mesenchymal stromal cell (MSC), exhibit therapeutic potential due to their relative abundance in adipose tissue and their accessibility for collection when compared to MSCs from other tissues. Therefore, ASCs appear to be a good source of stem cells for therapeutic use. In this study, ASC sheets from the epididymal adipose fat of normal Lewis rats were successfully created using temperature-responsive culture dishes and normal culture medium containing ascorbic acid. The ASC sheets were transplanted into Zucker diabetic fatty (ZDF) rats, a rat model of type 2 diabetes and obesity, that exhibit diminished wound healing. A wound was created on the posterior cranial surface, ASC sheets were transplanted into the wound, and a bilayer artificial skin was used to cover the sheets. ZDF rats that received ASC sheets had better wound healing than ZDF rats without the transplantation of ASC sheets. This approach was limited because ASC sheets are sensitive to dry conditions, requiring the maintenance of a moist wound environment. Therefore, artificial skin was used to cover the ASC sheet to prevent drying. The allogenic transplantation of ASC sheets in combination with artificial skin might also be applicable to other intractable ulcers or burns, such as those observed with peripheral arterial disease and collagen disease, and might be administered to patients who are undernourished or are using steroids. Thus, this treatment might be the first step towards improving the therapeutic options for diabetic wound healing.

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Adipose-derived stem cells (ASCs) are easily isolated and harvested from the fat of normal rats. ASC sheets can be created using cell-sheet engineering and can be transplanted into Zucker diabetic fatty rats exhibiting full-thickness skin defects with exposed bone and then covered with a bilayer of artificial skin.

作成および糖尿病創傷治癒モデルにおける脂肪由来幹細胞 (ASC) シートの移植

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is often capped with biocompatible materials in order to expedite pulpal wound healing. The ultimate goal is to regenerate reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" and protects the underlying pulp tissue. Although this direct pulp-capping procedure has long been used in dentistry, the underlying molecular mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is still poorly understood. To induce reparative dentin, pulp capping has been performed experimentally in large animals, but less so in mice, presumably due to their small sizes and the ensuing technical difficulties. Here, we present a detailed, step-by-step method of performing a pulp-capping procedure in mice, including the preparation of a Class-I-like cavity, the placement of pulp-capping materials, and the restoration procedure using dental composite. Our pulp-capping mouse model will be instrumental in investigating the fundamental molecular mechanisms of pulpal wound healing in the context of reparative dentin in vivo by enabling the use of transgenic or knockout mice that are widely available in the research community.

We describe a step-by-step method of performing direct pulp capping on mice teeth for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo.

歯髄の評価のための直接覆髄モデルの開発、創傷治癒およびマウスにおける修復象牙質形成

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to injury. In fact, the most common type of eye injury found in clinic is a corneal abrasion. Here, we utilize an ocular burr to induce an abrasion resulting in removal of the corneal epithelium in vivo on anesthetized mice. This method allows for targeted and reproducible epithelial disruption, leaving other areas intact. In addition, we describe the visualization of the abraded epithelium with fluorescein staining and provide concrete advice on how to visualize the abraded cornea. Then, we follow the timeline of wound healing 0, 18, and 72 h after abrasion, until the wound is re-epithelialized. The epithelial abrasion model of corneal injury is ideal for studies on epithelial cell proliferation, migration and re-epithelialization of the corneal layers. However, this method is not optimal to study stromal activation during wound healing, because the ocular burr does not penetrate to the stromal cell layers. This method is also suitable for clinical applications, for example, pre-clinical test of drug effectiveness.

This protocol describes a method to inflict an abrasion to the ocular surface of the mouse, and to follow the wound healing process thereafter. The protocol takes advantage of an ocular burr to partially remove the surface epithelium of the eye in anaesthetized mice.

角膜上皮摩耗眼はりのモデルとして角膜創傷治癒

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.

前のヴィヴォ角膜器官培養モデルの創傷治癒の研究

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the lower extremities, hyperhidrosis, etc. It is commonly practiced to position the puncture needle tip in front of the anterior fascia of the psoas major muscle and inject the inactivating agent around the sympathetic trunk, which is defined as conventional CLS. Although relatively rare, ureteropelvic damage is the most frequently reported complication of conventional CLS and can cause serious harm to patients. We found that injecting the inactivating agent behind the anterior fascia, which only targets gray rami communicantes, helped achieve therapeutic efficacy in&#160;vasodilation, sweat reduction, and pain relief comparable to conventional CLS, and serious complications were largely reduced. We define this procedure as selective CLS. Here, we present a protocol of selective CLS. The precise needle tract and accurate evaluation of the spreading of the contrast agent are critical to ensure that the drug is injected behind the anterior fascia of the psoas major muscle. The needle tip is at approximately one-third the dividing line of the vertebral body in the lateral view of a lumbar X-ray. The contrast is mainly confined around the needle tip and spreads outward and downward along the psoas muscle fibers. In this way, the anterior fascia provides a natural barrier for the ureteropelvic area, and the psoas major muscle provides a natural barrier for the lumbar nerve root. There are several highlights of this article, including 1) a detailed description of the selective CLS procedures, 2) an explanation of the anatomical basis for the implementation of selective CLS, and 3) an explanation of the differences between selective and conventional CLS.

We present a protocol for selective chemical lumbar sympathectomy (CLS), which inactivates only gray rami communicantes and not the sympathetic trunk. Selective CLS can help achieve therapeutic efficacy in vasodilation, sweat reduction, and pain relief that are comparable to conventional CLS, and serious complications, particularly ureteropelvic damages, can be reduced.

ターゲット灰白交通枝選択的化学腰椎交感神経切除術で

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the ...

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

インビトロおよび創傷治癒の生体内分析のためのスクラッチ移行アッセイとドーサルスキンフォールドチャンバー

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...