We thank Faekah Gohar for proofreading the manuscript. We thank Sonja Dufentester and Elke Weber for expert technical assistance.

The authors have nothing to disclose.

私たちは、DHMは、ex vivoでのマウス大腸炎モデルおよびヒトの結腸組織試料における組織学的損傷の正確な評価を提供することを実証している。また、我々は、DHMが連続的に同時に携帯の変化についてのマルチモーダル情報を提供しながら、上皮創傷治癒を監視することができます示します。 DHMでは、デジタルで撮影したホログラムの再構成が数値的に32に行われます。従って、明視野顕微鏡、ゼルニケ位相コントラストおよび微分干渉コントラスト顕微鏡法と比較して、DHMは、任意の後続の数値焦点補正（多焦点画像）27との定量的な位相差を提供します。定量位相イメージングは​​、光路長の変化の決意に基づいており、従って、使用測定器の高度に無関係です。これは、異なる機器で取得された測定データの比較が簡単になります。また、DHMはオブジェのための唯一の低光強度を必要としますCT照明。これは、未染色解剖組織の低侵襲性の分析を可能にし、生きた細胞の長期的タイムラプス観察の際に必要なサンプルの相互作用の量を最小限に抑えることができます。 IBDの治療装備一式が大幅に2最後の十年にわたって広がっています。 UC及びCDの両方に有効であり、許容可能な副作用プロフィールを有する抗TNF-α療法の導入に加えて、新規およびインテグリンを標的とする特異的な抗体は、最近臨床診療34-37に導入しました。他のいくつかの有望な薬剤は現在、IBD 38-40でそれらの治療有効性について評価されています。しかしながら、ヒトでの臨床使用の前に、これらの潜在的な治療法の有効性および安全性は、動物実験で証明されなければなりません。 DSS誘発大腸炎は、その高い再現性と低コストの23に、最も頻繁に使用されるマウス大腸炎モデルの一つです。さらに、このモデルは、缶アルそのように遺伝子改変マウスに適用される41菌株 。全身マーカーは、 例えば、CRPは、動物モデルにおいて非常に可変であるが、大腸の組織学的評価は、疾患の重症度42,43を評価するための最も有効なアプローチを示します。それにもかかわらず、スコアリングシステムに従って組織学的炎症の定量的な評価は、研究者の専門知識と経験に大きく依存しています。 DHMと可能な限り客観的なパラメータによる自動評価とスコアリングは、これらの制限を克服し、さらに19を染色するための必要性を回避すること、また、時間の節約です。また、DHMは、内視鏡検査の間に得られた外科結腸標本、ならびに粘膜サンプルを検査するために使用することができます。 上皮再生および創傷治癒は、消化管潰瘍や縫合不全を含むいくつかの病理学的プロセスの間に極めて重要なメカニズムです。 Vにおける上皮創傷治癒を評価するための有望なアプローチであるがIVO 44は 、これらの技術は、洗練された検査ツールを必要とし、現在広く使用できません。したがって、現在の上皮治癒は一般的に、インビトロ 9 にスクラッチアッセイによって調査されています。これらのアッセイは、創傷閉鎖の有効な検査を可能にするが、通常は最初繰り返さ評価10,45を防ぐ細胞染色を、必要とします。また、いかなる細胞改変データは、この実験と並行して取得することができません。アポトーシスおよび壊死46を区別するために、細胞の増殖及び遊走46を評価することができるので、この情報は非常に重要であってもよいです。したがって、セル厚を決定する可能性は、DHM検査によって同時に創傷閉鎖の監視に乾燥質量または組織密度は、粘膜研究に高い価値があります。 ヒトのIBD患者のための治療目標は、常に最後の数十年にわたって変更されています&lt;SUP&gt; 47。最初は炎症の制御が最も重要であると見なされていたが、後にステロイドフリー寛解となりました粘膜治癒は、治療48の主要な目標です。最近では、組織学的寛解があっても一人で49治癒粘膜より優れ得ることを仮定しました。人間IBDのために利用可能ないくつかの組織学的スコアリングシステムがありながらしかし、観察者間の変動性は高い50のまま。したがって、組織学的結腸試料の評価のための標準化されたアプローチが必要です。 DHMは、この目標に貢献するかもしれないし、さらに、ヒトIBD患者と前向き臨床試験で評価されるべきです。 提示された実験手順では、試料は、非常にコヒーレントなレーザ光を用いて照射し、画像化されます。したがって、DHMの解像度は主にサンプル照明の位置ずれによる光の散乱や回折効果によって制限され、厚いサンプル、ほこりやこのような光路内の凝縮水のような他の不純物。定量DHMの位相コントラスト画像から精度の高い測定データを得るために、DHMセットアップおよびサンプルを注意深く調製と整合プロトコルの中で最も重要なステップです。十分に洗浄光学撮像素子、特に顕微鏡コンデンサーと顕微鏡対物レンズは、ノイズを最小化するために必要とされます。また、サンプルキャリアスライド、ペトリ皿の蓋と底部、ならびに使用の細胞培養培地は、粒状不純物を含まないべきです。これは慎重に適用される液体のすべてのコンポーネントと十分なフィルタを洗浄することによって達成されます。 デジタルホログラムおよび/または解剖組織の定量的DHMの位相画像にノイズがある場合には、ガラスキャリアとカバースリップがほこりで汚染されることがあります。より詳細なトラブルシューティングのヒントは以下のとおりです。もしそうであれば、アルコール（ 例えば、純エタノール）でガラスキャリアとカバースリップを清掃してください。厚い場合解剖組織のネスは、より薄い組織切片を使用してみてください、光の散乱の大きすぎる（&gt; 10ミクロン）、したがって結果です。レーザー光で照明が均一に分布されていない場合には、顕微鏡コンデンサーを経由してオブジェクトの照明を揃えます。ガラス蓋の底部に凝縮水が散乱効果誘発する場合は、加熱室の温度と室内湿度をチェックしてください。場合において、細胞密度は、創傷治癒アッセイの準備中に細胞密度を減少させる、複数の層に高すぎる、または細胞増殖です。 DHMは、干渉の原理に基づいているように、最終的に、この方法は、個々の実験室環境に応じて変化する振動や他の機械的な外乱に敏感です。しかしながら、そのような影響は、通常、実験の準備中にホログラフィー記録用に適切に選択された露光時間（典型的には、ミリ秒の範囲の以下）によって最小化することができます。 要約すれ​​ば、我々の結果は、定量的にほぼ自動化された方法で組織学的炎症ex vivoでの評価する能力にDHMは、明視野と、このようなゼルニケ位相コントラストやDICなどの既存の位相コントラストイメージング顕微鏡技術を超える大きな利点を保持していることを示しています。さらに、DHMは、サンプルとの最小化の相互作用を用いたin vitroでの上皮創傷治癒のラベルフリー連続マルチモーダルな評価を可能にします。これは、IBDを有する患者にDHMの翻訳可能性を探るために &#39;&#39;デジタル病理学 &#39;&#39;とさらに拡張研究の面で自動化された組織学的検査への道を開きます。また、DHMは、インビトロ定量的に細胞遊走、形態および増殖を勉強する機会小説を提供しています。 臨床診療へのDHMの翻訳は、IBDの診断を改善する可能性があります。 DHMは、腸炎を介して異なる程度の定量化を可能にするように「デジタル病理」の意味での濃度変化、疾患の客観的かつより正確な評価のような物理的なパラメータが可能なようです。客観的な評価は、IBD患者の臨床管理に重要な影響を持つことができます。

炎症性腸疾患（IBD）、 すなわち、潰瘍性大腸炎（UC）およびクローン病（CD）は、消化管1の特発性炎症性障害です。 IBDの根底にある病態生理および潜在的な新薬や新たな診断手法の評価の研究は、特に重要です。基礎研究およびIBD患者の臨床管理の両方で、腸粘膜が注目2,3の焦点となっています。粘膜は、共生細菌、上皮細胞および腸の免疫系の種々の細胞成分間の相互作用は、腸のホメオスタシス4,5を編成れる解剖学的境界を表します。しかし、IBD患者に、制御されていないと持続性の腸の炎症は最終的にそれ自体が局所の炎症6を悪化させる上皮バリア機能の崩壊に終わることができます潰瘍や狭窄などの検出可能な損傷を、粘膜につながります。 <pクラスは、= &quot;jove_content&quot;&gt;上皮は、創傷治癒、炎症ので下記上皮再生のために重要であるだけでなく、消化管手術7後の消化管潰瘍や縫合不全の治癒のためのコア要件です。上皮は治癒がアッセイ治癒インビトロ創傷でシミュレートし、腸の炎症8,9のマウスモデルにすることができます巻か。両方のin vitroおよびin vivoでのアプローチは実験的評価の精度を制限する欠点を持っている。in vitroアッセイを、古典的なスクラッチアッセイのように、蛍光発色団と長引く染色手順またはトランスフェクションを必要とします。彼らは多くの場合、10を自動化することができない細胞増殖および遊走のそれらの不連続な監視によって制限されている。例えば、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発性大腸炎などのin vivoモデルを、頻繁に起因見られる大きな変化に一部、堅牢な読み取りアウトを欠いています実験室でのマーカーで、ミリアンペア不適切な王このようなマーカーは、大腸炎の重症度11,12を評価しました 。炎症を起こした粘膜の組織学的分析は、まだ現在大腸炎の重症度を決定するための最も有効な手法であるが、これは、in vitroでの上皮創傷治癒アッセイのように、染色を必要とし、研究者の専門知識13に依存しています。 最近、デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）、定量的位相顕微鏡14の変異体は、 インビトロおよびインビボ 15 における上皮の創傷治癒の評価のための有用なツールとして同定された。DHMは、（OPD）の光路長遅延を測定することにより、組織密度の評価を可能にします、その見通し新たな癌の診断16-18と炎症関連組織の変化19の定量化。また、DHMは、セルの厚さ、セル覆われた表面領域および細胞内（タンパク質）コンテンツ量を決定することにより、細胞形態動態のモニタリングを可能にします<sup&gt; 15,20。 in vitroアッセイでは、DHMはまた、細胞体積と厚さ21,22の変化を評価することによって、 例えば、携帯透水性、生理学的プロセスの分析を可能にします。また、DHM測定は、研究者に関連したサンプルバイアスを防止する自動化することができます。 ここでは、腸の炎症のマウスモデルにおけるDHMの使用を実証し、また、ラベルフリーのin vitroアッセイとして、創傷治癒の定量的モニタリングのためのヒト組織試料の分析にDHMを適用します。まず、我々は、IBDを有するヒトから大腸炎マウスおよび組織切片における異なる結腸壁層の炎症性変化を評価します。 DHM定量位相画像化手順を説明した後、我々は、詳細な顕微鏡部品を使用するための指示、組織切片を調製し、また、取得した定量的な位相画像の評価を記述を提供します。 次に、我々は、DHMはUTIできることを示していますin vitroでの上皮創傷治癒の連続マルチモーダル監視のためlized、および細胞層の厚さ、乾燥質量と細胞容積のような細胞の特性の分析を記述し、薬物誘導し、生理的な細胞の変化への洞察を与えます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azoxymethane (AOM)</td>
			<td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td>
			<td>A5486</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flask</td>
			<td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>658170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Stripette</td>
			<td>Corning Inc., New York, USA</td>
			<td>4488</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulphate sodium (DSS)</td>
			<td>TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden</td>
			<td>DB001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#180;s F12</td>
			<td>PAA Laboratories - Pasching - Austria</td>
			<td>E15-813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td>
			<td>SPR3196</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td>
			<td>E 9884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube 50ml</td>
			<td>BD Biosciences, Erembodegem, Belgium</td>
			<td>352070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane (2- Methylbutane)</td>
			<td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td>
			<td>M32631-1L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1159430025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td>
			<td>M4287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>G. Menzel, Braunschweig, Germany</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Tissue Tek compound&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Sakura, Zoeterwonde, Netherlands</td>
			<td>4583</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep/Amphotericin B</td>
			<td>Lonza, Verviers, Belgium</td>
			<td>1558</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Lonza, Verviers, Belgium</td>
			<td>4629</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza, Verviers, Belgium</td>
			<td>3626</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride 0,9%</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>5/12211095/0411</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard diet</td>
			<td>Altromin, Lage, Germany</td>
			<td>1320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>Sakura, Leiden, Netherlands</td>
			<td>4566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Lonza, Verviers, Belgium</td>
			<td>7815</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitro &#8211; Clud&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>R. Langenbrinck, Teningen, Germany</td>
			<td>04-0002&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#181;-Dish 35 mm with Culture-Insert, high</td>
			<td>ibidi GmbH, Munich, Germany</td>
			<td>81176</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC Lid for &#181;-Dishes, with a glass insert</td>
			<td>ibidi GmbH, Munich, Germany</td>
			<td>80050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROM HM550</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA</td>
			<td>46320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital holographic microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Component</td>
			<td>Model</td>
			<td>Company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>iMIC</td>
			<td>Till Photonics, Graefelfing, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Compass 315M</td>
			<td>Coherent GmbH, Luebeck, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope lens</td>
			<td>Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3</td>
			<td>Zeiss, Goettingen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>DMK 41BF02</td>
			<td>The Imaging Source, Bremen, Germany</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal quantitative phase imaging with digital holographic microscopy accurately assesses intestinal inflammation and epithelial wound healing

炎症性腸疾患の発生率、 すなわち、クローン病および潰瘍性大腸炎は、大幅に過去10年間で増加しています。 IBDの病因は不明のままであり、現在の治療戦略は、免疫系の非特異的抑制に基づいています。具体的に有意にIBDの管理を改善することができ、腸の炎症および上皮創傷治癒を標的とする治療法の開発は、しかし、これは、炎症性の変化を正確に検出する必要があります。現在、潜在的な薬物候補は、通常、 インビボまたはインビトロでの細胞培養に基づく技術を用いて、動物モデルを用いて評価されます。組織学的検査は、通常、サンプルの特性を変えることができ、さらに、調査結果の解釈は研究者の専門知識によって変えることができ、目的の細胞または組織染色することが必要です。デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）は、光路長遅延の検出に基づいて、可能汚れのない定量的位相コントラストイメージング。この結果は、直接絶対生物物理学的パラメータと相関させることを可能にします。私たちは、屈折率測定に基づいて、DHMと組織密度の変化の測定は、大腸炎マウスとヒトの結腸組織標本の異なる層に、染色することなく、炎症性の変化を定量化する方法を示しています。さらに、当社は、創傷領域の簡単な自動化された決意と、そのような移行細胞の乾燥質量と層の厚さなどの形態学的パラメータの同時決意を通じてDHMを使用して可能in vitroでの上皮創傷治癒、の連続マルチモーダルラベルフリーの監視を実証します。結論として、DHMは貴重な、新規かつ定量的なツールの可能なパラメータの絶対値を持つ腸の炎症を評価するための、in vitroでの上皮創傷治癒の簡素化定量化を表し、したがって、翻訳診断uのための高い可能性を秘めていますSE。

デジタルホログラフィック顕微鏡用DHMイメージングのための典型的なセットアップ（DHM） 図 1Bに示すように、明視野イメージングおよび定量DHM位相コントラスト撮影を行うために、我々は、倒立顕微鏡を適用しました。 25前述したように、システムは、DHMモジュールを取り付けることによって修正されました。マッハツェンダー構成（ 図 1 A）におけるYAGレーザλ= 532nm）をディジタルホログラムを照明することにより、周波数倍増Ndを光で試料を作製しました。解剖組織をガラスキャリアスライド上にエクスビボで分析しました。 図 1 のCに示すように、生細胞培養物を観察し、創傷治癒のための特別なペトリ皿で観察されました。サンプルは10倍マイルを経由して透過照明で画像化しました。croscopeレンズ（NA = 0.3）とチューブレンズ。電荷結合素子カメラは、わずかに傾いた参照波とサンプル画像（物体波）を重畳して生成された干渉パターン（デジタル軸外ホログラム）を記録するために使用しました。デジタルで撮影したホログラムは、オプションのホログラフィックオートフォーカス26,33と組み合わせて再構成をシフトする空間位相によって再構築しました。 DHMによるマウスDSS誘発大腸炎の評価 急性大腸炎は、5日間の飲料水中のデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）w / vの3％の投与によりマウスにおいて誘発しました。大腸炎の症状および経過は対照群と比較して、DSS処置群における進行性の体重減少をモニターすることによって追跡しました。 （ 図 2 のAは 19から適応しました）。内視鏡的に、重度の大腸菌への中等度結腸壁の肥厚、血管パターン（ 例えば、自然出血、 赤矢印 ）、フィブリン滲出（ 白矢印 ）および粘膜表面（ 図2B）の粒度の変化によって反映されるようにTISが観察されました。ヘマトキシリンおよびエオシンの従来の組織学的評価（HE）は、結腸のセクションでは、主に粘膜下層（ 図 2 C 灰色の矢印 ）に配置された制御動物、詩DSS処置の結腸壁に著しい浮腫を明らかにした染色しました。式1によって取得定量DHM位相コントラスト画像と関連する屈折率マップの対応、また、上記組織の変化を描きました。また、256階調にコード化された屈折率は、天然の、未染色組織サンプル中の上皮（ 白矢印 ）および間質（ 黒矢印 ）（ 図 2を含む組織層の濃度の違いを示しました</st栄&gt; C）。屈折率が大幅に上皮内だけでなく、健康な対照（ 図 2 E）に比べて大腸炎マウスの粘膜下組織と間質に減少しました。さらに、臨床パラメータ（体重の相対損失）と絶対物理的パラメータ（屈折率）との間に有意な相関が観察できた（R 2リニア= 0.64; 19から適応図 2 D）。 DHMによってヒトにおけるクローン病の評価 クローン病は、多くの場合、消化管内視鏡検査によって検出された腸管壁の著しい炎症性の変化によって識別されます。特性巨視的な特徴は、粘膜表面の粒度のフィブリンexudatと長手方向に潰瘍を含み、イオンおよび自発的出血（ 図 3A）（また、「カタツムリ証跡」と呼びます）。アクティブなCDを有する患者由来の組織試料のHE染色による組織学的評価は、多くの場合、結腸壁だけでなく、粘膜下浮腫を明らかにしました。対応する定量的DHMの位相コントラスト画像と数式1で取得した関連屈折率マップもここ上皮（ 図 3 B）に見られる、結腸壁の炎症媒介強化/むくみを検出しました。また、絶対的なパラメータとして、屈折率が、また大幅にすべての壁層（上皮、粘膜下層および間質）に減少したアクティブなCDを有する患者由来の結腸組織試料における寛解（ 図 3 C）におけるそれらの詩。 -インビトロ 創傷治癒のマルチモーダルモニタリング </eメートル&gt; Caco-2細胞は、アッセイは標準化された条件を提供するために、特別なペトリ皿を使用して実施した創傷治癒します。皿を500ミクロン（ 図 4 A）のギャップによって分離された2つの異なるチャンバを形成するカルチャーインサートが装備されています。異なる生理学的環境をシミュレートするために、細胞は、上皮成長因子（EGF）によって刺激またはマイトマイシンCで阻害、処置なしのいずれかを調べました。 DHMのセットアップは、実験開始（ 図 4 B）の後に0、22.5および45時間後（256階調にコード化された）代表的な定量的DHM位相コントラスト画像によってここに示されている時間をかけて、創傷治癒プロセスの継続的な監視を可能にします。 図 5 の対応する偽色コード化された擬似3Dプロットは、三ディにおける細胞層の厚さの空間的な発展を示してmensions。光路長の遅れ、細胞の屈折率と、式2および図3に基づいて、DHMは、細胞覆われた表面積、平均セル厚さおよび細胞乾燥質量（のような細胞の特性の経時的なモニタリングによって遊走、増殖及び形態の同時動的な評価を可能にします図 4 のC）。要約すると、 図 4のデータは、増大した平均セル厚さと対照細胞と比較して、視野内のより高い乾燥質量で、創傷領域への細胞のより速い移動にそのEGFシミュレーション結果を示します。阻害細胞がカバーcは対照的に、マイトマイシンは少し実験中、対照細胞よりも表面積が減少し、また、わずかに低い乾燥質量の増加を示します。しかし、平均セル厚さは明らかに両方、刺激および対照細胞と比較して減少したが表示されます。 図1。 デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）。DHMワークステーション（A）の概略セットアップのためのオフ軸セットアップ活用 。顕微鏡の設定（モニタ、ライブ画像と制御ソフトウェア（1）を示す写真を対応するオフアクシスセットアップデジタルマイクロスコープ（2）、（B）、顕微鏡（ 緑色の点線 ）とサンプルの光路は、 赤色で示され（ 矢印 ;（C））。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54460/54460fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54460/54460fig2.jpg" /> 図 2。 DHMによるマウスDSS誘発大腸炎の評価。大腸炎のコースは毎日私が続きました相対的な体重と繰り返し、内視鏡のフォローアップ検査のasurement。 （19から適応）DSS投与（A）の開始後4日目からの相対的な体重の大規模な損失が焦点潰瘍および粘膜の脆弱性（B）を含む、確立された大腸炎の内視鏡的兆候を伴っていました。従来のHE染色cryostaticセクションの分析は、粘膜下浮腫、筋層の肥厚や粘膜の顕著な粘膜の炎症性浸潤を明らかにしました。式1で取得した定量的DHM位相コントラスト画像と関連する屈折率マップを対応する（256階調にコード化された）炎症過程の間に粘膜下組織の浮腫性変化を確認した（C）（白矢印は上皮、灰色の粘膜下層と黒の間質を示しています）。有意屈折率（絶対的な物理的なパラメータ、R 2リニア= 0.6と相関体重（臨床的パラメーター）の相対的な喪失4;大幅上皮ならびに粘膜下組織と健常対照と比較して、大腸炎マウスの間質に減少した19から適応（D）は 、）、（平均±SEM、*** P &lt;0.001; E） <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54460/54460fig2large.jpg" target="_blank">をクリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54460/54460fig3.jpg" /> DHMによってヒトにおけるクローン病の 図 3. 評価。内視鏡および組織学的に確認されたクローン病の患者からの結腸組織サンプルを検査した（A）。 HE染色は、粘膜陰窩の延長および炎症性細胞の著しい浸潤を示しました。また、粘膜下浮腫および固有筋層の拡大が検出されました。 CORRの分析式で検索された定量的なDHM位相コントラスト画像と関連する屈折率マップをesponding（1）（256階調に符号化された）は、上皮（B）中の（ここでは白と黒の星で示す）浮腫の変化を明らかにしました。平均屈折率の有意差は、アクティブフレア（ クリア棒 ）または寛解（ 黒棒 ）とCD患者からのサンプルで検出されました。 。;これらの違いは、各組織タイプ（C平均±SEM、*** P &lt;0.001）に見られる<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54460/54460fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54460/54460fig4.jpg" /> ホワイトライト顕微鏡とDHMによって上皮創傷治癒の 図 4. 監視。培養細胞はトランました特殊なインサート（ 赤い矢印 ）でペトリ皿にsferred。培養インサートが除去される前に、細胞を24時間、EGFまたはマイトマイシンCのいずれかで処置された、または培地単独（無刺激対照）（A）で処理しました。培養インサートを除去した後、創傷治癒を連続的に経時DHMによる位相コントラストイメージングによってモニターしました。セルの輪郭を明確に認識することができました。代表的な定量DHM位相コントラスト画像は、22.5時間後および45時間（B）後に測定の終了時に、実験の開始時に示されています。パネル（C）は 、細胞で覆われた表面の対応する時間的変化（S c）が 、平均セル厚（D 細胞 ）および細胞乾燥質量（DM）を示している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54460/54460fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図 5。 定量的DHM位相コントラスト画像の 偽色コード化された擬似 3 次元プロット による細胞層形態変更のイラスト 。t = 0で、図4（b）の定量的DHM位相コントラスト画像の代表的な偽色分けされた擬似3Dプロット、22.5時間後と45時間後の測定の終了時に、制御-のための細胞層の厚さの空間的な発展を示して、マイトマイシンは、c-阻害し、3DでのEGF刺激された細胞。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54460/54460fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

デジタルホログラフィック顕微鏡とマルチモーダル定量位相イメージングは​​、正確に腸の炎症および上皮創傷治癒を評価します

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

multimodal-quantitative-phase-imaging-with-digital-holographic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

8.3K ビュー.  University Hospital Münster. Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro. 

ビデオ: Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the complex cellular and molecular of intestinal pathology. Although the tunica mucosa is often the organ of interest in many inflammatory diseases, recent works demonstrated that the muscularis externa (ME) is also a highly immunocompetent organ that harbours a dense network of resident immunocytes.1,2 These works were performed within the standardized model of intestinal manipulation (IM) that leads to inflammation of the bowel wall, mainly limited to the ME. Clinically this inflammation leads to prolonged intestinal dysmotility, known as postoperative ileus (POI) which is a frequent and unavoidable complication after abdominal surgery.3 The inflammation is characterized by liberation of proinflammatory mediators such as IL-64 or IL-1&beta; or inhibitory neurotransmitters like nitric oxide (NO).5 Subsequently, tremendous numbers of immunocytes extravasate into the ME, dominated by polymorphonuclear neutrophils (PMN) and monocytes and finally maintain POI.2 Lasting for days, this intestinal paralysis leads to an increased risk of aspiration, bacterial translocation and infectious complications up to sepsis and multi organ failure and causes a high economic burden.6
In this manuscript we demonstrate the standardized model of IM and in vivo assessment of gastrointestinal transit (GIT) and colonic transit. Furthermore we demonstrate a method for separation of the ME from the tunica mucosa followed by immunological analysis, which is crucial to distinguish between the inflammatory responses in these both highly immunoactive bowel wall compartments. All analyses are easily transferable to any other research models, affecting gastrointestinal function.

Postoperative ileus (POI) is a complication of abdominal surgery leading to increased morbidity and a prolonged hospital stay. Because prophylactic or therapeutic strategies are lacking intensified research is necessary. Therefore we established a standardized and feasible mouse model to investigate the pathophysiology of POI and to study potential therapeutic options.

げっ歯類における腸運動と腸壁の炎症の機能評価：腸管操作の標準化されたモデルで分析

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

医学

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

創傷治癒のマウスモデル

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

マウス内視鏡検査のため<em&gt;インビボ</em&gt;発がんと腸の評価のマルチモーダルイメージング創傷治癒および炎症

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

A Multimodal Imaging- and Stimulation-based Method of Evaluating Connectivity-related Brain Excitability in Patients with Epilepsy

Resting-state functional connectivity MRI (rs-fcMRI) is a technique that identifies connectivity between different brain regions based on correlations over time in the blood-oxygenation level dependent signal. rs-fcMRI has been applied extensively to identify abnormalities in brain connectivity in different neurologic and psychiatric diseases. However, the relationship among rs-fcMRI connectivity abnormalities, brain electrophysiology and disease state is unknown, in part because the causal significance of alterations in functional connectivity in disease pathophysiology has not been established. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a technique that uses electromagnetic induction to noninvasively produce focal changes in cortical activity. When combined with electroencephalography (EEG), TMS can be used to assess the brain's response to external perturbations. Here we provide a protocol for combining rs-fcMRI, TMS and EEG to assess the physiologic significance of alterations in functional connectivity in patients with neuropsychiatric disease. We provide representative results from a previously published study in which rs-fcMRI was used to identify regions with abnormal connectivity in patients with epilepsy due to a malformation of cortical development, periventricular nodular heterotopia (PNH). Stimulation in patients with epilepsy resulted in abnormal TMS-evoked EEG activity relative to stimulation of the same sites in matched healthy control patients, with an abnormal increase in the late component of the TMS-evoked potential, consistent with cortical hyperexcitability. This abnormality was specific to regions with abnormal resting-state functional connectivity. Electrical source analysis in a subject with previously recorded seizures demonstrated that the origin of the abnormal TMS-evoked activity co-localized with the seizure-onset zone, suggesting the presence of an epileptogenic circuit. These results demonstrate how rs-fcMRI, TMS and EEG can be utilized together to identify and understand the physiological significance of abnormal brain connectivity in human diseases.

Resting-state functional-connectivity MRI has identified abnormalities in patients with a wide range of neuropsychiatric disorders, including epilepsy due to malformations of cortical development. Transcranial Magnetic Stimulation in combination with EEG can demonstrate that patients with epilepsy have cortical hyperexcitability in regions with abnormal connectivity.

マルチモーダルImaging-とてんかんの患者で接続関連の脳の興奮性を評価するの刺激に基づく方法

Resting-state functional connectivity MRI (rs-fcMRI) is a technique that identifies connectivity between different brain regions based on correlations ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not routinely employed in animal models. Conventional experimental readouts often rely on post mortem and ex vivo analyses, which prevent intra-individual follow-up examinations and increase the number of study animals needed. Fluorescence-mediated tomography enables the non-invasive, repetitive, quantitative, three-dimensional assessment of fluorescent probes. It is highly sensitive and permits the use of molecular makers, which allows for the specific detection and characterization of distinct molecular targets. In particular, targeted probes represent an innovative tool for analyzing gene activation and protein expression in inflammation, autoimmune disease, infection, vascular disease, cell migration, tumorigenesis, etc. In this article, we provide step-by-step instructions on this sophisticated imaging technology for the in vivo detection and characterization of inflammation (i.e., F4/80-positive macrophage infiltration) in a widely used murine model of intestinal inflammation. This technique might also be used in other research areas, such as immune cell or stem cell tracking.

Target-specific probes represent an innovative tool for analyzing molecular mechanisms, such as protein expression in various types of disease (e.g., inflammation, infection, and tumorigenesis). In this study, we describe a quantitative three-dimensional tomographic assessment of intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using F4/80-specific fluorescence-mediated tomography.

検出とマクロファージによるマウス腸管炎症の定量化のための蛍光を介したトモグラフィー

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

顕微鏡法によるIn Vitro創傷が治癒過程における上皮移行の評価

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Phase Contrast Magnetic Resonance Imaging in the Rat Common Carotid Artery

Phase contrast magnetic resonance imaging (PC-MRI) is a noninvasive approach that can quantify flow-related parameters such as blood flow. Previous studies have shown that abnormal blood flow may be associated with systemic vascular risk. Thus, PC-MRI can facilitate the translation of data obtained from animal models of cardiovascular diseases to pertinent clinical investigations. In this report, we describe the procedure for measuring blood flow in the common carotid artery (CCA) of rats using cine-gated PC-MRI and discuss relevant analysis methods. This procedure can be performed in a live, anesthetized animal and does not require euthanasia after the procedure. The proposed scanning parameters yield repeatable measurements for blood flow, indicating excellent reproducibility of the results. The PC-MRI procedure described in this article can be used for pharmacological testing, pathophysiological assessment, and cerebral hemodynamics evaluation.

The overall goal of this procedure is to measure the blood flow in the rat common carotid artery by using noninvasive phase contrast magnetic resonance imaging.

ラットの総頸動脈で位相コントラスト磁気共鳴イメージング

Phase contrast magnetic resonance imaging (PC-MRI) is a noninvasive approach that can quantify flow-related parameters such as blood flow. Previous ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to injury. In fact, the most common type of eye injury found in clinic is a corneal abrasion. Here, we utilize an ocular burr to induce an abrasion resulting in removal of the corneal epithelium in vivo on anesthetized mice. This method allows for targeted and reproducible epithelial disruption, leaving other areas intact. In addition, we describe the visualization of the abraded epithelium with fluorescein staining and provide concrete advice on how to visualize the abraded cornea. Then, we follow the timeline of wound healing 0, 18, and 72 h after abrasion, until the wound is re-epithelialized. The epithelial abrasion model of corneal injury is ideal for studies on epithelial cell proliferation, migration and re-epithelialization of the corneal layers. However, this method is not optimal to study stromal activation during wound healing, because the ocular burr does not penetrate to the stromal cell layers. This method is also suitable for clinical applications, for example, pre-clinical test of drug effectiveness.

This protocol describes a method to inflict an abrasion to the ocular surface of the mouse, and to follow the wound healing process thereafter. The protocol takes advantage of an ocular burr to partially remove the surface epithelium of the eye in anaesthetized mice.

角膜上皮摩耗眼はりのモデルとして角膜創傷治癒

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.

デジタルホログラフィック顕微鏡とマルチモーダル定量位相イメージングは​​、正確に腸の炎症および上皮創傷治癒を評価します

デジタルホログラフィック顕微鏡とマルチモーダル定量位相イメージングは、正確に腸の炎症および上皮創傷治癒を評価します