この研究は、NIDCR / NIHからR01DE023348（RHK）とカリフォルニア大学ロサンゼルス部門の学術上院の研究評議会から教員研究助成（RHK）によってサポートされていました。

マウスは、ジャクソン研究所から購入し、実験動物医学のUCLA課（DLAM）における病原体のない動物施設で飼育しました。実験は、学長の動物研究委員会（ARCの＃2016から037）から承認された機関のガイドラインに従って行いました。 1.マウスの麻酔<ol><li> 8週齢の雌C57 / BL6マウスを使用した（n = 3）。 </li><li>ケタミン（マウス体重の80から120ミリグラム/キログラム）/キシラジン（5 mgの/マウスの体重のkg）の溶液を用いてマウスを麻酔し、10 mLの/ kgの用量で腹腔内（ip）に投与します。 </li><li>ケタミンを準備します（80から120ミリグラム/キログラム）/キシラジン（5mg / kg）ソリューションおよび10 mLの/ kgの用量で腹腔内（ip）に、それらを管理します。 </li><li>マウスが完全につま先のピンチを実行することにより麻酔していることを確認します。 </li></ol> 2.パルプキャッピング手順<ol><li>マウスの口に口ホルダーを配置します。 </li><li>彼そのようなテーブルの上に口ホルダーを固定します広告が上向きにされています。 </li><li>最初の上顎臼歯が完全に表示されるように、口の上に顕微鏡（10倍）を配置します。 </li><li>パルプは透明象牙質を介して表示されるまで20万rpmで高速ハンドピースで1/4ラウンドバーを使用して、途中で歯のエナメル質の部分を削除します。バリでパルプを公開しないでください。 </li><li> ＃15歯内K-ファイル（150μmの直径）を使用して、象牙質を通して穿孔し、パルプを公開します。 注：象牙質の破片は、パルプ中に押し込まれないように特別な注意が必要です。これは、四半期ごとのK-ファイルを回転した後、K-ファイルアウトを引っ張ることによって回避することができます。 </li><li>製造元の指示に従って滅菌H 2 OでMTAを混ぜます。エクスプローラの先端で露出してパルプにMTAを提供し、配置します。穏やかなタッピングによって公開されたパルプにMTAをパックするために、紙ポイント（ファイン）の裏面を使用してください。紙点の厚い側は平坦であるため、でき露出されたパルプへのMTAの適切な凝縮のため。 </li><li>それだけで歯をカバーして35％リン酸エッチング液を配置することにより、15秒のための歯をエッチングします。それは歯肉組織を刺激することができるように、エッチング液の配置を制限するために特別な注意を払ってください。 注：エッチング液をシリンジに来て、歯科用接着剤は、歯の上にマイクロメカニカル結合を媒介することで流れることができるように、歯の表面を粗面化するために使用されます。それらは粘性であるため、それが歯に直接少量を適用することによって、自己完結型であることができます。 </li><li>エッチング液を除去するために、負の圧力をかけ吸引を使用してください。軽くエッチング剤の残留物を除去するために、H 2 Oで浸漬された綿ペレットを使用してください。エッチング液が歯から完全に除去されるまで、この手順を繰り返します。 </li><li>圧縮エアダスターを使用し、軽く歯を乾燥させます。 </li><li>紙ポイントの裏面を使用した歯科用接着剤を適用します。 </li><li> 3秒間の圧縮空気を使用して接着剤層を薄く。 </li><li> C言語URE硬化光ユニットを用いて20秒間の歯科用接着剤。 </li><li> MTAでキャップされた歯の上に少量で流動可能な複合材料を配置します。歯の溝に複合体を流れるようにエクスプローラの先端を使用してください。 </li><li>それを重合する光硬化ユニットを用いて30秒間複合体を硬化します。コンポジットが完全に硬化し、ハードエクスプローラを使用していることを確認してください。 </li></ol> 3.術後のケア<ol><li>すぐに覆髄手順の後にカルプロフェン（5 mgの/ kg）を皮下（SC）を管理します。 </li><li>彼らが目を覚ます前に暖かい動物を保つために低電力で加熱パッド上にマウスを置きます。 </li><li>住宅用ビバリウムにマウスを返します。 </li></ol> 4.組織調達<ol><li> 5の後 - 6週間、イソフルランとの完全な麻酔状態の下で頸椎脱臼によりマウスを安楽死させます。 </li><li>慎重に頭蓋底から上顎を除去し、50 mLチューブに入れて。 entirを修正しました。4℃で一晩、パルプでキャップされた歯とPBS、pH7.4中の4％パラホルムアルデヒドでキャップされていない反対側の歯の両方が含まれ、その後70％エタノール溶液に保存し、電子の上顎。 注：パラホルムアルデヒドは有毒で発癌性です。標準作業手順（SOP）に概説されるように適切な使用のパラホルムアルデヒドを監視する必要があります。 </li><li> μCTスキャンを用いてマウスの上顎をスキャンします。 70％エタノールを浸したガーゼでサンプルをラップし、15 mLの細胞培養チューブの中に置いて、スキャン中に上顎を固定します。 </li></ol> 5.μCTスキャン<ol><li> μCTスキャンのためのサンプルを準備します。簡潔には、70％エタノールに浸したガーゼで試料をラップし、一般的な15-mLの細胞培養コニカルチューブに固定します。メーカーの説明書で概説されるように、μCT走査ステージ上にチューブをマウントします。 </li><li> 145μAの電流55のkVpの電圧、及び2の露光時にX線源を設定します00ミリ秒。 </li><li> 20μmの解像度でと0.5ミリメートルのAlフィルタとμCTスキャナーで画像取得を実行します。 </li><li>画像を再構成し、それ11を視覚化します 。 </li><li> μCTスキャンが完了すると、2週間、5％EDTA、PBS中4％スクロース（pH7.4）で脱灰し始めます。 </li></ol> 6.組織処理と染色<ol><li>パラフィンで脱灰組織を埋め込みます。埋め込む前に、すぐに第一大臼歯の前方矢状カットを行うことで、上顎をトリミング。埋め込む一方で、第一大臼歯の縦断面が切断面となるように、下向きのこの面を配置します。 </li><li>ミクロトームを用いて、厚さ5μmのスライドを準備します。パルプキャップ領域は、通常、ランドマークとして使用することができるdistopalatal（DP）ルートと一致します。光学顕微鏡下で組織学を調べ、μCT画像を比較することにより、関心の正確な面積を決定します。 </li><li> H＆E染色、deparaのためffinize、キシレン（2回）と連続的に希釈したエタノール（100％エタノール2回、95％エタノール2倍、および70％エタノール1×）でスライドを再水和。 </li><li>水道水でスライドを洗浄します。 </li><li> 2.5分間ヘマトキシリン溶液で染色し、水道水ですすいでください。 </li><li> 1分間、95％エタノールでスライドを浸します。 </li><li> 1分間エオシン溶液で染色し、水道水ですすいでください。 </li><li>連続希釈したエタノール（70％エタノール1倍、95％エタノール2倍、および100％エタノール3×）、キシレン（3×）で脱水。 </li><li>マウントソリューションでスライドをマウントします。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

現在、歯髄幹細胞（DPSCs）13の歯原性分化に歯科材料、足場、または成長因子のin vivoでの効果を検証するために利用可能ないくつかの異なる実験モデルがあります。これらのモデルは、腎カプセル、または足場14,15と免疫不全マウスにDPSCsの皮下移植などの臓器へのDPSCsの異所性自家移植が含まれます。しかしながら、これらの方法はDPSCsに対するそれらの歯原性効果は同所パルプ環境で行われていないという点で制限されています。一方、歯の上パルプ、パルプ・キャッピング手順に同所移植は大型動物16,17で使用されています。これらのモデルは同所環境で歯原性の可能性を評価する上で貴重であるが、それらのモデルの使用は、パルプ創傷治癒と修復象牙質形成に限定されたメカニズムの洞察を提供し、自然の中で主に観察されます。 </P&gt; 本稿では、マウスでは、パルプ・キャッピングを実行するための詳細な方法を提示します。このステップバイステップの手順では、μCTスキャンで分析し、修復象牙質形成のための組織サンプルを評価し、上顎を収穫、マウスを麻酔クラスI様キャビティを準備し、覆髄材を配置することを含みます。私たちの覆髄マウスモデルは、研究コミュニティで広く入手可能であるトランスジェニックやノックアウトマウスの使用を可能にすることによって、修復象牙質の文脈におけるin vivoでの歯髄創傷治癒の基本的な分子機構を調査するのに役立つであろう。 最近の研究では、象牙質形成が18,19に観察されたいくつかのマウスモデルを示しました。斉藤ら。反動はなく、修復、象牙質形成を刺激するパルプの露出のないクラスI様準備を、作成しました。反動象牙質と修復象牙質の両方が三次象牙質に分類されています、歯に以下の外部刺激を形成します。しかし、既存の象牙芽細胞によって形成される反動象牙質とは異なり、修復象牙質は、歯髄が露出し、象牙芽細胞層を20に違反しているとなりDPSCsとして象牙芽細胞様細胞によって形成されます。したがって、診療所における実際の覆髄手順を表すものではありません。別の研究では、ガラスアイオノマーは、パルプ露光19をキャップするために使用されました。しかしながら、臨床試験は、ガラスアイオノマーは慢性炎症ではなく、修復象牙質21に誘発されたことを示しました。この点で、我々のパルプキャッピングマウスモデルは、より良い患者の実際のパルプキャッピングの手順を表します。 我々が6週間以上後のマウスを収穫するとき、修復象牙質形成は髄室と根管（ 図4）全体で発生したことは注目に値します。このような観察は、我々は6月で修復象牙質形成を予想通り、かなり予想外であります覆髄材とパルプの間ction。しかし、パルプの強力な石灰化は、特に比較的若い患者22に、臨床で観察されます。本研究で用いた8週齢のマウスを、「青年」23であると考えられるので、これらのマウスは、まだかなりの歯原性の可能性を保有することにより、可能性が存在します。したがって、マウスでの修復象牙質形成の経年変化を調べるために価値があるだろう。 私たちの組織学的検査は、修復象牙質が明らかにパルプをかぶった歯に形成されたが、修復中の象牙細管（赤矢印）および骨細胞（黒矢印）の存在によって証明されるように、両方の象牙質および骨形成の特性は、あった、ことを明らかにしました象牙質（ 図5）。このような観察は、修復象牙質形成が局所的に象牙芽細胞様の歯髄幹細胞、ならびにinfiltratinが存在することによって誘導され得ることを示唆しています周囲の骨からグラム間葉系幹細胞。 酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAP）染色によって決定されるように象牙質形成細胞と比較して、我々は、パルプ内には象牙質再吸収細胞は認められなかった（データは示さず）。確かに、歯髄や根尖炎症は、歯の周りの骨表面上ではなく、として、まだ未知のメカニズム24による象牙質表面に破骨細胞形成を誘導します。注目すべきは、既存の象牙質および新たに形成された修復象牙質（ 図4）との間に明確な境界がありました。以前の研究では、同様の現象を実証しました。歯が破骨細胞の機能を阻害どちらも、ビスホスホネートまたは抗RANKL抗体の存在下で抽出された場合、既存の層板骨と新たに形成された網状骨25との間に明確な境界設定がありました。この概念は、さらにパルプ中の象牙質吸収細胞の不在をサポートしています。総称して、私たちの確立マウスモデルは、pだろうパルプ創傷治癒およびin vivoでの修復象牙質形成のメカニズムを検討するためのユニークな機会をrovide。 歯髄キャッピングマウスモデルには限界があります。ヒトとマウスの間の遺伝的メイクは明らかに異なっています。完全なゲノムは、ヒトおよびマウスにおいて配列決定されており、マウスとヒト26,27間のタンパク質コード領域で約85％の類似性が存在します。この考え方に沿って、それは動物でキャッピングパルプに関連する所見が必ずしも人間28のものを反映していないことが示唆されました。それにもかかわらず、動物モデルは広く、関節リウマチ29、全身性ショック31のための骨粗しょう症30、リポポリサッカライド（LPS）投与のためのovariactomy誘発性骨量減少、結紮のためのコラーゲン誘導関節炎などの生体内でのヒト疾患を再現するための研究コミュニティで使用されています歯周32の配置。このように、畝を覆髄SEモデルは、in vivoでのパルプ創傷治癒と修復象牙質形成の分子メカニズムを調べるために不可欠となります。それにもかかわらず、ちょうど他の動物モデルと同様に、覆髄マウスモデルからの所見の解釈および検証は慎重に評価する必要があります。 要約すると、現在の研究では、マウスにおいて、キャッピング成功したパルプを示しています。で基礎となるメカニズムを解明するために広く利用可能な遺伝子操作されたマウス系統を利用する1）機会を：それは提供するため、他の既知のモデルとは異なり、この覆髄マウスモデルは、パルプ再生の分野で非常に貴重な研究ツールと修復象牙質形成を提供します分子レベル2）経済的に効率的な方法は、サンプルサイズを増加させることによって、統計的に有意な結果を得ることができます。さらなる研究は、in vivoでの修復象牙質形成の客観的定量化を含め、修復象牙質形成の年齢依存的効果、evaluaを待ちます臨床的に利用可能な覆髄材の化、および適切な歯髄創傷治癒および修復象牙質の再生のために必要とされる分子決定の検証。

Dental caries are one of the most prevalent oral diseases and the leading cause of surgical interventions to dentitions in almost all individuals1,2. The prognosis of surgical interventions and restorations of a tooth largely depends upon proper pulpal response and successful wound healing. Indeed, dental caries that penetrate deeply through the enamel and dentin frequently lead to the exposure of the underlying pulp tissue that is often "capped" with dental materials, such as calcium hydroxide (Ca(OH)2) or hydraulic calcium-silicate cements (HCSCs), including mineral trioxide aggregates (MTA). The ultimate goal of such a pulp-capping procedure is to expedite pulpal wound healing by regenerating reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" to protect the underlying pulp tissue and to increase the life expectancy of the tooth and the overall oral health. However, the underlying mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is not fully understood.
To better understand the mechanisms of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo, several animals were previously used, including monkeys, dogs, and pigs3-5. Among them, rats are frequently used because they are relatively smaller in sizes compared to the other animals, but their teeth are large enough to perform direct pulp capping without any technical difficulties6-10. These animal models are ideal alternatives to human studies for examining pulpal responses and reparative dentin formation. However, their utilization is limited to observational studies at the cellular level, and they scarcely provide mechanistic insights during reparative dentin formation at the molecular level.
Recent technical advances in genetic engineering provided invaluable and indispensable research tools-mice that harbor a gene that is either overexpressed or deleted-that are instrumental to studying molecular mechanisms of human diseases in vivo. The numbers of different strains of transgenic or knockout mice that are strategically inducible in a cell-specific manner are continually growing in the scientific community. Therefore, examining pulpal wound healing and reparative dentin regeneration in these mice would greatly help to expedite our understanding of these processes at the molecular level. However, the use of mice is significantly dampened, as performing a pulp-capping procedure on a mouse tooth is technically challenging due to its miniature size. Here, we present our reproducible method of performing direct pulp capping in mice for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo.

<table><tbody><tr><td>BM-LED stereo microscope</td><td>MEIJI Techno</td><td></td><td>Microscope&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Optima MCX-LED&amp;nbsp;</td><td>Bien Air Dental</td><td>1700588-001</td><td>Electic motor engine</td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Henry schein animal health</td><td>NDC 11695-0500-2</td><td></td></tr><tr><td>1/4 round bur</td><td>Brasseler</td><td>001092T0</td><td></td></tr><tr><td>Endodontic K-file</td><td>Roydent</td><td>98947</td><td></td></tr><tr><td>ProRoot MTA</td><td>Dentsply</td><td>PROROOT5W</td><td>MTA</td></tr><tr><td>Paper point</td><td>Henry schein</td><td>100-3941</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Etch</td><td>Ultradent product Inc.</td><td></td><td>Phosphoric acid etchant</td></tr><tr><td>OptiBond SoloPlus</td><td>Kerr</td><td>29669</td><td>Adhesives</td></tr><tr><td>Coltolux LED</td><td>Coltene/whaledent Inc.</td><td>C7970100115</td><td>Curing light unit</td></tr><tr><td>Characterization tint</td><td>Bisco</td><td>T-14012</td><td>Flowable composite</td></tr><tr><td>Skyscan</td><td>Breuker</td><td>1275</td><td>uCT scanner</td></tr><tr><td>Microm</td><td>Thermo</td><td>HM355S</td><td>Microtome</td></tr><tr><td>Hematoxyline-1</td><td>Thermo Scientific</td><td>7221</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y</td><td>Thermo Scientific</td><td>7111</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-16</td><td>Mounting solution</td></tr></tbody></table>

development of a direct pulp-capping model for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in mice

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is often capped with biocompatible materials in order to expedite pulpal wound healing. The ultimate goal is to regenerate reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" and protects the underlying pulp tissue. Although this direct pulp-capping procedure has long been used in dentistry, the underlying molecular mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is still poorly understood. To induce reparative dentin, pulp capping has been performed experimentally in large animals, but less so in mice, presumably due to their small sizes and the ensuing technical difficulties. Here, we present a detailed, step-by-step method of performing a pulp-capping procedure in mice, including the preparation of a Class-I-like cavity, the placement of pulp-capping materials, and the restoration procedure using dental composite. Our pulp-capping mouse model will be instrumental in investigating the fundamental molecular mechanisms of pulpal wound healing in the context of reparative dentin in vivo by enabling the use of transgenic or knockout mice that are widely available in the research community.

ここでは、マウスの歯にキャッピングパルプを実行するためにステップバイステップの手順を示しました。マウスでキャッピングパルプの重要な側面の一つは、適切な装置を持つことです。この点において、10Xパワー倍率で顕微鏡を有する（ 図1A）が不可欠です。歯のClass-I様準備を作成するには、20万回転（ 図1B）の電気高速ハンドピースに1/4ラウンドのバリを使用しました。あるいは、圧縮空気を使用するものを含む他のエンジンは、歯を調製するために使用することができます。 図2A-2Eは、パルプキャッピングを実行するための代表的な手順が示されています。クラスIのような製剤は、（ 図2B）を行いました。水スプレーは、手順の間にマウスを紛らすことがあるので、その使用は推奨されません。このため、優しくintermiで歯を調製することが不可欠ですttentは過熱を防ぐためにストローク。圧縮空気の使用は、冷却効果を提供することをお勧めします。これは、修復象牙質形成（ 図2C）でのデータの解釈を妨げる可能性歯内治療ファイルでパルプを露出させ、パルプに象牙質の破片をプッシュしていない注意してください。これは、圧縮空気を使用することによって回避することができます。同様に、MTAは、パルプにすぎ押さずに露出してパルプに配置する必要があります。 MTAの配置は、穏やかなタッピング動作（ 図2D）で紙点の裏面を使用することによって達成することができます。 MTA配置した後、歯は、歯の上に、複合体の結合を妨害する可能性がある、溝内に残っているMTAを除去するために、H 2 O-浸した綿ペレットを使用して洗浄する必要があります。複合修復する従来の方法は、（流動可能な複合材料を、歯の表面をエッチング接着剤でプライミングおよび結合し、配置して硬化を含め、使用されています図2E）。 6週間パルプキャッピング後、マウスを回収し、そして上面図を複合体は（ 図3A）依然として無傷であったことを確認するために撮影しました。 μCTスキャンは、修復象牙質が歯髄に形成されたことを示唆している、パルプをかぶったグループ（ 図3B）に歯髄スペースの大幅な景気後退を示しました。脱灰組織サンプルはさらに、生体内で組織学的に修復象牙質の形成を調べるためにH＆E染色に供しました。対照群では、象牙芽細胞層（OB）が象牙質（ - 4C図4A）のエッジの周りに顕著に明らかでした。対照的に、パルプキャッピング基は、歯髄空間（ - 4F図4D）に形成された修復象牙質のかなりの量（RD）を有していました。興味深いことに、綿密に検討を修復象牙質（RD）は象牙質の典型的な特徴（ 例えば、秒を示したことを明らかにしました<html>象牙細管、赤い矢印を表す線）、ならびに骨のトラップされた骨芽細胞、黒色の矢じりを表す（ 例えば、骨細胞）をtriated。私たちは象牙質マトリックスタンパク質1（DMP1）、歯原性分化12のマーカーについて染色したとき、我々はキャップされていない歯（ 図5Aおよび5B）に比べパルプに覆われた歯の歯髄におけるDMP1の発現の有意な増加を発見しました、修復象牙質の歯髄内に形成されたことを示します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54973/54973fig1.jpg" /> 図1：パルプ・キャッピング手順のための機器のセットアップ。 （A）マウスの歯を可視化するための顕微鏡（10倍）。 （B）の高速ハンドピースとパルプを公開するクラスI製剤を調製するための電動モータエンジン。= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54973/54973fig2.jpg" /> 図2：キャッピング手順で代表的な手順。 （A）マウスにおける上顎第一大臼歯に準備されていない歯。 （B）四半期ラウンドのバリを使用して、初期のエナメル除去。歯内のファイルを使用して、（C）パルプ暴露。露出されたパルプ中の（D）MTA配置。歯の上（E）複合復元配置。バーは500μmで表します。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54973/54973fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54973/54973fig3.jpg" /> 図3：臨床プレゼンテーションとμCTScanninマウスにおけるパルプ、蓋をして、キャップのない歯のグラム。 （A）パルプをかぶった歯（左）とキャップなし歯（右）上でマウス上顎の咬合ビュー。 （B）上顎の断面μCT画像。バーは500μmで表します。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54973/54973fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54973/54973fig4.jpg" /> 図4：in vivoでの修復象牙質形成の組織学的証拠。 100X、200X、および400Xでのマウスでキャップされていない上顎第一大臼歯の（AC）H＆E染色。 100X、200X、および400Xでのマウスでは、パルプをかぶった上顎第一大臼歯の（DE）H＆E染色。 RD =修復象牙質;黒矢じり=バーは100μmで（OB =象牙芽細胞層を表し、骨細胞;赤色の矢印=象牙細管）。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54973/54973fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54973/54973fig5.jpg" /> 図5：DMP1の免疫組織化学染色。 400Xでのマウスでキャップされていない上顎第一大臼歯の（A）DMP1染色。 400Xでのマウスでは、パルプをかぶった上顎第一大臼歯の（B）DMP1染色。バーは100μmで表します。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54973/54973fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

我々は、in vivoでの歯髄創傷治癒と修復象牙質形成の評価のために、マウスの歯の上にキャッピング直接パルプを行うステップ・バイ・ステップ方式を説明します。

歯髄の評価のための直接覆髄モデルの開発、創傷治癒およびマウスにおける修復象牙質形成

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

development-direct-pulp-capping-model-for-evaluation-pulpal-wound

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

11.2K ビュー.  The UCLA School of Dentistry. 我々は、in vivoでの歯髄創傷治癒と修復象牙質形成の評価のために、マウスの歯の上にキャッピング直接パルプを行うステップ・バイ・ステップ方式を説明します。 

ビデオ: Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

創傷治癒のマウスモデル

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

医学

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

歯髄パラクリン信号に反応した神経突起の成長を研究する共培養法

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

発生生物学

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, proliferation and remodeling. Murine wounds have a histologically well-defined and easily recognizable wound bed over which these different phases of the healing process are measurable. Within the field, it is common to use an arbitrarily defined &#8220;middle&#8221; of the wound for histological analyses. However, wounds are a three-dimensional entity and often not histologically symmetrical, supporting the need for a well-defined and robust method of quantification to detect morphometric defects with a small effect size. In this protocol, we describe the procedure for creating bilateral, full-thickness excisional wounds in mice as well as a detailed instruction on how to measure morphometric parameters using an image processing program on select serial sections. The two-dimension measurements of wound length, epidermal length, epidermal area, and wound area are used in combination with the known distance between sections to extrapolate the three-dimension epidermal area covering the wound, overall wound area, epidermal volume and wound volume. Although this detailed histological analysis is more time and resource consuming than conventional analyses, its rigor increases the likelihood of detecting novel phenotypes in an inherently complex wound healing process.

This protocol describes how to generate bilateral, full-thickness excisional wounds in mice and how to subsequently monitor, harvest, and prepare the wounds for morphometric analysis. Included is an in-depth description of how to use serial histological sections to define, precisely quantify and detect morphometric defects.

マウス切除創傷治癒モデルと組織形態学的創傷解析

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, ...

2光子顕微鏡による歯科用細胞のライブトラッキング

Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal

The continuously growing mouse incisor is emerging as a highly tractable model system to investigate the regulation of adult epithelial and mesenchymal stem cells and tooth regeneration. These progenitor populations actively divide, move, and differentiate to maintain tissue homeostasis and regenerate lost cells in a responsive manner. However, traditional analyses using fixed tissue sections could not capture the dynamic processes of cellular movements and interactions, limiting our ability to study their regulations. This paper describes a protocol to maintain whole mouse incisors in an explant culture system and live-track dental epithelial cells using multiphoton timelapse microscopy. This technique adds to our existing toolbox for dental research and allows investigators to acquire spatiotemporal information on cell behaviors and organizations in a living tissue. We anticipate that this methodology will help researchers further explore mechanisms that control the dynamic cellular processes taking place during both dental renewal and regeneration.

著者スポットライト:成体マウス歯科組織の再生と修復における動的細胞挙動の理解 

Ex vivo live imaging is a powerful technique for studying the dynamic processes of cellular movements and interactions in living tissues. Here, we present a protocol that implements two-photon microscopy to live track dental epithelial cells in cultured whole adult mouse incisors.

Ex Vivo Live Imagingを用いたマウス歯の再生中の細胞分裂と動きの調査

The continuously growing mouse incisor is emerging as a highly tractable model system to investigate the regulation of adult epithelial and mesenchymal ...

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine models provide valuable mechanistic insight into these processes; however, no single model fully addresses all aspects of the wound healing response. Instead, it is ideal to use multiple models to address the different aspects of wound healing. Here, two different methods that address diverse aspects of the wound healing response are described. In the first model, polyvinyl alcohol sponges are subcutaneously implanted along the mouse dorsum. Following sponge retrieval, cells can be isolated by mechanical disruption, and fluids can be extracted by centrifugation, thus allowing for a detailed characterization of cellular and cytokine responses in the acute wound environment. A limitation of this model is the inability to assess the rate of wound closure. For this, a tail skin excision model is utilized. In this model, a 10 mm x 3 mm rectangular piece of tail skin is excised along the dorsal surface, near the base of the tail. This model can be easily photographed for planimetric analysis to determine healing rates and can be excised for histological analysis. Both described methods can be utilized in genetically altered mouse strains, or in conjunction with models of comorbid conditions, such as diabetes, aging, or secondary infection, in order to elucidate wound healing mechanisms.

Here, two murine wound healing models are described, one designed to assess cellular and cytokine wound healing responses and the other to quantify the rate of wound closure. These methods can be used with complex disease models such as diabetes to determine mechanisms of various aspects of poor wound healing.

後部皮下ポリビニルアルコールスポンジの移植と切除テール皮膚創傷モデルを用いた急性創傷治癒の評価

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

免疫・感染学

Digital Planimetry for Assessing Wound Closure Kinetics in a Mouse Model

Chronic wounds, due to their high prevalence, are a serious global health concern. Effective therapeutic strategies can significantly accelerate healing, thereby reducing the risk of complications and alleviating the economic burden on healthcare systems. Although numerous experimental studies have investigated wound healing, most rely on qualitative observations or quantitative direct measurements. The objective of this study was to standardize an indirect wound measurement method using digital planimetry, incorporating digital scaling and segmentation. This approach addresses the lack of detailed, step-by-step methodologies for accurate wound assessment. A photodocumentation booth was designed and constructed, and computer-assisted digital planimetry tools were employed to minimize variability in measurements of the wound area, perimeter, and the distance from the wound center to its edges. A circular traumatic wound (5 mm in diameter) was created on the dorsal midline at the shoulder blade level of male CD1 mice (n = 4, 10 weeks old, 30-35 g). Wound evolution was photodocumented for 14 days using the custom-designed photo booth, which controlled lighting conditions, focal distance, and subject positioning. Scaling and wound measurements were performed using segmentation in ImageJ software, and statistical analysis was conducted using statistical analysis software. The kinetics of wound closure showed a slight increase in wound size and perimeter between day 0 and day 2, followed by a gradual decrease until complete closure by day 14. The photodocumentation booth and computer-assisted digital planimetry enabled quantitative measurements with minimal variability. In conclusion, these tools provide a reliable and reproducible method for evaluating wound closure kinetics in pre-clinical models.

Wounds represent a global health challenge. This study developed a standardized photo booth utilizing digital planimetry to minimize wound measurement variability. Monitoring wounds in mice over 14 days revealed an initial increase in wound area and perimeter, followed by gradual closure. This methodology may aid in evaluating wound closure kinetics in pre-clinical models.

マウスモデルにおける創傷閉鎖速度を評価するためのデジタルプラニメトリー

Chronic wounds, due to their high prevalence, are a serious global health concern. Effective therapeutic strategies can significantly accelerate healing, ...

生物工学

新規マウスギャグを用いた歯髄炎症マウスモデルの作成 

Establishment of a Murine Pulp Exposure Model with a Novel Mouth-Gag for Pulpitis Research

Pulpitis, a common cause of natural tooth loss, leads to necrosis and loss of bioactivity in the inflamed dental pulp. Unraveling the mechanisms underlying pulpitis and its efficient treatment is an ongoing focus of endodontic research. Therefore, understanding the inflammatory process within the dental pulp is vital for improving pulp preservation. Compared to other in vitro experiments, a murine pulpitis model offers a more authentic and genetically diverse context to observe the pathological progression of pulpitis. However, using mice, despite their cost-effectiveness and accessibility, poses difficulties due to their small size, poor coordination, and low tolerance, complicating intraoral and dental procedures. This protocol introduces a novel design and application of a mouth-gag to expose mouse pulp, facilitating more efficient intraoral procedures. The mouth-gag, comprised of a dental arch readily available to most dentists and can significantly expedite surgical preparation, even for first-time procedures. Micro-CT, hematoxylin-eosin (HE) staining, and immunofluorescence staining were used to identify changes in morphology and cell expression. The aim of this article is to help researchers establish a more reproducible and less demanding procedure for creating a pulp inflammation model using this novel mouth-gag.

著者スポットライト:改良されたマウスモデルによる歯科歯髄研究の強化

This article presents a streamlined protocol for establishing a pulpitis model in mice using an innovative mouth-gag, followed by subsequent histological analysis.

歯髄の評価のための直接覆髄モデルの開発、創傷治癒およびマウスにおける修復象牙質形成

要約

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この動画の章

創傷治癒のマウスモデル

歯髄パラクリン信号に反応した神経突起の成長を研究する共培養法

マウス切除創傷治癒モデルと組織形態学的創傷解析

Ex Vivo Live Imagingを用いたマウス歯の再生中の細胞分裂と動きの調査

Ex Vivo Live Imagingを用いたマウス歯の再生中の細胞分裂と動きの調査

Ex Vivo Live Imagingを用いたマウス歯の再生中の細胞分裂と動きの調査

後部皮下ポリビニルアルコールスポンジの移植と切除テール皮膚創傷モデルを用いた急性創傷治癒の評価

マウスモデルにおける創傷閉鎖速度を評価するためのデジタルプラニメトリー

歯髄炎研究のための新規マウスギャグを用いたマウスパルプ曝露モデルの確立

歯髄炎研究のための新規マウスギャグを用いたマウスパルプ曝露モデルの確立