Queremos dar graças aos membros mais velhos do laboratório que ajudam a melhorar e refinar essas técnicas ao seu estado real: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada e Dr. Antonia Alcaraz-García. Estamos em dívida com o Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca para apoiar fortemente o desenvolvimento dessas técnicas. Também o Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Plano Estatal eu + D + I e o Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (n º de Grant: PI13/00794); www.ISCIII.es. reciclage FEDER "Una manera de hacer Europa". Agradecemos também a Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca e FFIS para assistência e apoio administrativo. Finalmente, queremos dar um agradecimento especial ao Dr. Isabel Martínez-Argudo e a Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico de la Fábrica de Armas, a Universidad Castilla la Mancha, Toledo pelo apoio gentil em ceder de bom grado a Biomedicina e biotecnologia laboratório para tornar possível a filmada parte deste trabalho.

1. artificial ferida ensaio zero para estudos quantitativos
<ol>
	<li>Preparação de monocamadas de células
	<ol>
		<li>Trabalhando sob condições estéreis, de sementes e desenvolvem-se células epiteliais Mv1Lu ou HaCaT em frascos de cultura usando meio de soro-completada. Atualize médio uma vez cada 24-48 h. Depois que as células alcançar 80% de confluência, desanexe células usando um método adequado, ou seja, tripsinização9. Nota: Mv1Lu HaCaT linhas de células epiteliais são cultivadas usando meio de cultura EMEM e DEMEM, respectivamente, suplementado com 2 mM L-glutamina e incubadas a 37 ° C, com uma atmosfera controlada de 5% de CO2. Cada linha da célula deve ser analisada cuidadosamente para determinar a concentração de células e temporização necessária para alcançar a plena confluência. Normalmente para as células de Mv1Lu ou HaCaT, 2-4 x 104 ou 4-6 x 104 células/poço, respectivamente, são semeados em um frasco de cultura2 175 cm, e em 80% a confluência rende até 35 x 106 Mv1Lu ou 1 x 107 células de HaCaT.</li>
		<li>Em qualquer uma placa de cultura bem-12 ou 24-bem, as sementes em cada poço 2 mL de células. Atualize a média uma vez a cada 24-48 h. Certifique-se de números de telemóvel são altos o suficiente para alcançar a confluência de 100% após 2 ou 3 dias.</li>
		<li>Depois que as células alcançar confluência, remover o meio suplementado por soro e lavar duas vezes com meio livre de soro fresco. Manter as células em meio livre de soro durante 24 h antes o arranhador. Nota: Células Mv1Lu ou HaCaT não tem exigências especiais de substrato; no entanto, para linhas de células sensíveis a desanexação espontaneamente em condições de livre de soro, pré-revestimento de superfície da placa de cultura, usando uma solução de poli-L-lisina deve ser considerado10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monocamada coçar
	<ol>
		<li>Trabalhando em um ambiente estéril, arranhe a monocamada de cultura arrastando-se firmemente a extremidade estreita de um 20 µ l ou 200 µ l de micropipeta estéril ponta, dependendo da largura zero desejada. Mantenha a ponta perpendicular à superfície de cultura para maximizar a homogeneidade de lacuna.<ol>
			<li>Coloque as placas de cultura sobre uma superfície escura para monitorar claramente a monocamada de células. Se necessário, realize dois arranhões perpendiculares (em forma de cruz) em cada poço para estudar até 4 áreas de migração.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Lavam-se células desanexadas removendo suavemente o meio de cultura e suavemente adicionando meio livre de soro fresco. Repita duas vezes, ou até mais solteira células foram removidas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coleção de dados e procedimento experimental
	<ol>
		<li>Com até 4 imagens de referência de pré-tratamento centradas sobre o fosso de risco de cada poço usando um microscópio de contraste de fase invertida, incorporando uma câmera CCD. Selecione áreas de interesse, alinhando a borda do campo do microscópio para o cruzamento adjacente de arranhões. Nota: Normalmente, imagens são adquiridas utilizando uma ampliação de 10x e um tamanho de imagem de 1.280 x 1.024 pixels. Seleção de áreas de interesse, como descrito acima ajuda para fácil localização e validação de até 4 medições por bem.</li>
		<li>Uma vez que todas as imagens são adquiridas, designar poços de tratamento; câmbio médio em poços com meio fresco que contém tratamentos selecionados. Nota: Como alternativa, para produtos químicos ou compostos que não perturbe a homogeneidade do meio de cultura, tratamentos podem ser inoculados diretamente no meio de cultura.</li>
		<li>Incube a placa riscada (37 ° C com uma atmosfera controlada contendo 5% CO2) até as condições em fechamento de abertura zero observação alcance 90%. Evite o fechamento completo. Nota: Encerramento Total lacuna anula coleção pós-tratamento de imagens, como áreas de referência não são detectáveis e a referência de tempo para o fechamento de lacuna não pode ser estabelecida. No caso de células Mv1Lu ou HaCaT, 16-19 h são necessários para alcançar a confluência de 90%.</li>
		<li>Parar a migração celular, fixando as células; delicadamente, substitua o meio de cultura experimental com 1 mL de formol a 4% em PBS. Incubar durante 15 min em RT.</li>
		<li>Lavar as células para remover o formol em excesso; Substitua suavemente a solução em poços com PBS fresco. Repita pelo menos duas vezes. Nota: Nesta fase, após a selagem, placas podem ser armazenadas a 4 ° C indefinidamente.</li>
		<li>Com imagens de referência pós-tratamento de cada poço das áreas de referência original capturado depois de coçar. Use os mesmos equipamentos (microscópio de contraste de fase ótica invertida incorporando uma câmera CCD) e definições de imagem correspondente (ampliação e resolução digital/densidade). Nota: Para as células que migram individualmente e preencher a lacuna independentemente da formação de uma frente coerente (por exemplo, células humanas de câncer de mama MDA-MB-231), as imagens do tempo-curso podem permitir o cálculo das velocidades de migração de células individuais.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análise de imagem e quantificação da migração
	<ol>
		<li>Usando o software (por exemplo, ImageJ) de processamento de imagem, definir limites de risco lacuna e determinar a superfície de abertura para até quatro medições no pré-tratamento de fotos. Gravar os dados como "superfície de lacuna de pré-tratamento" (PREGAP). Repita o mesmo procedimento para pós-tratamento fotos. Gravar os dados como "superfície de pós-tratamento lacuna" (POSTGAP).<ol>
			<li>Abra a imagem gravada usando o ImageJ. No menu "imagem", defina o tipo de imagem de 8 bits. No menu "processo", ir para o submenu "filtros" e aplicar a filtragem de "desvio".</li>
			<li>No menu "imagem", digite "ajustar" submenu e definir o limiar para preto e branco (B &#38; W), certifique-se de "Fundo escuro" não está seleccionado. No menu "processo", ir para o submenu "binário" e selecione "tapar buracos".</li>
			<li>No menu "analisar", selecione "definir medidas" e ative a "área". Em seguida, desenhe a área mensurável, seguindo o contorno de borda migrando delimita, assim, a lacuna.</li>
			<li>No menu "analisar", selecione "analisar partículas" e gravar valores de "área total" para a superfície da área desenhada.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Introduzir o PREGAP e POSTGAP valores de área total em uma folha de cálculo para quantificar a migração absoluta para cada conjunto de amostras individuais como a diferença de medições de superfície lacuna: PREGAP − POSTGAP [unidades arbitrárias]. Além disso, normalizar dados de migração absoluta de cada condição para amostras de controlo: (amostra / controle) * 100 [%]. Nota: Para as células que migram individualmente e preencher a lacuna independentemente da formação de uma frente coerente, (por exemplo, células humanas de câncer de mama MDA-MB-231), a migração absoluta pode ser calculada pela contagem de células invadindo uma central na tira o controle ou as amostras tratadas.</li>
		<li>Plotagem de saídas de quantificação (ver Figura 1). Realizar análise estatística se necessário.</li></ol></li></ol>Considere o teste t de Student quando comparando duas condições ou teste de análise de variância para o maior número de condições.
	
	

2. ensaio da frente de migração artificial para estudos topográficos
<ol>
	<li>Preparação de monocamadas de células
	<ol>
		<li>Trabalhando em condições estéreis, coloque uma camada de lamelas redondas esterilizadas em placas de cultura vazia até a superfície da chapa é completamente coberto. Nota: Até 12 e 33 lamelas cabem em 5 cm e placas de 10 cm de diâmetro, respectivamente.</li>
		<li>Na placa de cultura, sementes delicadamente um volume adequado de células em uma concentração que permite a confluência de 100% após 2 ou 3 dias. Certifique-se de que sem lamela se sobrepõe as lamelas de vizinhas e impedir que as lamelas flutuando aplicando uma pressão suave com uma ponta da micropipeta estéril. Atualize o meio cada 24-48 h. Nota: Cada linha da célula deve ser analisada cuidadosamente para determinar a concentração de células e temporização necessária para alcançar a plena confluência. Normalmente para as células de Mv1Lu ou HaCaT, 2-3 x 106 ou 2.5-4 x 10 placa de6 células/10 cm de diâmetro, respectivamente, são semeados. Para placas menores, deve ser reduzido número de células.</li>
		<li>Depois que as células alcançar confluência, remover o meio de soro-completados e substitua meio livre de soro fresco. Manter as células em meio livre de soro durante 24 h antes que a ferida artificial é realizada. Nota: Células Mv1Lu ou HaCaT não tem exigências especiais de substrato; no entanto, para linhas de células suscetíveis de desanexação espontaneamente em condições de livre de soro, pre-revestimento da superfície da cultura usando uma solução de poli-L-lisina deve ser considerado10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monocamada ferindo
	<ol>
		<li>Usando uma pinça estéril, movimente suavemente uma lamela para um prato limpo 10 cm contendo meio livre de soro fresco. Evite danificar a monocamada, segurando a lamela na periferia, com uma pinça. Evite pressão excessiva, o que pode resultar na ruptura da lamela.</li>
		<li>Crie feridas artificiais, arrastando uma lâmina de barbear esterilizada em uma linha transversal sobre o centro das lamelas. Arraste 3 a 4 mm e para trás, a fim de remover completamente a tira central monocamada. Certifique-se de que detritos nenhuma célula permanece anexado às bordas da ferida. Nota: em um diâmetro de 12 mm redondo lamela, a incisão é feita na meados da lamela. Certifique-se de deixar um traço de células em frente a frente principal grande o suficiente (pelo menos 2 mm de largura) para evitar a inclinação da lamela nas etapas a seguir.</li>
		<li>Transferi as lamelas de feridos com células virada para cima, para uma limpeza 6 placa contendo pelo menos 2 mL soro livre meio fresco. Cabem até 4 lamelas feridos/bem.</li>
		<li>Delicadamente, lave duas vezes com produtos frescos meio livre de soro para remover células desanexadas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amostragem e procedimento experimental
	<ol>
		<li>Delicadamente câmbio médio em poços com meio fresco que contém tratamentos selecionados. Nota: Como alternativa, para produtos químicos ou compostos que não perturbe a homogeneidade do meio de cultura, tratamentos podem ser inoculados diretamente no meio de cultura. Proceda com cuidado para evitar qualquer potencial desprendimento de células.</li>
		<li>Manter a placa dentro de uma incubadora de célula (37 ° C, 5% CO2) para a altura desejada experimental.</li>
		<li>Parar a migração celular, fixando as células; delicadamente, substitua o meio de cultura experimental com 1 mL de formol a 4% em PBS. Incubar durante 15 min em RT. Nota: Para curso de experiências de tempo, remova as amostras da placa de cultura e corrigi-los em um prato separado para evitar os vapores de formol que afectam as condições experimentais, outras em andamento.</li>
		<li>Lavar as células para remover o formol em excesso; Substitua suavemente a solução em poços com PBS fresco. Repita pelo menos duas vezes. Nota: Nesta fase, após a selagem, placas podem ser armazenadas a 4 ° C indefinidamente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Imunofluorescência (IF) e análise topológica
	<ol>
		<li>Realizar-se a coloração e imagem latente em lamelas individuais como descrito em outra parte3,4,11.<ol>
			<li>Permeabilize por 10 min por imersão lamelas em uma solução de Triton X-100 0,3% em PBS.</li>
			<li>Bloco para 30 min, usando a seguinte solução de bloqueio: 0,3% albumina de soro bovino; 10% de soro fetal bovino; 5% de leite desnatado; 0,3 solução de Triton X-100% em PBS. Nota: Obstrui a solução sem leite pode ser preparado antecipadamente e armazenado a-20 ° C.</li>
			<li>Encube por 1h à temperatura ambiente dentro de uma câmara úmida, com anticorpo primário, diluído em solução de bloqueio isento de leite. Coloque as lamelas de ponta-cabeça na solução de anticorpo de 15 µ l para garantir a distribuição adequada. Nota: A diluição de trabalho do anticorpo é variável e dependerá do anticorpo em uso. Por exemplo, o anticorpo anti-c-Jun requer uma diluição de 1/100.</li>
			<li>Lavar três vezes mergulhando as lamelas em uma solução de Triton X-100 em 0,1% em PBS.</li>
			<li>Incube as lamelas em anticorpo secundário diluído em tampão de bloqueio isento de leite por 30 min. Nota: A diluição de trabalho do anticorpo é variável e dependerá do anticorpo em uso. Por exemplo, o bode-anticoelho (488) requer uma diluição de 1/400 para resolução ideal. Outros reagentes rotulagem como faloidina e Hoechst 33258 podem ser adicionados para o buffer de incubação nesta fase.</li>
			<li>Lavar três vezes mergulhando as lamelas em solução de Triton X-100 0,1% em PBS.</li>
			<li>Monte as lamelas de ponta-cabeça em 10 µ l montagem mídia queda (por exemplo, Vectashield) colocada sobre uma lâmina de microscópio. Deixe os slides no escuro à temperatura ambiente durante a noite para o endurecimento de médio de montagem. Depois, loja a 4 ° C, no escuro, indefinidamente.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Obter imagens de microscopia confocal de mudanças estruturais que ocorrem na borda frontal migrando ou epifluorescência. Nota: Estudos topológicos podem ser executados por fotos da frente migrando para a interior monocamada de ladrilho. Semi-quantitativa de estudos são possíveis pela análise de software baseado em intensidades de fluorescência local.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Singer, A. J., Clark, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+wound+healing.">Cutaneous wound healing.</a> N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).</li><li>Davidson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+wound+repair.">Animal models for wound repair.</a> Arch Dermatol Res. 290, S1-S11 (1998).</li><li>Alcaraz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+Membrane+Modifies+the+Genetic+Program+Induced+by+TGFss,+Stimulating+Keratinocyte+Proliferation+and+Migration+in+Chronic+Wounds.">Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds.</a> PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).</li><li>Ruiz-Canada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+membrane+stimulates+cell+migration+by+modulating+Transforming+Growth+Factor-beta+signaling.">Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2017).</li><li>Schmierer, B., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta-SMAD+signal+transduction:+molecular+specificity+and+functional+flexibility.">TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).</li><li>Hu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAK+and+paxillin+dynamics+at+focal+adhesions+in+the+protrusions+of+migrating+cells.">FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells.</a> Sci Rep. 4, 6024 (2014).</li><li>Martinez-Mora, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroin+and+sericin+from+Bombyx+mori+silk+stimulate+cell+migration+through+upregulation+and+phosphorylation+of+c-Jun.">Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun.</a> PloS one. 7 (7), e42271 (2012).</li><li>Bernabe-Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oleanolic+acid+induces+migration+in+Mv1Lu+and+MDA-MB-231+epithelial+cells+involving+EGF+receptor+and+MAP+kinases+activation.">Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation.</a> PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).</li><li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells.">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J Biomed Sci. 17, 36 (2010).</li><li>Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+tissue+culture+coating+substrates+on+prostate+cancer+cell+adherence,+morphology+and+behavior.">Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior.</a> PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).</li><li>Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta-independent+shuttling+of+Smad4+between+the+cytoplasm+and+nucleus.">Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus.</a> Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).</li><li>Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+and+cytokines+in+wound+healing.">Growth factors and cytokines in wound healing.</a> Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).</li><li>Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+wound+repair:+Are+they+cutting+it?.">Animal models of wound repair: Are they cutting it?.</a> Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).</li><li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li><li>Insausti, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+membrane+induces+epithelialization+in+massive+posttraumatic+wounds.">Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds.</a> Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).</li><li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+arrest+in+G0/G1+phase+by+contact+inhibition+and+TGF-beta+1+in+mink+Mv1Lu+lung+epithelial+cells.">Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells.</a> Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).</li><li>Boukamp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+keratinization+in+a+spontaneously+immortalized+aneuploid+human+keratinocyte+cell+line.">Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line.</a> J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).</li><li>Marshall, J., Wells, C. M., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , 97-110 (2011).</li><li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+accurate+quantification+of+cell+migration+using+human+small+intestine+cells.">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li><li>Szybalski, W., Iyer, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinking+of+DNA+by+Enzymatically+or+Chemically+Activated+Mitomycins+and+Porfiromycins,+Bifunctionally+"Alkylating"+Antibiotics.">Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally "Alkylating" Antibiotics.</a> Fed Proc. 23, 946-957 (1964).</li><li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C:+small,+fast+and+deadly+(but+very+selective).">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).</li><li>Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+using+silicone+elastomer+masks+for+quantitative+analysis+of+cell+migration+without+cellular+damage+or+substrate+disruption.">A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption.</a> Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).</li><li>Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phospholipase+in+generating+lipid+second+messengers+in+signal+transduction.">Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction.</a> FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).</li><li>Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+into+a+wounded+area+in+vitro.">Cell migration into a wounded area in vitro.</a> Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).</li></ol>

Os autores declaram que não há nenhum conflito de interesses.

Em cima da pele ou mucosa interrupção, função de barreira é restaurada pelas ações de numerosos tipos de células, incluindo fibroblastos ou células epiteliais e imunes. Em conjunto, estas células passam por um complexo processo envolvendo a apoptose, proliferação, diferenciação e importante, fibroblastos e epiteliais células migração, que é o derradeiro mecanismo responsável pela restauração do tecido interrompida e o encerramento do fosso epitelial superficial1,12 assim, estudando a migração celular ajuda a descrever precisamente o comportamento fisiológico das células epiteliais, enquanto também determinar o potencial moduladora de tratamentos para a ferida cura.
Realizando feridas artificiais em modelos animais de pesquisa diferentes permite a replicação deste processo complexo em perto de condições fisiológicas2e, portanto, a avaliação de algumas condições patológicas ou os efeitos de produtos farmacêuticos tratamentos13. No entanto, esta abordagem muitas vezes resulta em logística complicada e onerosa, bem como procedimentos experimentais pesados que podem gerar dados em uma moda atrasada13. Pelo contrário, em vitro cultura de pilha fornece uma estrutura mais conveniente para pesquisar o comportamento das células envolvidas no processo de cura da ferida. Enquanto a cultura de células primárias de células epiteliais constitui uma opção viável, pode ser difícil de obter e manipular as células, que podem complicar a coleta de dados. Por exemplo, juntamente com a restrição de baixo-passagem típica de culturas primárias, queratinócitos humanos primários necessário um fibroblasto alimentação camada para crescimento em vitro3. Pelo contrário, as linhas de cultura de células epiteliais bem estabelecida, como Mv1Lu ou HaCaT, constituem um modelo de pesquisa livre de obstáculos que apresenta comportamento e características como as de cultura primária células3,4, 14,15. Precisamente, para o estudo da cicatrização de feridas, estas linhas de duas células mantêm traços críticos na sua capacidade de migrar e parar a proliferação devido à inibição de contato célula a célula sobre a confluência16,17.
Ensaios de risco são um método confiável e versátil para quantificar os recursos migratórios de diferentes tipos de células, especialmente epiteliais e células cancerosas. Para o caso de células de câncer, o método zero tem sido proposto para avaliação do potencial invasivo. No entanto, esta abordagem está aquém como um indicador para invasividade quando comparado com métodos mais específicos, baseando-se na expressão de metaloproteases necessários para penetrar a matriz extracelular18,19. Pelo contrário, ensaios zero são fiáveis para avaliar o desempenho migratório das células epiteliais e o efeito de diferentes tratamentos sobre essa característica. Em contraste com as linhas de células de câncer, que frequentemente mostram pobre coesão e a capacidade de crescer em várias camadas, Mv1Lu, HaCaT e outras células epiteliais linhas forma firmemente associada "crescimento ilhas", que expandem as suas margens em um processo dependendo ambas proliferação, mas mais importante ainda no migração de celular. Consequentemente, as condições de densidade celular esparsas ou sub confluente convencionalmente são utilizadas para estudar os efeitos de diferentes tratamentos sobre a fisiologia migratória; especialmente quando são aplicadas técnicas subsequentes de biologia molecular, como esta célula ambiente minimiza a inibição de contato enquanto maximizar o rácio de ativamente migrando as células. No entanto, para as células epiteliais, condições não-confluente levantar o risco de excluindo influências importantes de inibição de contato pré-existente, por exemplo sob a forma de regulamento epigenética. Assim, para estudar a cicatrização de feridas, confluentes condições conferem maior fidelidade do modelo.
Para obter estimativas precisas, devem ser dirigidas concomitantes fatores afetando a conformação da camada de células epiteliais ou contribuindo para a migração. Enquanto confluência é desejada, é importante evitar a densidade celular excessiva ou culturas de várias camadas, desde que estas condições podem afectar negativamente. Portanto, proliferação comumente é controlada pela inanição em media serum-free ou pela adição de produtos químicos como mitomicina C, que prender irreversivelmente a proliferação celular por DNA reticulação3,20, 21. a utilização de um ou outro depende do comportamento das linhas de célula específica; Mitomicina C é especialmente indicada quando reduzido suplementação de soro é necessário para evitar o desprendimento de massa celular. Esse é o caso de células HEK-293T, onde pre-revestimento da superfície de cultura usando poli-L-lisina é uma boa opção para evitar o tratamento de Mytomycin C. A liberação de fatores inflamatórios que podem alterar a migração também precisa ser tratada. Diferentes estratégias têm sido utilizadas, baseados principalmente em inserções do silicone para imitar a ruptura da superfície epitelial, alcançada com o zero do ensaio22. Enquanto inserções geram lacunas existentes que permitem a migração celular, depois de retirar a peça do silicone, o método zero depende diretamente removendo alguns da monocamada epitelial para gerar a lacuna. Preferência em como gerar a lacuna baseia-se na capacidade de inserções para proteger o revestimento de superfície de cultura (ou seja, placa de cultura ou poli-L-lisina) contra danos durante a coçar, minimizando também a liberação de fatores de células danificadas, o que pode comprometa o comportamento de cultura de nível23. Embora estas características podem ser útil para algumas configurações experimentais, ou seja, avaliar a capacidade das células cancerosas de migrar, em nossa experiência encontramos desvantagens significativas para o uso de pastilhas em estudos de cicatrização de feridas. Mv1Lu células são capazes de anexar à silicone inserir superfície exterior, que resulta em sem querer rasgar a monocamada de células após a remoção das peças do silicone. Também, embora as células HaCaT não anexar ao silicone, encontramos uma capacidade diminuída para essas células para migrar em lacunas geradas por inserção. Que extensão, inflamação e migração são respostas firmemente associadas, e estes parecem ser críticos juntos no contexto da cicatrização de feridas em células HaCaT. Além disso, desde que aplicar uma ponta plástica para riscar a superfície de cultura não tem nenhuma consequência aparente sobre a capacidade das células para repovoar a lacuna, no caso de células HaCaT, tal comportamento sugere que os restos de matriz extracelular na brecha guie a migração em um estilo similar ao dermis em uma ferida natural.No entanto, a principal fonte de variação continua a ser o procedimento arranhando em si, como o uso de uma ponta plástica para fazer a ferida sempre não processa a mesma diferença de tamanho. Observamos variações de até 20% entre amostras diferentes, devido à inconsistência de pressão e a posição da ponta no momento do zero. Estas variações podem ser abordadas por ferindo a monocamada com um objeto mais rígido; no entanto, qualquer arranhão na superfície do plástica colocaria em risco a livre circulação das células. Então, variações no zero inicial devem ser tomadas em consideração para calcular a migração; Normalmente, aumentando o número de medição por condição.
Além de quantificação, aplicar procedimentos ferindo juntamente com técnicas clássicas se pode qualitativamente avaliar os processos moleculares de migração celular. A capacidade das células epiteliais de crescer em lamelas é bem conhecidas; no passado, as variações da risque ensaios envolvidas células migrando em lamelas expostas a diferentes condições, seguidas de fixação e coloração para comparação dentro da ferida-zero configuração experimental24. Aqui, nós achamos que criando aberturas largas em monocamadas crescendo em lamelas permite para estender o tempo experimental cursos3,4,7. Além disso, em experiências, se aumenta as capacidades de detecção do procedimento potencialmente estudar qualquer precisos mecanismos celulares e subcelulares envolvidos, e só é limitada pela disponibilidade de anticorpos adequados para esta técnica e o células de interesse. Amostras nas lamelas usadas para se são montadas em corrediças do microscópio, que permitem a conservação prolongada. Isso ajuda a aplicação de configurações de experimentais que requerem períodos de tempo de estudo, como as abordagens de "telha" apresentou aqui e alhures,3,4,7. Enquanto a estratégia de "telha" integra padrões espaciais com dados temporais para reconstruir os mecanismos envolvidos na migração, a implementação de ferramentas de análise de software pode fornecer semi-quantitativa de avaliações com base no local da fluorescência intensidade e enriquecer ainda mais a qualidade das informações obtidas. Em nossa experiência, a telha também oferece a possibilidade de estudar a informação posicional de célula para a expressão de proteínas neste tipo de ensaio. Esta informação posicional foi mostrada para ser crucial para compreender e traduzir melhor os efeitos dos diferentes agentes na migração celular, especialmente em instalações onde a posição das células epiteliais é muito importante para determinar seu comportamento migratório3 ,4,14,15.
Ambos os procedimentos descritos demonstram grande conveniência pela implementação descomplicada, bem como produzir dados de qualidade. Assim, essas abordagens baseadas em estudos de microscopia, oferecer uma estrutura única e poderosa para estudar a dinâmica e a mudanças morfológicas envolvidos no comportamento de célula epitelial, e a resposta aos tratamentos durante a cicatrização de feridas.

Migração celular é necessária para a cicatrização de feridas, como é responsável para o fechamento final do gap epitelial e restauração da superfície interrompidos1. Apresentando ferimentos artificiais em modelos animais permite a replicação deste complexo processo em perto de condições fisiológicas2. No entanto, esta abordagem muitas vezes resulta em procedimentos experimentais caros e complicados, que potencialmente carecem de precisão para o estudo de processos distintos, devido à natureza complexa do processo de cicatrização de feridas.
Cultura in vitro de linhas de células epiteliais fornece uma alternativa útil para modelos animais para pesquisar o papel que estas células desempenham na cicatrização de feridas e os efeitos do tratamento sobre comportamento migratório de célula. A fisiologia das células epiteliais geralmente é estudada por técnicas moleculares usando não confluente culturas3,4,5,6; no entanto, o rompimento da integridade do epitélio é geralmente conseguido incisões mecânicas fina. Em cultura de células, isto implica que o insignificante número de células pode ser exposto para a abertura da ferida, e representam uma amostra muito pequena para as técnicas de biologia molecular. No entanto, estas lesões podem ser estudadas em escala microscópica, aproveitando as propriedades migratórias inatas de algumas linhas de células epiteliais, tais como a célula epitelial de pulmão vison (Mv1Lu) ou a célula de queratinócitos humanos espontaneamente imortalizado (HaCaT) linhas.
Aqui nós descrevemos um método para a microscopia que é adequado para obter dados quantitativos sobre a migração de células epiteliais no contexto de3,4,7,8de cicatrização de feridas. Além disso, apresentamos métodos adicionais que são úteis para estudar mudanças qualitativamente moleculares e morfológicas que ocorrem em monocamadas epiteliais durante a migração. Em geral, esses métodos fornecem uma estrutura para estudar a dinâmica e a mudanças morfológicas envolvidas com comportamento de célula epitelial e resposta aos tratamentos durante a cicatrização de feridas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td>L0102-500</td>
			<td>Optional 10 % FBS supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagles&#8217;s Minimum Essential Medium (EMEM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12 -662F</td>
			<td>Optional 10 % FBS supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td>Use at 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>DE17603A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Dilute as appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14200-067</td>
			<td>Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plates</td>
			<td>BD FALCON//SARSTED</td>
			<td>734-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Used 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass</td>
			<td>MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>MENZCB00120RA020</td>
			<td>SHORT DEPTH OF FIELD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reinforced razor blade no. 743</td>
			<td>Martor (through VWR)</td>
			<td>MARO743.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l sterile aerosol pipet tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-0541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;l sterile aerosol pipet tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-0528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera coupled phase contrast microscope</td>
			<td>Motic Spain</td>
			<td>Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>ZEISS Microimaging, Germany</td>
			<td>LSM 510 META</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Culture dish</td>
			<td>BD FALCON</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-1694</td>
			<td>Used 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Used 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33258</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>14530</td>
			<td>Used 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12381</td>
			<td>Used 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-2323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>BD DIFCO</td>
			<td>232100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td>Release 1.50i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen LSM 510 image processing software</td>
			<td>ZEISS Microimaging, Germany</td>
			<td>Release 5.0 SP 1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy based methods for the assessment of epithelial cell migration during in vitro wound healing

Migração celular é um aspecto obrigatório para cicatrização de feridas. Criação artificial feridas em modelos animais de pesquisa muitas vezes resulta em procedimentos experimentais caros e complicados, enquanto potencialmente carente de precisão. Cultura in vitro de linhas de células epiteliais fornece uma plataforma adequada para pesquisar o comportamento de células migratórias na cicatrização de feridas e o impacto de tratamentos nessas células. A fisiologia das células epiteliais é frequentemente estudada em condições não-confluente; no entanto, esta abordagem pode não se assemelham a ferida natural, condições de cura. Rompendo a integridade do epitélio por meios mecânicos, gera um modelo realista, mas pode impedir a aplicação de técnicas moleculares. Consequentemente, as técnicas de microscopia com base são ideais para estudar a migração de células epiteliais in vitro. Aqui nós detalhe dois métodos específicos, o ensaio de zero ferida artificial e o ensaio de migração artificial frontal, que pode obter dados quantitativos e qualitativos, respectivamente, sobre o desempenho migratório das células epiteliais.

Ensaio de zero ferida artificial para estudos quantitativos: avaliação fator de crescimento epidérmico (EGF) promoção da migração:
EGF é um conhecido indutor de proliferação de células epiteliais e migração e, portanto, um controle positivo para quantificar a promoção de migração. Monocamadas de células Mv1Lu e HaCaT foram utilizadas em ensaios de zero a ferida e pré-tratamento fotos foram obtidas. Após a inoculação com 10 ng/mL EGF, as células foram incubadas durante 19 h antes da fixação e pós-tratamento fotos. Proliferação foi mantida a um mínimo, mantendo as condições de fome de soro. Conjuntos de pré e pós-tratamento de fotos foram analisados usando o ImageJ e determinaram-se as áreas de abertura central. O experimento foi executado em duplicado, registrando quatro medições para cada poço. Quantificação da migração absoluta foi calculada como a diferença de superfícies: (PREGAP − POSTGAP). Havia um maior potencial migratório nas células Mv1Lu estimuladas (figura 1A) em comparação com as células de HaCaT estimuladas (figura 1B). As diferenças são explicadas por fontes da célula, sendo a mucosa células epiteliais e pele queratinócitos, respectivamente.
Ensaio frente de migração artificial para estudos topográficos: variações na conformação do citoesqueleto e espacial expressão de C-Jun:
Migração celular envolve mudanças contínuas e profundas da estrutura do citoesqueleto a fim de manter o deslocamento da célula. Monocamadas de células de HaCaT foram utilizadas os ensaios de migração da frente sob condições de controle e estimulação. Tratamento com EGF potencializa a dinâmica do citoesqueleto, que é observada por IF e laser microscopia (LSM; Figura 2A). Tratamento de EGF também resulta em robusto quinases de proteína Mitogen-Activated (mapa) sinalização e superexpressão de c-JUN. Imagens LSM de ladrilho permite a configuração de padrões espaciais. Aumento da expressão de c-JUN em células adjacentes para a frente de migração pode ser facilmente revelado por análise de imagem de software; aqui, nós implementamos uma escala de arco-íris para o canal verde, que correspondem a rotulagem do c-JUN (Figura 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56799/56799fig1.jpg"> 
Figura 1. Promoção de migração por EGF em células Mv1Lu e HaCaT. Imagens de microscopia de contraste de fase da área ferida de Mv1Lu (A) e HaCaT (B) células foram tomadas sob condições de controle e em comparação com imagens das células tratadas com 10 ng/mL EGF para 19 h em condições de livre de soro. Micrografias representativas mostram a extensão da lacuna zero e encerramento obtidos após ferimento com uma ponta de micropipeta de 20 µ l. Ampliação = 10 x; Barra de escala = 100 µm. célula de migração foi quantificada e representada como variação das diferenças entre os tratamentos e controle de amostras para cada ensaio (unidades arbitrárias; área AU). O enredo é representante de oito medições independentes para cada condição. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56799/56799fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56799/56799fig2.jpg"> 
Figura 2. Filamentos de actina e mudanças de expressão de c-JUN, promovidas pela EGF na migração de células de HaCaT. (A), durante a noite 10 ng/mL EGF tratamento promove mudanças profundas na conformação dos filamentos de actina em células migrando de HaCaT. Células na frente das condições de controle de migração retratar um citoesqueleto de filamentos de actina rigidamente estruturado, enquanto as células tratadocom com EGF mostrar organização de filamentos de actina pobre na parte dianteira de migração. Ampliação = 63 x; Barra de escala = 20 µm. F-Actina é o código de cores vermelho, e Hoechst é representada por uma cor azul. (B) quando imuno-fluorescência é usado em combinação com LSM imaging para estudar a expressão de c-JUN após tratamento de 10 ng/mL EGF na migração de células de HaCaT, composições de azulejos revelam padrões de expressão espacial. Imagens de fluorescência c-Jun (verde) foram convertidas em pseudo cor para mostrar a intensidade da coloração de c-Jun. A escala de cores do arco-íris representa a intensidade de fluorescência para c-Jun, correspondente a colormaps nos painéis da direito para EGF e controle. Co de coloração com faloidina (vermelho) e Hoechst-33258 (azul) foi usado para mostrar a estrutura celular e núcleos, respectivamente. Imagens foram tiradas por um microscópio confocal. Observe o aumento dos níveis de expressão de c-Jun nuclear em áreas chegando a frente de migração. Barra de escala = 40 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56799/56799fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing at JoVE.com

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Este manuscrito descreve como incisão lesões-feitas em monocamadas de células epiteliais culta convenientemente modelo ferida cura em vitro, que permita a para a imagem latente confocal ou microscopia de varredura a laser, e que pode proporcionar alta qualidade dados quantitativos e qualitativos para estudar tanto o comportamento da célula e os mecanismos envolvidos na migração.

Microscopia com base em métodos de avaliação da migração de células epiteliais durante a cicatrização em Vitro

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

microscopy-based-methods-for-assessment-epithelial-cell-migration

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

9.2K visualizações.  IMIB-Arrixaca. Este manuscrito descreve como incisão lesões-feitas em monocamadas de células epiteliais culta convenientemente modelo ferida cura em vitro, que permita a para a imagem latente confocal ou microscopia de varredura a laser, e que pode proporcionar alta qualidade dados quantitativos e qualitativos para estudar tanto o comportamento da célula e os mecanismos envolvidos na migração.

Vídeo: Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Heterotípica tridimensional<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelagem de Estroma-epitelial de ovário Interações durante o início e progressão do câncer

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Medicina

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Modelo Murino de Cicatrização

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

Murino Endoscopia para<em&gt; In Vivo</em&gt; Cura Multimodal imagem de Carcinogênese e Avaliação de Intestinal ferida e inflamação

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The etiology of IBD remains unknown and current therapeutic strategies are based on the unspecific suppression of the immune system. The development of treatments that specifically target intestinal inflammation and epithelial wound healing could significantly improve management of IBD, however this requires accurate detection of inflammatory changes. Currently, potential drug candidates are usually evaluated using animal models in vivo or with cell culture based techniques in vitro. Histological examination usually requires the cells or tissues of interest to be stained, which may alter the sample characteristics and furthermore, the interpretation of findings can vary by investigator expertise. Digital holographic microscopy (DHM), based on the detection of optical path length delay, allows stain-free quantitative phase contrast imaging. This allows the results to be directly correlated with absolute biophysical parameters. We demonstrate how measurement of changes in tissue density with DHM, based on refractive index measurement, can quantify inflammatory alterations, without staining, in different layers of colonic tissue specimens from mice and humans with colitis. Additionally, we demonstrate continuous multimodal label-free monitoring of epithelial wound healing in vitro, possible using DHM through the simple automated determination of the wounded area and simultaneous determination of morphological parameters such as dry mass and layer thickness of migrating cells. In conclusion, DHM represents a valuable, novel and quantitative tool for the assessment of intestinal inflammation with absolute values for parameters possible, simplified quantification of epithelial wound healing in vitro and therefore has high potential for translational diagnostic use.

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

Multimodal Quantitative Fase de imagem com o Digital Holographic Microscopia com precisão Avalia Cura inflamação intestinal e epitelial de Feridas

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients with impeded blood flow or with large wounds might be prolonged. Cell-based therapies have appeared as a new technique for the treatment of diabetic ulcers, and cell-sheet engineering has improved the efficacy of cell transplantation. A number of reports have suggested that adipose-derived stem cells (ASCs), a type of mesenchymal stromal cell (MSC), exhibit therapeutic potential due to their relative abundance in adipose tissue and their accessibility for collection when compared to MSCs from other tissues. Therefore, ASCs appear to be a good source of stem cells for therapeutic use. In this study, ASC sheets from the epididymal adipose fat of normal Lewis rats were successfully created using temperature-responsive culture dishes and normal culture medium containing ascorbic acid. The ASC sheets were transplanted into Zucker diabetic fatty (ZDF) rats, a rat model of type 2 diabetes and obesity, that exhibit diminished wound healing. A wound was created on the posterior cranial surface, ASC sheets were transplanted into the wound, and a bilayer artificial skin was used to cover the sheets. ZDF rats that received ASC sheets had better wound healing than ZDF rats without the transplantation of ASC sheets. This approach was limited because ASC sheets are sensitive to dry conditions, requiring the maintenance of a moist wound environment. Therefore, artificial skin was used to cover the ASC sheet to prevent drying. The allogenic transplantation of ASC sheets in combination with artificial skin might also be applicable to other intractable ulcers or burns, such as those observed with peripheral arterial disease and collagen disease, and might be administered to patients who are undernourished or are using steroids. Thus, this treatment might be the first step towards improving the therapeutic options for diabetic wound healing.

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Adipose-derived stem cells (ASCs) are easily isolated and harvested from the fat of normal rats. ASC sheets can be created using cell-sheet engineering and can be transplanted into Zucker diabetic fatty rats exhibiting full-thickness skin defects with exposed bone and then covered with a bilayer of artificial skin.

Criação e transplante de uma folha de células-tronco adiposo-derivado (ASC) em um modelo de cicatrização de feridas diabética

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is often capped with biocompatible materials in order to expedite pulpal wound healing. The ultimate goal is to regenerate reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" and protects the underlying pulp tissue. Although this direct pulp-capping procedure has long been used in dentistry, the underlying molecular mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is still poorly understood. To induce reparative dentin, pulp capping has been performed experimentally in large animals, but less so in mice, presumably due to their small sizes and the ensuing technical difficulties. Here, we present a detailed, step-by-step method of performing a pulp-capping procedure in mice, including the preparation of a Class-I-like cavity, the placement of pulp-capping materials, and the restoration procedure using dental composite. Our pulp-capping mouse model will be instrumental in investigating the fundamental molecular mechanisms of pulpal wound healing in the context of reparative dentin in vivo by enabling the use of transgenic or knockout mice that are widely available in the research community.

We describe a step-by-step method of performing direct pulp capping on mice teeth for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo.

Desenvolvimento de um Modelo-capeamento pulpar direto para a Avaliação dos pulpar cicatrização de feridas e Formação reparadora dentina em Ratos

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to injury. In fact, the most common type of eye injury found in clinic is a corneal abrasion. Here, we utilize an ocular burr to induce an abrasion resulting in removal of the corneal epithelium in vivo on anesthetized mice. This method allows for targeted and reproducible epithelial disruption, leaving other areas intact. In addition, we describe the visualization of the abraded epithelium with fluorescein staining and provide concrete advice on how to visualize the abraded cornea. Then, we follow the timeline of wound healing 0, 18, and 72 h after abrasion, until the wound is re-epithelialized. The epithelial abrasion model of corneal injury is ideal for studies on epithelial cell proliferation, migration and re-epithelialization of the corneal layers. However, this method is not optimal to study stromal activation during wound healing, because the ocular burr does not penetrate to the stromal cell layers. This method is also suitable for clinical applications, for example, pre-clinical test of drug effectiveness.

This protocol describes a method to inflict an abrasion to the ocular surface of the mouse, and to follow the wound healing process thereafter. The protocol takes advantage of an ocular burr to partially remove the surface epithelium of the eye in anaesthetized mice.

Cicatrização de feridas abrasão epitelial da córnea com Burr Ocular como um modelo para córnea

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.

Ex Vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the lower extremities, hyperhidrosis, etc. It is commonly practiced to position the puncture needle tip in front of the anterior fascia of the psoas major muscle and inject the inactivating agent around the sympathetic trunk, which is defined as conventional CLS. Although relatively rare, ureteropelvic damage is the most frequently reported complication of conventional CLS and can cause serious harm to patients. We found that injecting the inactivating agent behind the anterior fascia, which only targets gray rami communicantes, helped achieve therapeutic efficacy in&#160;vasodilation, sweat reduction, and pain relief comparable to conventional CLS, and serious complications were largely reduced. We define this procedure as selective CLS. Here, we present a protocol of selective CLS. The precise needle tract and accurate evaluation of the spreading of the contrast agent are critical to ensure that the drug is injected behind the anterior fascia of the psoas major muscle. The needle tip is at approximately one-third the dividing line of the vertebral body in the lateral view of a lumbar X-ray. The contrast is mainly confined around the needle tip and spreads outward and downward along the psoas muscle fibers. In this way, the anterior fascia provides a natural barrier for the ureteropelvic area, and the psoas major muscle provides a natural barrier for the lumbar nerve root. There are several highlights of this article, including 1) a detailed description of the selective CLS procedures, 2) an explanation of the anatomical basis for the implementation of selective CLS, and 3) an explanation of the differences between selective and conventional CLS.

We present a protocol for selective chemical lumbar sympathectomy (CLS), which inactivates only gray rami communicantes and not the sympathetic trunk. Selective CLS can help achieve therapeutic efficacy in vasodilation, sweat reduction, and pain relief that are comparable to conventional CLS, and serious complications, particularly ureteropelvic damages, can be reduced.

Direcionamento de Rami cinza Communicantes em simpatectomia lombar química seletiva

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the ...

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

Ensaio de migração de riscos e câmara de dobras cutâneas dorsal para análise in vitro e in vivo da cicatrização de feridas

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...