カイサ Ikkala 中央研究質問への実装中に後でだけでなく、彼女の貴重な技術支援と洞察力に富んだヘルプこのメソッドを実現するときのために感謝したいと思います。獣医の仕事のガイドラインの計画に彼女の助けのため実験動物センターとアンナ Meller に感謝したいと思いますも。

すべての実験は、全国の動物実験委員会によって承認されています。
1. 準備
<ol><li>すべてのソリューションを準備し、特記されない場合はで部屋の温度を維持します。Dispose が使用される材料およびソリューション廃棄物規則に従ってください。</li>
	<li>使用当所と ICR ザイモグラム株、どちらかの性別と年齢 4-12 週の間。C57BL/6 株を使用している場合手順 1.3.2 でケタミン-メデトミジン調製法に従ってください。その他の手順については、1.3.3.-1.3.5 に記載されている指示に従います。</li>
	<li>新鮮で時間操作を開始する前に、獣医学を準備します。カルプロフェンは後で使用される、従ってこの時点でそれを準備する必要はありません。<ol>
<li>麻酔のケタミン-メデトミジンのソリューションを準備をするミックス 0.375 mL (濃度をストック 50 mg/mL) 0.25 ml (Ketaminol 獣医) ケタミンの (ストック濃度 1 mg/mL) メデトミジン (Cepetor 獣医) の滅菌 0.9 %1.25 mL を加えると塩化ナトリウム。0.15 mL/20 g のマウス重量 (7.5 mg/kg、ケタミン、メデトミジン 1 mg/kg) を管理します。</li>
		<li>C57bl/6 マウスの麻酔のケタミン-メデトミジンのより希薄溶液を準備をするミックス 0.375 mL (濃度をストック 50 mg/mL) 0.25 mL とケタミンの (ストック濃度 1 mg/mL) メデトミジンの滅菌の 0.9% の 2.5 mL を加えると塩化ナトリウム。0.15 mL/20 g のマウス重量 (3.75 mg/kg、ケタミン、メデトミジン 0.5 mg/kg) を管理します。 注: これは大人 c57bl/6 マウスの唯一の代替手順です。</li>
		<li>鎮痛のため buprenorfin を準備するには、0.1 mL を追加 (ストック濃度 0.3 mg/mL) 1.9 mL 滅菌の 0.9% に buprenorfin の塩化ナトリウム。0.2 mL/20 g のマウスの重量 (0.15 mg/kg) を管理します。</li>
		<li>麻酔を中止のアチパメゾールを準備するには、0.1 mL を追加 (ストック濃度 5 mg/mL) の 0.9 %4.9 mL に対するアチパメゾールの塩化ナトリウム。0.15 mL/20 g のマウスの重量 (0.75 mg/kg) を管理します。</li>
		<li>鎮痛後麻酔中カルプロフェンを使用します。0.1 mL を追加 (ストック濃度 50 mg/mL) カルプロフェン 0.9 %4.9 ml の塩化ナトリウム。0.15 mL/20 g のマウス重量 (7.5 mg/kg) を管理します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蛍光染色液を準備します。<ol>
<li>コバルト ブルーの光 (図 1) の下で耐摩耗性を可視化する蛍光ソリューションを使用します。微細なスケールとフルオレセイン塩の最初の測定 10 mg 0.1% フルオレセイン液を準備し、リン酸緩衝生理食塩水液 (PBS) で 10 mL に追加します。</li>
		<li>フルオレセイン溶液の光から保護、シェーカーで 5 分間振る。 注: フルオレセイン ソリューションは、光に敏感な;光からカバー ソリューションをしてください。このソリューションは、2 ~ 3 日は +4 ° C に格納できます。用では、点眼薬に使用されるスポイト ボトルにフルオレセイン ソリューションを配置することをお勧めします。ドロッパー ボトルにソリューションを移動するときは、滅菌フィルターを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>前に、と使用後に眼のバリのヒントをきれいまず PBS とし、70 %etoh。場合同じ操作中にいくつかのマウスにキズを作って、各マウスのクリーニングの手順を行います。</li>
	<li>(37 ° C) の温水プレートを入れて、ペーパー タオルを置きます。</li>
</ol>2. 角膜上皮剥離
注意: とき防護服 (白衣、手袋) を使用してマウスを処理します。管理する薬の量を見積もるには、マウスの重量を量る。
<ol><li>片手スクラッフィング メソッドを使用して、マウス23を処理します。ケタミン-メデトミジン混合物を腹腔内管理 (i. p.) 左下腹部に。個々 のケージにマウスを置くし、眠りに落ちるを待ちます。これは通常 5 分未満がかかります。その後、最初の buprenorfin をクリックし、i. p. 注射を介してアチパメゾールを管理します。同じ処理テクニックを使用します。 注: 麻酔を指定すると、プロトコル必要があります一時停止できません任意の時点で。</li>
	<li>前に、加熱面が暖かいことを確認します。加熱平板上麻酔下のマウスを置きます。尾反射はつま先反射が存在が不在の場合は、麻酔のレベルをお勧めします。尾と、つま先の指または鉗子でつまんでこれらの反射を確認します。過度の力を使用しないでください。麻酔は、最後の 20-25 分です。</li>
	<li>キズをするためには、洗浄の眼のはりを使用します。摩耗させる振動をオンにするバリのベースを回転させます。バリが正しく機能しているとき、手に振動を感じる。<ol>
<li>別に指でまぶたを保持することによって一度に 1 つ目を開いています。その後しっかりとギザギザが角膜に触れるし、眼表面の楽器同様、前後の移動は横に限り。バリ振動はゼロ; を実行します。押して、振るか角膜を引き裂きます。角膜中央部 20 研磨表面の動きが傷を誘導するために十分です。バリを持ち上げ、磨耗する角膜の領域に滞在してください。標準サイズの摩耗を取得いくつかのラウンド練習が必要になります。</li>
	</ol>
 注: 角膜無菌は、betadine 点眼液を使用して摩耗する前に達成することができます。</li>
</ol>3. 摩耗のイメージング
<ol><li>コバルト ブルーのペンライト (図 1) とフルオレセインのソリューションを使用して研磨領域を照らします。眼の表面は周囲の光で無色の表示されます。フルオレセイン アプリケーション後研磨領域蛍光を発する緑色の光ペンで目を照らすとき。<ol>
<li>必要な場合、2.3 同様に研磨目を開き、ドロッパー ボトルからフルオレセイン液の一滴を管理します。PBS または 0.9% 回、目を洗う、フルオレセインの背景を減らすために、NaCl。洗浄用スポイト ボトルやピペットを使用します。ソフトのワイプで液体を離れて吸い出しなさいし、に応じて、まつげの汚れを落としてください。余分な液体は通常涙運河の開口部の近くに、目の鼻側の境界に収集します。 注意: は、マイナーな擦り傷が誘発されるかもしれないと cleaining、角膜に触れることを避けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>角膜上皮剥離の写真を撮る。<ol>
<li>各撮像セッション中に類似画像を取得するには、コバルト ブルーのペンライトと一眼レフ カメラ (図 2) の安定した添付ファイルのツールを使用します。このプロトコルは、(図 2) を繰り返しやすいセットアップを提供します。<ol>
<li>ペン ライトとカメラを添付するには、テーブル ランプ フレキシブル アームとクランプ調整可能なカメラの腕と、クランプでそれぞれ使用します。ケーブルタイ テーブル ランプとマウスの目のすぐ上の位置に光のペン。光を異なる位置決め、耐摩耗性の可視化を変更可能性があります。これらのツールを位置決めのための提案は、図 2で説明します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>目の写真を撮るための一眼レフ カメラを使用します。部屋の光に必要な距離と位置とフォーカス カメラ (1:12) に動物を配置します。その後、コバルト ブルーのペンライトを除く他のすべてのライトを閉じます。 注: をペン ライト ハンドルをテープまたはイメージ投射の間のすべての時間にライトを保つためにゴムバンドを使用します。これは、画像が不鮮明になる場合に役立つかもしれない。同僚とイメージング手順を実行する簡単です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 角膜上皮剥離後に目覚める
<ol><li>最初 buprenorfin し、i. p. 注射を介してアチパメゾールを管理します。2.1 と同じ処理方法を使用します。</li>
	<li>抗菌、フシジン酸酸眼軟膏 (Isathal) に潤いと麻酔後細菌からきれいな眼の表面を保つすりむいたと非摩耗の目に一滴を配置します。</li>
	<li>マウスは 5 ~ 20 分加熱平板上で美味しいが、麻酔後のウェイク アップ期間中にマウスを観察します。モバイルになれば、個々 のケージに配置します。 注: 目を覚ます時間がかかります、加熱パッドで檻の中にマウスを置くをクリックするか、または加熱平板上全体のケージに配置、マウスを定期的に監視します。麻酔が身に着けている間、マウスは通常振るし、体前葉と上向きに達する。この現象は、3-4 時間で正常に返す必要があります、共有ケージに戻るマウスをいただくことができます。</li>
	<li>手順 2.2 同様、摩耗後 2 日連続で鎮痛・眼軟膏のカルプロフェン i. p. を管理します。4.2 と。</li>
</ol>5. 創傷治癒過程におけるイメージング
<ol><li>このプロトコルで使用時間は、傷の閉鎖を観察する摩耗後の 18 h、72 h を指します。<ol>
<li>連続イメージング 2.2 で説明したように、マウスを麻酔します。</li>
		<li>3 で説明したように、写真を撮る。</li>
		<li>アチパメゾール i. p. を持つ動物を覚ます、4.3 で説明したように、ウェイク アップ期間を監視します。 注: いない場合はフォロー アップを継続、5.1.2 の直後にマウスを安楽死させます。安楽死は、6.1 で説明されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 角膜コレクションとパラフィン包埋
<ol><li>最後の時間以降は、動物を犠牲に。CO2を満たすことができるチャンバーにマウスを配置します。CO でチャンバー内の空気を埋める2.動物、モバイル、尾の根元からしっかりと引っ張ってくると同時に頸部を押し、頸椎を脱臼します。 注意: 常に動物愛護の体のガイドラインに従ってください。</li>
	<li>目の側に解剖はさみで皮膚の開口部を切断することによって全体の眼球を収集します。眼球の下ではさみを置き、軌道から目玉をポップに眼神経をカットします。目は簡単に出ない場合は、鉗子を使用します。<ol>
<li>眼の中のソリューションの無料浸透を許可する 26 G 針で網膜側で、目の後ろの穴を作る。 注: は、乾燥の代わりになる、プロトコルを続行まで PBS に目をさせてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS で 2 mL チューブに眼球を収集します。この時点で実験を一時停止しません。</li>
	<li>PBS を削除し、4 ~ 5 時間 +4 ° C で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で眼球を修正します。</li>
	<li>組織カセット ティッシュの処理のために固定の眼球を移動します。組織の加工機械と次のプログラムを使用します。<ol>
<li>PBS で洗い。</li>
		<li>2 x 45 分 70% エタノール室温で孵化させなさい。</li>
		<li>2 x 1 h 94% エタノール室温で孵化させなさい。</li>
		<li>室温での無水エタノールで 3 x 45 分を孵化させなさい。</li>
		<li>常温、37 ° C で最後キシレン キシレンの 3 x 1 h を孵化させなさい</li>
		<li>60 ° C でパラフィン ワックスで 3 × 1 h を孵化させなさい</li>
	</ol>
</li>
	<li>処理組織後、眼球に埋め込む組織埋め込みブロックを使用した流動パラフィン (+ 60 の ° C)。ブロック内目を置き、それが横にいると周辺の境界線上を向いています。クール プレートに 5-10 分を固めるブロックができます。</li>
</ol>7. 角膜のパラフィン切片
<ol><li>機関のまたは製造元の指示に従って断面のミクロトームを準備します。 注意: は、シャープのミクロトーム刃を処理するとき注意してください。</li>
	<li>ミクロトームの横にある室内温純水と場所 1 浴と別超純水 +50 ° C に加熱</li>
	<li>眼球の 5 μ m 厚いセクションを確認します。 注: 断面中に簡単にレンズ改。これを避けるためには、セクションの新しい行を起動するたびに湿った組織切削の表面を拭いてください。ティッシュを湿らせて、水道水を使用します。</li>
	<li>室温水お風呂で互いに横にセクションを配置し、スライド グラスの助けを借りてお湯のお風呂に移動します。湯浴まですべてしわリラックスおよびセクションになるマット内のセクションをストレッチします。</li>
	<li>37 ° C で一晩のセクションのスライド ガラスを乾燥します。</li>
	<li>+60 ° C で加熱平板上 1 分スライドを維持することでセクションをスライドに添付します。この後、セクションことができます直接処理染色、免疫組織学的手法や +4 ° C で保存</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+tight+junctions+and+their+response+to+lipopolysaccharide+challenge.">Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).</li><li>Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZO-1+In+Corneal+Epithelium;+Stratal+Distribution+and+Synthesis+Induction+by+Outer+Cell+Removal.">ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal.</a> Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).</li><li>Sugrue, S. P., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZO1+in+Corneal+Epithelium:+Association+to+the+Zonula+Occludens+and+Adherens+Junctions.">ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions.</a> Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).</li><li>Jackson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+eye-pads+on+healing+of+simple+corneal+abrasions.">Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions.</a> British Medical Journal. 2 (5200), 713 (1960).</li><li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals.">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).</li><li>Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1++Progenitor+Cell+Dynamics+in+Murine+Cornea+During+Homeostasis+and+Wound+Healing.">Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing.</a> Stem Cells. , (2018).</li><li>Nasser, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal-Committed+Cells+Restore+the+Stem+Cell+Pool+and+Tissue+Boundary+following+Injury.">Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury.</a> Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).</li><li>Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA2/Ephrin-A1+Signaling+Complexes+Restrict+Corneal+Epithelial+Cell+Migration.">EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (2), 936 (2012).</li><li>Bai, J. -. Q., Qin, H. -. F., Zhao, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+on+mouse+model+of+grade+II+corneal+alkali+burn.">Research on mouse model of grade II corneal alkali burn.</a> International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).</li><li>Chan, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+matrix+metalloproteinase-12+following+corneal+injury.">Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury.</a> Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).</li><li>Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+is+necessary+for+epithelial+recruitment+of+gammadelta+T+cells+and+efficient+corneal+wound+healing.">ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing.</a> American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).</li><li>Amitai-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Lineage+Tracing+of+Corneal+Cells+Using+Multi-color+Fluorescent+Reporter+Mice.">A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).</li><li>Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+Tracing+of+Stem+and+Progenitor+Cells+of+the+Murine+Corneal+Epithelium.">Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium.</a> Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).</li><li>Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;V&#946;6+Integrin+Promotes+Corneal+Wound+Healing.">&#945;V&#946;6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 52 (11), 8505 (2011).</li><li>Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Thrombospondin-1+in+Repair+of+Penetrating+Corneal+Wounds.">Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (9), 6262 (2013).</li><li>Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+sheet+movement:+Protein+and+glycoprotein+synthesis.">Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis.</a> Developmental Biology. 92 (1), 259-262 (1982).</li><li>Danjo, Y., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+&amp;#34;purse+string&amp;#34;+filaments+are+anchored+by+E-cadherin-mediated+adherens+junctions+at+the+leading+edge+of+the+epithelial+wound,+providing+coordinated+cell+movement.">Actin &amp;#34;purse string&amp;#34; filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement.</a> Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).</li><li>Lyu, J., Joo, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt-7a+up-regulates+matrix+metalloproteinase-12+expression+and+promotes+cell+proliferation+in+corneal+epithelial+cells+during+wound+healing.">Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).</li><li>Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBP485+promotes+corneal+epithelial+wound+healing.">JBP485 promotes corneal epithelial wound healing.</a> Science Reports. 5, 14776 (2015).</li><li>Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+beta+4+integrin+expression+and+localization+in+vivo+in+response+to+corneal+epithelial+injury.">Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).</li><li>Stepp, M. A., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+alpha+9+integrin+and+tenascin+during+epithelial+regeneration+after+debridement+in+the+cornea.">Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).</li><li>Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BALB/c+and+C57BL6+mouse+strains+vary+in+their+ability+to+heal+corneal+epithelial+debridement+wounds.">BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds.</a> Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).</li><li>. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques Available from: <a target="_blank" href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques">https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques</a> (2018)</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing.">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).</li><li>Suzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+and+cell-cell+interactions+during+corneal+epithelial+wound+healing.">Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).</li><li>Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+differences+between+FVB+and+C57BL/6+mice+affect+hypnotic+susceptibility+to+pentobarbital,+ketamine+and+nitrous+oxide,+but+not+isoflurane.">Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).</li><li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K14+++Compound+niches+are+present+on+the+mouse+cornea+early+after+birth+and+expand+after+debridement+wounds.">K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds.</a> Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).</li><li>Boote, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Assessment+of+Ultrastructure+and+Light+Scatter+in+Mouse+Corneal+Debridement+Wounds.">Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).</li><li>Pal-Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP9+cleavage+of+the+&#946;4+integrin+ectodomain+leads+to+recurrent+epithelial+erosions+in+mice.">MMP9 cleavage of the &#946;4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions:+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease.">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

負傷メソッドは、角膜の恒常性と病態のさまざまな側面を研究するための人気のあるツールです。耐摩耗性モデルでは、眼科に関連する問題に対処するため、よく制御された方法を提供しています。ただし、プロトコルの特定の重要なポイントは強調する価値が。特に、獣医、創傷治癒のタイムライン、および結果について説明詳細はザイモグラム技研や ICR 株式での使用に最適化されたが、マウス26系統の間で異なる場合があります。このプロトコルでは、約 20 分間、実験動物を麻酔残ります。これは、摩耗を実行する時間の短いが十分なウィンドウです。しかし、眼のはりを使用している場合、非常に高速な操作耐摩耗性自体を作る、このタイム フレームで実行できる必要があります。
簡単かつアクセス可能な可視化は、摩耗モデルの主な利点の 1 つです。分子生物学の方法と組み合わせると、これはすばらしい細部で上皮細胞研究への可能性を開きます。すりむいた角膜の組織学的や免疫学的染色の処理され、蛋白質または核酸が収集し、さらに検討します。Pajoohesh がんじらは、角膜上皮細胞変化が鈍く刃27角膜侮辱でその遺伝子発現パターンを示した。制御のサンプリングが確実、サンプル コレクション計画タイムライン正確に従ってくださいし、擦り傷の画像は、操作後すぐに撮影をお勧めします。
このプロトコルは、角膜上皮形成の検討を越えて使用してをいます。たとえば、幹細胞ダイナミクス7を勉強する角膜角膜、角膜の幹細胞ニッチの摩耗を使えます。示した非摩耗部上皮が治癒過程における通常のまま、しかし何人かの著者は基底膜と基になる間質の実質細胞、眼を受けますが24,28をバリを主張します。基底膜の除去は、特定の基底膜染色で推定できます。さらに、長いタイムライン上の繰り返しの擦り傷は、癒しの興味深いパターンを明らかにすること。このプロトコルでは長期的な追跡を上皮の建築は見られなかった。メスが鈍く両方と眼はり傷害傷害24,29,30後数週間後角膜びらんに発生率の増加が示されています。これは、長期的な研究のため耐摩耗性モデルを使用する場合心に留めておか必要があります。しかし、角膜びらんに着目した研究に便利このプロトコルです。
他の人が負傷したモデルは、レビュー5Steppらによって長さで記述されます。このプロトコルと既存のアプローチを組み合わせることで、多彩なオプションで実用的な臨床的な問題と同様、両方の基本的な生物学的質問を調べる。

多くの器官の上皮層は、傷害にさらされています。ただし、創傷治癒過程での組織の損失を賠償する能力も含まれます。角膜創傷治癒研究に優秀なモデルを提供しています。それは眼の外部表面を形作り、敏感な眼機械の保護レイヤーを提供します。したがって、角膜は、病原体や水の損失に物理的な障壁として機能します。3 つの層から成り立っています上皮、実質、内皮細胞。角膜の上皮は角膜の最も外側の層になります。上皮細胞は互いにタイトな接合1,2,3を厳密に遵守することで角膜のバリア機能を維持します。無細胞性角膜基底膜、ボーマン膜は、難治性の実質細胞が含まれている広範な間質から上皮を分離します。実質の下で血管内皮細胞チャネル栄養素、水、および上位層への酸素。
角膜の傷、クリニック4で非常に一般的です。角膜への傷害は様々 で、主にほこりや砂、傷、または他の異物のような小さな粒子によって引き起こされます。プロトコルは、角膜上皮の摩耗、臨床的に関連するタイプを再現するために目的を紹介します。そうでは、このプロトコルは、臨床医や角膜科学者が独自の研究で実装するため制御し、精液メソッドを提供します。鈍く眼バリ、Algerbrush II と組織を研磨し、マウス角膜の体内の損傷修復アッセイを行った。ここでは、ターゲット中心部の角膜上皮にのみ耐摩耗と損傷することがなく器官の他の部分を残して。したがって、移行、増殖と分化体内5のセル プロトコルは再上皮化時に研究角膜上皮細胞や基底膜に最適です。最近では、このモデルは、前駆細胞の動態解析けが6、7の後角膜上皮幹細胞ニッチを再確立する差別化された角膜上皮細胞の容量を発表するだけでなくマウス角膜を分析に使用されました。次の摩耗、角膜はその通常の透明性、引張強さに返します。興味深いことに、その再上皮化が細胞増殖8なし発生する生体外で研究が示されます。このプロトコルでは、マウスの角膜で中断のない癒しのタイムラインについて説明します。したがって、メソッドは癒しのパターンと速度で薬の効果をテストする適用です。
角膜は、創傷治癒の研究に広く使用されています。しかし、多くの研究は、傷害の他のモデルに依存しています。9角膜表面にフィルター ペーパーの有無、角膜損傷の確立モデルは水酸化ナトリウム (NaOH) を適用することによって実行されるアルカリ火傷です。角膜の上皮だけでなく、結膜と実質9,10に影響大とびまん性損傷でアルカリ暴露します。強いアルカリ液は血管新生9混濁、角膜潰瘍を誘発する示されています。炎症細胞は、通常 6 時間以内実質に侵入し、24 h11までそこに残る。したがって、アルカリ外傷は間質の活性化に関連する研究のことをお勧め方法です。化学傷害の別のタイプは、角膜9,10ジメチルスルホキシド (DMSO) を適用することによって加えることができます。他の一般的に使用される傷害モデル、実質14,15の上の部分に制限されて実質と角膜切除の傷を貫通切開創の傷があります。これらのメソッドは、間質の創傷治癒に関する質問に回答もな。異なった傷害モデルには、独自の長所と短所があります。摩耗、または角膜の上皮のデブリードマンは最初鈍くメスやブレードを使用して前のヴィヴォ角膜16に開発されました。このメソッドは、使用される生体内でマウス、ラット、ウサギ17,18,19,20,21,22後されています。眼のはり (図 1) を使用して、我々 上皮の残りの部分は影響を受けないまま、上皮の選択した領域のみを削除します。このように、角膜のさまざまな部分に上皮の除去を細かく指定することが可能です。さらに、摩耗のサイズは、フルオレセイン染色と評価できます。さらに、ここで我々 は治癒期間中摩耗閉鎖を従います。
このメソッドは、いくつかの利点をもたらす、i) 化学損傷では不可能です、耐摩耗のサイトの正確な位置を含む ii) 耐摩耗性を実行するクイック、iii) 非侵襲的です。ここで、しかし、これはラット、ウサギ、ヒトの角膜障害を研究するために使用の一般的なモデルであるだけでなく遺伝的マウスモデルの広大な配列に適用される可能性がモデルとしてザイモグラムの当所のマウスを使用して方法を述べる.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NMRI mouse</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>use sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Vetmedic</td>
			<td>Vnr087896</td>
			<td>Market name: Cepetor Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>Vnr511485</td>
			<td>Market name: Ketaminol Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorfin</td>
			<td>Invidior</td>
			<td>3015248</td>
			<td>Market name: Temgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezol</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>Vnr471953</td>
			<td>Market name: Antisedan Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>Vnr027579</td>
			<td>Market name: Norocarp Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% fucidin acid eye ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>Vnr080899</td>
			<td>Market name: Isathal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)</td>
			<td>Algerbrush</td>
			<td>6.39768E+11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt Blue pen light</td>
			<td>SP Services</td>
			<td>DE/003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Kunz Instruments</td>
			<td>2007-0217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital SLR camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable camera arm and clamp</td>
			<td>Neewer</td>
			<td>10086132</td>
			<td>Height 28 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table lamp with a flexible arm and a clamp</td>
			<td>Prisma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft wipe</td>
			<td>KimtechScience</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection toolset</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needles</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue casette</td>
			<td>Sakura Finetech</td>
			<td>4118F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing machine ASP200S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>UN1307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>K95523361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm</td>
			<td>Sakura Finetech</td>
			<td>4123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm</td>
			<td>HM355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for sectioning</td>
			<td>Orthex</td>
			<td>60591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for sectioning</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>S35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Th.Geyer GmbH &#38; Co.</td>
			<td>7,695,019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MPGP04001</td>
			<td>MilliQ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing

マウス角膜創傷治癒研究に優秀なモデルを提供します。角膜は、目の最も外側の層となる傷害に最初の防衛.実際には、クリニックの目傷害の最も一般的なタイプは角膜上皮剥離です。ここでは、角膜上皮、体内麻酔下マウスの除去、摩耗を誘発する眼バリを利用します。このメソッドは、ターゲットで再現可能な上皮の中断、その他の部分をそのままにできます。また、フルオレセイン染色とすりむいた上皮の可視化を記述する、すりむいた角膜を視覚化する方法について具体的なアドバイスを提供しています。創傷治癒の 0、18、および 72 時間後摩耗、傷は再 epithelialized までのタイムラインを従います。角膜損傷の上皮摩耗モデルは、上皮細胞の増殖, 移行および角膜の層の再上皮化に関する研究に最適です。ただし、このメソッドは眼のバリが間質細胞の層に浸透していないため創傷が治癒過程における間質の活性化を研究するが最適ではありません。このメソッドは、薬の効果の前臨床試験などの臨床応用に適しています。

このプロトコルは、マウス角膜への摩耗損傷を負わせるモデルについて説明し、従うし、摩耗後の癒しのプロセスを視覚化する方法を示唆しています。最近では、創傷治癒の6中に角膜上皮幹細胞の役割を研究するこのメソッドを採用しました。確立されたツールの使用は正常な摩耗実験への鍵です。我々 などは、擦り傷6,7,24を実行するのに Algerbrush II 眼はり (図 1) を使用しています。このツールは、離れてドリルや角膜上皮の鋏ではなくブラシ サイズで 0.5 mm の鈍くバリ先端をあります。したがって、このツールは角膜の摩耗損傷として推奨される選択であります。
このモデルの中央部分には影響を受ける地域が任意の間隔で簡単に視覚化できます。図 3 a、フルオレセイン染色コバルト ブルー光源摩耗サイトを表示する (図 1) との組み合わせでの使用を提案します。この実験で行った大規模な角膜中央部に傷や周辺の角膜がそのまま (図 3 a) を左します。さらに、各マウスの左目のみを磨耗し、非磨耗コントロールとして右、二国間の目を維持します。二国間目サンプルは残った彼らはない実験中の任意のセル損失を受ける、したがってコントロールのサンプルとしても機能を示唆している蛍光信号の負。ただし、目のボーダーで緑色の信号はジャンクション目とまぶたの間に蓄積されたフルオレセイン ソリューションを表示しました。(図 3 a) 傷害の直後の 0 h で磨耗が大きかった。18 h 後著しく小さかったし、この場合、目の上部のボーダーの近くに位置します。ただし、上皮は、摩耗のすべての辺から等しい速度で露出した領域を閉じます。特に、72 h が負傷後に緑色の信号も表示でした。これは、角膜上皮が完全に再 epithelialized 72 h で磨耗後ことを示します。
このメソッドを使用を目指した中心に角膜上皮にのみ耐摩耗性角膜の深い層がそのまま残っているので。角膜上皮の除去は、図 3Bの組織切片から明らかだった。0 h、摩耗の端は通常、4-5 セル層厚い角膜上皮から連続しています狭い、無細胞棚として表示されます。角膜は、角膜上皮の境界は、ない全体実験タイムライン (72 h) 中に摩耗による影響を受けた例領域が表示されます。さらに、角膜、間質、血管内皮細胞の深い層が眼のはりによって害されていない組織切片が示されます。これらの 2 つの組織はすりむいたと二国間目のサンプルで同じような出現。受傷後 18 h で癒しのプロセスがアクティブと再上皮化が進行中。これはリーディング エッジの出現によって示唆されました。リーディング エッジに 1-2 上皮細胞層のみが含まれています、再階層化することができます25を発生する前に、それは露出地域をカバーします。図 3 aの成果を踏まえた表面は完全に再 epithelialized 72 h で移行する面は、傷を覆っていたし、すべての上皮層も存在していた。二国間の目から組織切片を確認 (図 3 a) コントロール目が観察期間中にそのまま残った。
最後に、我々 は摩耗モデルが角膜上皮に限定され、血管新生などの傷害に間質反応を呼び出しませんこと証拠を提供します。図 4は、摩耗後 18 時間でマウス角膜を示します。巨視的な見方に基づいて、この時点でポイントに私達のプロトコルが角膜深層は中断されないことを示すため、間質反応が表示されませんでした。比較では、0.75 mol/L 水酸化ナトリウムをアルカリ外傷はすぐに間質の血管新生を誘導します。アルカリ外傷で急激な血管新生を与え、本手法では時間ポイントは間質の反応の可能性を排除するための証拠を提供します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58071/58071fig1.jpg"> 図 1: 角膜上皮の摩耗のための不可欠なツールです。左は振動眼バリです。右にあるコバルト ブルーのペンライトを使用して表示のフルオレセイン染色。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58071/58071fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58071/58071fig2.jpg"> 図 2: 角膜の擦過傷をイメージングします。(A)イメージングのためのツールは、クランプ (左)、一眼レフ カメラ (センター) テーブル ランプとフレキシブル アーム付きの調整可能なカメラ アーム クランプ (右)。コバルト ブルーのペンライトは、2 つのケーブルタイでランプのドームに結びついています。(B)画像のセットアップの一般的なビュー各添付ファイル ツールの距離は cm のイメージでマークされます。両方のクランプは、熱板から 6 cm、マウスは熱プレートの端から 10 cm が配置されます。(C)提案された距離と cm でマウスの目に位置摩耗イメージングを詳しく見て<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58071/58071fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58071/58071fig3.jpg"> 図 3: 検出および角膜上皮剥離のローカリゼーション。(A)マウスの目 0、18、および摩耗後 72 時間で。フルオレセイン信号は、上皮の他のすべての地域は暗いままに対し明るい緑色ですりむいた領域をマークします。二国間目はコントロールとして機能します。破線は傷の境界をマークし、それぞれの目の白い点は、カメラからの反射。(B)は組織切片・ ヘマトキシリンとエオシン摩耗後 0、18、および 72 h でマウスの目のサンプルをステンド グラスします。角膜は、すべての側面から角膜上皮を囲む境界線です。アステリックスは、摩耗の端をマークします。スケール バーは 100 μ m.<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58071/58071fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58071/58071fig4.jpg"> 図 4: 角膜上皮剥離に間質反応がアクティブ化いません。0.75 mol/L 水酸化ナトリウム 0.9% と灌水区でアルカリ露出 NaCl 角膜血管新生 (治療後すぐに収集の目) が生成されます。18 h 摩耗サイトは点線でマークされている後でさえも、眼のバリと摩耗は血管新生を示さない。スケール 1 mm バー<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58071/58071fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。

Watch this Scientific Journal Video about Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing at JoVE.com

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

角膜上皮摩耗眼はりのモデルとして角膜創傷治癒

このプロトコルでは、マウスの眼球の表面に耐摩耗性を与えるし、創傷の治癒過程をその後に従うメソッドについて説明します。ハイパーカプニア マウスで目の表面の上皮を部分的に削除する眼はりのプロトコルを活用します。

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

corneal-epithelial-abrasion-with-ocular-burr-as-model-for-cornea

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

20.2K ビュー.  University of Helsinki. このプロトコルでは、マウスの眼球の表面に耐摩耗性を与えるし、創傷の治癒過程をその後に従うメソッドについて説明します。ハイパーカプニア マウスで目の表面の上皮を部分的に削除する眼はりのプロトコルを活用します。

ビデオ: Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

血管新生研究のための角膜ポケットアッセイのマウスモデル

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

医学

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

創傷治癒のマウスモデル

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The etiology of IBD remains unknown and current therapeutic strategies are based on the unspecific suppression of the immune system. The development of treatments that specifically target intestinal inflammation and epithelial wound healing could significantly improve management of IBD, however this requires accurate detection of inflammatory changes. Currently, potential drug candidates are usually evaluated using animal models in vivo or with cell culture based techniques in vitro. Histological examination usually requires the cells or tissues of interest to be stained, which may alter the sample characteristics and furthermore, the interpretation of findings can vary by investigator expertise. Digital holographic microscopy (DHM), based on the detection of optical path length delay, allows stain-free quantitative phase contrast imaging. This allows the results to be directly correlated with absolute biophysical parameters. We demonstrate how measurement of changes in tissue density with DHM, based on refractive index measurement, can quantify inflammatory alterations, without staining, in different layers of colonic tissue specimens from mice and humans with colitis. Additionally, we demonstrate continuous multimodal label-free monitoring of epithelial wound healing in vitro, possible using DHM through the simple automated determination of the wounded area and simultaneous determination of morphological parameters such as dry mass and layer thickness of migrating cells. In conclusion, DHM represents a valuable, novel and quantitative tool for the assessment of intestinal inflammation with absolute values for parameters possible, simplified quantification of epithelial wound healing in vitro and therefore has high potential for translational diagnostic use.

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

デジタルホログラフィック顕微鏡とマルチモーダル定量位相イメージングは​​、正確に腸の炎症および上皮創傷治癒を評価します

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients with impeded blood flow or with large wounds might be prolonged. Cell-based therapies have appeared as a new technique for the treatment of diabetic ulcers, and cell-sheet engineering has improved the efficacy of cell transplantation. A number of reports have suggested that adipose-derived stem cells (ASCs), a type of mesenchymal stromal cell (MSC), exhibit therapeutic potential due to their relative abundance in adipose tissue and their accessibility for collection when compared to MSCs from other tissues. Therefore, ASCs appear to be a good source of stem cells for therapeutic use. In this study, ASC sheets from the epididymal adipose fat of normal Lewis rats were successfully created using temperature-responsive culture dishes and normal culture medium containing ascorbic acid. The ASC sheets were transplanted into Zucker diabetic fatty (ZDF) rats, a rat model of type 2 diabetes and obesity, that exhibit diminished wound healing. A wound was created on the posterior cranial surface, ASC sheets were transplanted into the wound, and a bilayer artificial skin was used to cover the sheets. ZDF rats that received ASC sheets had better wound healing than ZDF rats without the transplantation of ASC sheets. This approach was limited because ASC sheets are sensitive to dry conditions, requiring the maintenance of a moist wound environment. Therefore, artificial skin was used to cover the ASC sheet to prevent drying. The allogenic transplantation of ASC sheets in combination with artificial skin might also be applicable to other intractable ulcers or burns, such as those observed with peripheral arterial disease and collagen disease, and might be administered to patients who are undernourished or are using steroids. Thus, this treatment might be the first step towards improving the therapeutic options for diabetic wound healing.

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Adipose-derived stem cells (ASCs) are easily isolated and harvested from the fat of normal rats. ASC sheets can be created using cell-sheet engineering and can be transplanted into Zucker diabetic fatty rats exhibiting full-thickness skin defects with exposed bone and then covered with a bilayer of artificial skin.

作成および糖尿病創傷治癒モデルにおける脂肪由来幹細胞 (ASC) シートの移植

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is often capped with biocompatible materials in order to expedite pulpal wound healing. The ultimate goal is to regenerate reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" and protects the underlying pulp tissue. Although this direct pulp-capping procedure has long been used in dentistry, the underlying molecular mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is still poorly understood. To induce reparative dentin, pulp capping has been performed experimentally in large animals, but less so in mice, presumably due to their small sizes and the ensuing technical difficulties. Here, we present a detailed, step-by-step method of performing a pulp-capping procedure in mice, including the preparation of a Class-I-like cavity, the placement of pulp-capping materials, and the restoration procedure using dental composite. Our pulp-capping mouse model will be instrumental in investigating the fundamental molecular mechanisms of pulpal wound healing in the context of reparative dentin in vivo by enabling the use of transgenic or knockout mice that are widely available in the research community.

We describe a step-by-step method of performing direct pulp capping on mice teeth for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo.

歯髄の評価のための直接覆髄モデルの開発、創傷治癒およびマウスにおける修復象牙質形成

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

顕微鏡法によるIn Vitro創傷が治癒過程における上皮移行の評価

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.

前のヴィヴォ角膜器官培養モデルの創傷治癒の研究

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the lower extremities, hyperhidrosis, etc. It is commonly practiced to position the puncture needle tip in front of the anterior fascia of the psoas major muscle and inject the inactivating agent around the sympathetic trunk, which is defined as conventional CLS. Although relatively rare, ureteropelvic damage is the most frequently reported complication of conventional CLS and can cause serious harm to patients. We found that injecting the inactivating agent behind the anterior fascia, which only targets gray rami communicantes, helped achieve therapeutic efficacy in&#160;vasodilation, sweat reduction, and pain relief comparable to conventional CLS, and serious complications were largely reduced. We define this procedure as selective CLS. Here, we present a protocol of selective CLS. The precise needle tract and accurate evaluation of the spreading of the contrast agent are critical to ensure that the drug is injected behind the anterior fascia of the psoas major muscle. The needle tip is at approximately one-third the dividing line of the vertebral body in the lateral view of a lumbar X-ray. The contrast is mainly confined around the needle tip and spreads outward and downward along the psoas muscle fibers. In this way, the anterior fascia provides a natural barrier for the ureteropelvic area, and the psoas major muscle provides a natural barrier for the lumbar nerve root. There are several highlights of this article, including 1) a detailed description of the selective CLS procedures, 2) an explanation of the anatomical basis for the implementation of selective CLS, and 3) an explanation of the differences between selective and conventional CLS.

We present a protocol for selective chemical lumbar sympathectomy (CLS), which inactivates only gray rami communicantes and not the sympathetic trunk. Selective CLS can help achieve therapeutic efficacy in vasodilation, sweat reduction, and pain relief that are comparable to conventional CLS, and serious complications, particularly ureteropelvic damages, can be reduced.

ターゲット灰白交通枝選択的化学腰椎交感神経切除術で

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the ...

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for experimental investigations as they are normally needed for transplantation. Endothelial cell cultures often do not translate well to in vivo situations. Due to the biostructural characteristics of non-human corneas, stromal swelling during cultivation induces substantial corneal endothelial cell loss, which makes it difficult to perform cultivation for an extended period of time. Deswelling agents such as dextran are used to counteract this response. However, they also cause significant endothelial cell loss. Therefore, an ex vivo organ culture model not requiring deswelling agents was established. Pig eyes from a local slaughterhouse were used to prepare split corneal buttons. After partial corneal trephination, the outer layers of the cornea (epithelium, bowman layer, parts of the stroma) were removed. This significantly reduces corneal endothelial cell loss induced by massive stromal swelling and Descemet&#39;s membrane folding throughout longer cultivation periods and improves general preservation of the endothelial cell layer. Subsequent complete corneal trephination was followed by the removal of the split corneal button from the remaining eye bulb and cultivation. Endothelial cell density was assessed at follow-up times of up to 15 days after preparation (i.e., days 1, 8, 15) using light microscopy. The preparation technique used allows a better preservation of the endothelial cell layer enabled by less stromal tissue swelling, which results in slow and linear decline rates in split corneal buttons comparable to human donor corneas. As this standardized organo-typically cultivated research model for the first time allows a stable cultivation for at least two weeks, it is a valuable alternative to human donor corneas for future investigations of various external factors with regards to their effects on the corneal endothelium.

Here, a step-by-step protocol for the preparation and cultivation of porcine split corneal buttons is presented. As this organo-typically cultivated organ culture model shows cell death rates within 15 days, comparable to human donor corneas, it represents the first model allowing long-term cultivation of non-human corneas without adding toxic dextran.

分割角膜ボタンを用いてのブタ角膜内皮器培養モデル

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the optical breakdown at the laser focus. Acoustic shock waves and cavitation bubbles are generated, causing tissue rupture. Bubble sizes and pressure amplitudes vary with pulse energy and position of the focal point. In this study, enucleated porcine eyes were positioned in front of a commercially available Nd:YAG laser. Variable pulse energies as well as different positions of the focal spots posterior to the cornea were tested. Resulting lesions were evaluated by two-photon microscopy and histology to determine the best parameters for an exclusive detachment of corneal endothelial cells (CEC) with minimum collateral damage. The advantages of this method are the precise ablation of CEC, reduced collateral damage, and above all, the non-contact treatment.

Here, we present a protocol to detach corneal endothelial cells (CEC) from Descemet&#8217;s membrane (DM) using a neodymium:YAG (Nd:YAG) laser as an ex vivo disease model for bullous keratopathy (BK).

角膜内皮細胞損失の非侵襲的レーザー支援実験モデルの開発

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...