プライマー デザインのため神ハリス、アシュリー McKibbon と撮影、ジェシカ トーマス エベットとジョン ・ ブレイクリー、アレクサンドラ ・ フォーリー イービ、クリス ・ ラングレー、ジュリー ・ ルイス、ケルシー ・ マッキンタイア、アシュリー McKibbon、クリス ヴォージュ山脈とロージーへの出演犬を感謝致します、ビデオ。A. M. K. は、カナダのライム病研究財団によって支えられた、自然科学工学研究会議のカナダ (レベル) によって提供されたプロジェクトの資金調達。M. k. b. W. 給与ニューブランズウィック イノベーション財団 (NBIF) からの資金を受け取った。

1 タイマー刻みから DNA の隔離
<ol><li>フィールド コレクション、または獣医師および公衆のメンバーからの受動的な監視を介してダニを取得します。ダニは凍結によって殺された、密閉袋に入れ、室温で郵送する必要があります。<ol>
<li>提出フォームを使用して、日付と出会い、目盛りの添付の状態、ホスト種、およびホストの最近の旅行の歴史の地理的な位置に関する情報を収集します。</li>
		<li>Nested pcr 法は本質的に汚染されやすいため、サンプルの間露出を最小限にする研究所のワークスペースが設定されているを確認します。これは徹底的に洗浄、滅菌、よく互いから分離独立した専用スペースでのプロトコルのさまざまな要素の実行を含む、すべての楽器を確保する汚染物質の無料です。</li>
		<li>試料を受け取ったら、目盛りを写真し、識別キー32種、発達段階、セックス、および充血状態を比較することにより決定します。</li>
		<li>無菌条件下で剃刀やメスを使用して目盛りを二等分する、独立したマイクロ遠心チューブ用に 2 つの目盛りの断片。</li>
	</ol>
</li>
	<li>全 DNA を抽出するには、PCR と互換性のあるテンプレートを生成する任意の隔離プロシージャを使用します。このプロトコルは、キレート ベースの単純なアプローチを示しています。<ol>
<li>ティック フラグメントに溶解キレート試薬 (50-200 μ L) の間にしばしば適切な量を追加することによって開始します。具体的な金額は標本のサイズと充血の状態によって異なりますガイドラインは、製造元によって提供される必要があります。マイクロ チューブ乳棒を用いてホモジナイズしてください。</li>
		<li>簡単に 45 分と渦の 60 ° c の水浴中サンプルをインキュベートします。</li>
		<li>デスクトップ遠心機で遠心分離機の 16,276 x g (13,300 rpm) で 4 分のサンプル。</li>
		<li>反転して (1.2.3) のように遠心分離機の再ミックス、50 μ L のイソプロパノールを含む新鮮なラベル付きマイクロ チューブに上清を転送します。</li>
		<li>、上清をデカントし、70% のエタノールの 50 μ L の DNA の餌をすすいでください。</li>
		<li>ピペット、余分なエタノールを削除し、室温で 15 分間空気乾燥ペレット。</li>
		<li>DNA を再懸濁します 1 mM Tris pH 7.0 の 50 μ L を追加し、60 ° C で 1 時間湯せんでサンプルをインキュベート今後の分子分析のための-20 ° C で、DNA を格納できるように。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ボレリア OspAとぜい肉の nested pcr 法の検出。
注: 一般的な PCR の原理と実践の概要は、ローレンツ、2012年33によって提供されます。
<ol><li>合成またはボレリアの遺伝子特定の外側と内側のオリゴヌクレオチドのプライマーを取得します。プライマー セット、それぞれ増幅サイズおよび溶融温度の表 1を参照してください。</li>
</ol><table border="1"><tbody>
<tr>
<td>プライマー名</td>
			<td>遺伝子ターゲット</td>
			<td colspan="2">シーケンス (5' 3')</td>
			<td>増幅サイズ</td>
			<td>アニーリング温度</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fw をぜい肉</td>
			<td>ぜい肉</td>
			<td colspan="2">gcatcactttcagggtctca</td>
			<td rowspan="2">503 bp</td>
			<td rowspan="2">55 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rv をぜい肉</td>
			<td>ぜい肉</td>
			<td colspan="2">tggggaacttgattagcctg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fw のぜい肉</td>
			<td>ぜい肉</td>
			<td colspan="2">ctttaagagttcatgttggag</td>
			<td rowspan="2">447 bp</td>
			<td rowspan="2">58 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rv のぜい肉</td>
			<td>ぜい肉</td>
			<td colspan="2">tcattgccattgcagattgt</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA アウト Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">cttgaagttttcaaagaagat</td>
			<td rowspan="2">487 bp</td>
			<td rowspan="2">55 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA アウト Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">caactgctgacccctctaat</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fw OspA</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">acaagagcagacggaaccag</td>
			<td rowspan="2">350 bp</td>
			<td rowspan="2">58 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rv OspA</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">ttggtgccatttgagtcgta</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: ボレリア burgdorferiFlaB ・ OspA nPCR の内側と外側のプライマー。 実習では、ぜい肉のプライマー検出OspAプライマー キャプチャのみボレリア汽船、ボレリアgenospecies が密接に関連B. ボレリアブルグドルフェリss と他両方の軌跡から増幅を示すb.ボレリアブルグドルフェリ。s. s.
<ol start="2"><li>事前殺菌 UV 光と 70% エタノールを用いた PCR キャビネット。 注: 潜在的なサンプルの汚染を最小限に抑えるこのワークスペース ティック解剖、DNA の抽出の場所とは異なる、ゲルの電気泳動。<ol>
<li>最初の PCR 実行 DNA、上記ステップ 1.0 でリカバリし、表 2で説明したように反応混合物を設定テンプレートと組み合わせて外側のプライマーを使用します。並行して、実行制御検証ボレリアの DNA から成る、ネガティブ コントロール実行されますいいえテンプレート反応試薬とエアロゾル汚染を検出するを含む肯定的です。試薬が汚染される可能性を最小限に抑えるために端に DNA を追加します。確実にすべての回と試薬が追加されていないと、DNA 添加直後後の管を閉じて他のチューブを開く前に各管を閉じる。</li>
		<li>サーマルサイクラーを次のようにプログラム: 95 ° C、5 分。40 サイクル 95 ° C の 15 s、アニール温度 30 s、45 のための 72 ° C s;72 ° C、5 分。4 ° C でを押し</li>
	</ol>
</li>
	<li>内側のプライマーを使用し 2 μ L (2.2.2 で生産) 最初の PCR の製品の最初の反応に似ています PCR の 2 番目のラウンドを実行します。 注: 反応ボリュームは表 2に再度提供されます。テンプレート DNA が最後に追加されると同時に 1 つのサンプルに対応するだけの管が開いているを確保することによって amplicons のクロス汚染を避けるために注意する必要があります。 
	 
	<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>コンポーネント</td>
				<td>PCR # 1 ボリューム</td>
				<td>PCR # 2 ボリューム</td>
			</tr>
<tr>
<td>Taq ポリメラーゼのマスター ミックス 2 X</td>
				<td>12.5 Μ L</td>
				<td>12.5 Μ L</td>
			</tr>
<tr>
<td>ヌクレアーゼ フリー水</td>
				<td>8.5 Μ L</td>
				<td>8.5 Μ L</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 μ M 順方向と逆プライマー</td>
				<td>1.0 μ L 外側プライマー</td>
				<td>1.0 μ L インナー プライマー</td>
			</tr>
<tr>
<td>DNA のテンプレート</td>
				<td>2.0 μ L、サンプル抽出 (1.2.7) から</td>
				<td>PCR (2.2.2) のラウンド 1 から、2.0 μ L</td>
			</tr>
</tbody></table>
表 2: PCR 反応混合物最初と 2 番目の拡大。 
	 
	<ol>
<li>熱 cycler を前に、プログラムが、内部のプライマー (表 1 を参照) に対応するためのアニーリングの温度を調整します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Agarose のゲルの電気泳動およびイメージング
注: 電気泳動による DNA の分離の基本的な手順は、李らを参照してください。 2012 年34。
<ol><li>20 X SB バッファー (0.2 M NaOH、0.8 M ホウ酸 pH 8)、1 X に希釈を使用して 1.2% の agarose のゲルの準備し、事前のゲルの染色が必要な場合、注ぐ前に約 5 μ L の DNA 染色を追加します。</li>
	<li>10 の各実験から 2 番目 (内部) PCR の反作用からの製品の μ L と 100 bp ラダー (5 μ L) と一緒にコントロールのサンプルをロードします。<ol>
<li>107 で 1 時間の electrophorese V (5 v/cm)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>表示および transilluminator と関連付けられているカメラとソフトウェアを使用してゲルを文書化します。</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

使用の十年間、PCR ベースの手法が一貫してその価値を証明ボレリアの検出における節足動物と哺乳類の標本からボレリアが環境または臨床的起源から来るかどうか。PCR では、監視する既存の方法より多くの改善を提供しています。特に、それは開発と抗体試薬の性能依存ではなく、代わりにすることができます簡単に適応するプライマー シーケンスを変更することによって単に興味の新しいターゲットを検出します。PCR は、単独または多重反応による並列、複数の遺伝子座の評価も可能です。それは、新鮮でアーカイブされたダニ22、動物または人間の体液と切除25を含む多様な試料の入力に適用できます。PCR はまた amplicons 例については制限の酵素の消化力、プローブの交配、または微生物のアイデンティティ21に増加し洞察力を提供するために、シーケンス処理によって、さらに加工することができますを生成できます。
臨床ツールとして感染症の二次的な対策として宿主の免疫応答に依存するのではなく、細菌の存在の直接徴候を提供するので、PCR は概念的には標準的な血清学的診断することが望ましい。ただし、ライム病は比較的控えめな微生物の負担に関連付けられて (< 50 生物/mL 尿またはプラズマ) と偽陰性に上昇を与えることができる非定常 spirochetemia 結果25。クリニックでこの技術の感度は、組織型、感染、およびサンプル条件のステージ 12.5% と血液、脳脊髄液、生検組織36の既存研究では 62% の落下によってかなり異なります。分子感度限界支障がない場合は細菌培養後 PCR を実施しかし実行可能なスピロヘータの臨床検体からの回復は、同様に挑戦的な証明されています。最近プロトコル高い収量35のために最適化されています。一方、感染成人たにの腸抱くことができます平均どこ 2,000 から以上 50,000ボレリア37,38,39、しっかり nPCR の検出範囲内にあります。したがって、プロトコルは、ティック監視活動に適しています。
NPCR は特定の課題、つまり遺伝子と amplicons 品質 DNA を回復細心の実験的ワークフローの戦略的な選択に依存するダニ感染症を正確に報告するこの技術の容量を提起しているにもかかわらず、その多くの利点サンプルのクロス露出および試薬、実験室の環境の汚染を報告する適切なコントロールの使用を最小限に抑えながら標本から実験を前にスコープおよび調査の意図、明確な適切な遺伝子座と地域、そこに選択できます。目的は、ライムを引き起こすボレリアブルグドルフェリsl の複雑なため公平な画面を提供するためには場合と同様の親和性を持つ関連株のすべてを検出するプライマーを作成して無関係なキャプチャすることがなく増幅効率生物25。新しいプライマーを設計することができ、評価インシリコプライマー ブラスト40などのソフトウェア ツールを使用して標準の参照に対して実験的に検証することもかが未同定のサンプルに適用される前に分離します。DNA 抽出手順の目標は、混在環境試料 (ティック ホモジネート) からそのまま微生物テンプレートを回復するためです。PCR に進む前にオプションのステップは、抽出した DNA の完全性を評価するためです。また、並列の反応は目盛りでハウスキーピング遺伝子を対象とする設定でした。後者の方法は、反応混合物は、ボレリアの否定的な反応は、生物のしていない阻害物質の存在がないのために、増加自信を提供する阻害剤の存在も指定できます。
入れ子になった PCR 方法の感度の向上は、偽陽性の結果を生成する潜在的な汚染を犠牲にして来る。ティック郭清および DNA の回復時や外側と内側の増幅反応を設定する過程で、外因性テンプレートをサンプルに導入できます。テンプレートまたは私アンプリコンを避けるために PCR のための最高の練習プロトコルに従うことが特に重要ですので交差汚染。必要に応じて、PCR の生物学的安全キャビネット独立した気流、封じ込めと別の作業ステーションの使用を含むこれら徹底した化学物理的洗浄、表面や試薬等の滅菌と DNAの慎重な取り扱い41. いいえテンプレート コントロールは、ストックの試薬の汚染を識別するに不可欠な。NPCR の特定の脆弱性は処理私アンプリコン第 2 PCR 容器に最初の反作用の製品を転送するときに発生します。ターゲット DNA は既に肯定的なサンプルの指数強化を受けている、ので交差汚染に特に傾向がある、この手順は、この制限を回避するために開発した単管 nPCR プロトコル。このアプローチである特定の遺伝子のためのプライマーの両方のセットは、PCR31の両方のラウンドの密封されたままで反応管に一緒に追加されます。外側と内側のプライマーのペアは、外側のカップルで内側のプライマーのため禁止はアニール温度が高いテンプレートを増幅するよう熱力学的明瞭ななりません。第 2 ラウンドでは、内部のペアに対応するアニーリングの温度が低下します。これは潜在的交絡ステップをバイパスは、それはまた追加の使用を許可だけでなく抗汚染対策31,42。ただし、この変更は、いくつかのアッセイの感度を犠牲があります。方法、サンプルに独立して実行される技術的複製数の増加にスプリアス汚染を識別するために役立ちます。
分子生物学手法も nPCR の導入以来進化を続けて、これらの新しいアプローチ オリジナル デザイン上の選択の利点を提供は、金融費用の増加であります。その名の通り、量的な PCR (qPCR または実質の時間 (RT)-PCR) 従来技術が自然43で質的なサンプルについては、病原体の列挙が可能になります。QPCR の感度は、プライマー特性28に応じて変動することができますそれが伝え nPCR38に似ています。代わりに従来の TaqMan プローブ分子ビーコン (MB) を使用して、qPCR のバリエーションは臨床検体44,45,46のボレリアの検出にも約束を示しています。彼らのユニークな二次構造による分子ビーコン伝え低バック グラウンド蛍光と通じ、優れた感度47高の正当な信号を生成します。前臨床評価では、1 から 10 のスピロヘータ44,45間の潜在的な検出しきい値をお勧めします。さらに、技術は同時に検出哺乳類宿主遺伝子44と他のダニ媒介性病原体45nPCR を容易に達成可能である多重反応で正常に適用されています。その他のデザイン変更は、標準曲線39,48を使用せず DNA を定量化することができます液滴デジタル PCR (ddPCR) 技術を含みます。ボレリアのこの技術の低い検出限界は同様におよそ 10 のスピロヘータ/サンプル39です。これらのアプローチ nPCR と比較して、彼らはシングル増幅プロトコルを必要と、汚染の減少の可能性の利点もあるされます。
監視の目的は、様々 な細菌、ダニ目次をプロファイルする代わりには、16 s rRNA メタゲノム スクリーニングは魅力的なオプション49です。正確により微生物の広いスペクトルを取り込むことができますが、この方法は高価、すべて分子生物学研究所で見つからない特殊な DNA シーケンサーを必要としより高度なバイオインフォマティクスを用いた解釈が必要になります、ベクトルの病原体の負荷を表します。
対象となる監視活動がバイナリの有無の報告にかかわっているしばしば qPCR とその誘導体、定量用選択の方法とメタゲノム画面提供ティック マイクロバイの広範な在庫、1 つまたは少数の病原体ベクトルで。このような状況下で、これらの新しいより複雑なアプローチはプロセスに不必要な複雑さと財政負担を導入可能性があります。これらの理由から、nPCR テスト目盛りで極めて重要な技術として時の試練に耐えています。

ライム病 (LD) は、北半球で最も普及している媒介性の感染症とその発生率が1を増加し続けています。この衰弱させる病気が、ライム病の (LB) 複雑な (通称ボレリアブルグドルフェリsensu の lato、または s. l.)、歴史的に支配的な北アメリカの病原体、 B. で構成され spirocheteal の病原体によって引き起こされるライム B. afzeliiとB. garinii は、ヨーロッパとアジア、普及と新たな臨床的意義2,3種に加えて狭義 (® と名づける)。これらの細菌が感染しているマダニマダニ2.の咬傷を通して人間に送信されます。主な北アメリカのベクトルがI. いるとI. スルメ港し、菌4を送信するこの属内の複数の種が見つかっています。人間、ボレリアが原因で皮膚、関節、心臓、神経系、内分泌腺、消化管、内臓5,6,7、影響を及ぼす多臓器の症状 8,9,10。疾病管理予防センターは、現在アメリカ合衆国11,12で年間 300,000 以上新しい症例を見積もっています。病気の診断し、初期の段階で治療、予後は良好なしばしば、研究が治療後症状を続けている推奨される抗生物質療法を受けた患者の 60% と 10% 間のどこかを示唆しています。停止現象記事治療ライム病症候群 (PTLDS)13,14,15と呼ばれます。さらに、臨床的介入の遅れがカチカチのかみ傷の意識、初期の病気の非固有のプレゼンテーション、伝統的な血清による診断に基づいて感染症の発症で使用する場合の低感度の不足の結果として発生します。迅速かつ的確に治療するために失敗がますます衰弱させる合併症16,17にマニフェストすることができます症状進行できます。ライム病予防したがってリスク管理の基礎です。この成長の脅威に対抗するための戦略でダニ、病原体の有病率を示すための堅牢な監視措置を含むし、懸念の地理的な地域を特定します。
この記事では、感染しているマダニを識別する分子スクリーニング ツールとして入れ子になったポリメラーゼの連鎖反応 (nPCR) の有用性を示します。、特異性を向上させるため 2 つのボレリア遺伝子は並列増幅に使用されます。フラジェリン B (ぜい肉) 18鞭毛の主要な繊維タンパク質をエンコードし、外表面蛋白質 A (OspA) のリポ蛋白製品媒介マダニの中腸間単一の線形染色体上遺伝子にあります。植民地化はプラスミド エンコード19,20。ワークフローは、ティック コレクション、DNA 抽出しボレリアを検出する PCR の最初のラウンドで構成されています-特定の軌跡。その後 PCR は小さく、内部増幅断片を生成するのに新しいテンプレートとして最初の反作用の製品を使用します。ダニと見なされる正ボレリアブルグドルフェリの両方のボレリアの遺伝子から内側 amplicons は agarose のゲルの電気泳動によって検出できます。
NPCR 技術とぜい肉とOspA遺伝子ターゲットの両方を広く生態学的監視とライム スピロヘータの初期 90 年代21,22,23 以来の検出臨床使用されています。、24,25。分子のプロトコルの開発の前にダニを26抗ボレリア蛍光抗体法 (IF) の染色、微生物文化、またはそれらの組み合わせを消化管内容物をかけることによって評価しました。これらのアプローチは成長が遅く、ボレリア27、抗体パフォーマンスの問題、および IF 処理21ライブ タイマー刻みの要件の気難しい性質を含む固有の制限に苦しみます。PCR 後、感染したベクトルの高速、高感度、および特定の識別を提供するために採用されました。カルチャに依存しないそれ以外の場合にテスト21,22 不向き死者とアーカイブのダニなどの多様な試料の種類に直接アプリケーションを含む、伝統的な方法論でマーク付きの改善を提供.入れ子になった実験的デザインをさらに増幅25,28の 2 連続ラウンドで遺伝子特定のプライマーの 2 つの異なるセットを用いた古典的な PCR の感度と特異性を改良します。
実験成功は戦略的な遺伝子の選択と増幅設計に大きく依存します。ボレリアブルグドルフェリの存在を正確に推定するには、プライマーがボレリア属にも回帰熱スピロヘータと中居に関連する病原体を検出します。ぜい肉の場合この特異性は、多様な細菌 (図 1)24,29によって共有される比較的保存の並ぶシーケンスではなく、遺伝子の可変内部領域をターゲットによって達成されます。,30。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig1.jpg"> 図 1: nPCR、下図を使用しての概念ボレリアぜい肉ターゲットとして遺伝子。遺伝子の 5' と 3' のテルミニはボレリアブルグドルフェリsl のこれらの地域のライムの原因となる病原体の特定の評価には適さないレンダリングを超えて生物に共通です。プライマー ターゲットとして少ない節約インテリア シーケンスを使用して、PCR の 2 ラウンドは最終的に内部の増幅を検出する実行されます。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56471/56471fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
差別的な能力のテストでインテリアのぜい肉プライマーが80 以上の異なるボレリア評価、ライム病24に関連付けられているものだけを識別するために発見しました。624と純粋培養から 1031細菌間で nPCR の検出下限がされて感度は南私アンプリコン、しみが付くことおよび交配、放射性でさらに改善できますが、化学発光プローブ。単一スピロヘータ31検出しきい値を低減技術を結合します。直接の比較によって 104スピロヘータ31の最低の存在を報告するため、従来の unprobed の単一ラウンド PCR が見つかりました。しかし、無関係な DNA および潜在的な阻害物質の圧倒的な存在感のため、複雑な環境および臨床サンプルを操作するとき、アッセイの感度が低くなります、注意すべきであります。これらの課題は、主として nPCR の使用によって回避できます。
過去数十年で分子技術の進歩にもかかわらず、nPCR モダンな監視活動の定番手法のまま。デザインでこのプロトコルの実行注意は、ティック ベクトルにおける病原体の存在をキャプチャするための強力な適応性、および比較的簡単なアプローチです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="830">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">LabGard Class II, Type A2 biological safety cabinet</td>
			<td style="width:192px;">Nuaire</td>
			<td style="width:140px;">ES AIR NU-543&#160;</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Razor blades</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">55411-050</td>
			<td>0.22 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microfuge Tubes (Microtubes 1.5 mL)</td>
			<td style="width:192px;">Axygen</td>
			<td style="width:140px;">311-08-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">AquaGenomic&#160;</td>
			<td style="width:192px;">MultiTarget Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:140px;">2030</td>
			<td>DNA extraction reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microtube Pestle</td>
			<td style="width:192px;">Diamed</td>
			<td style="width:140px;">DIATEC610-1551</td>
			<td>Designed for 1.5 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Water bath - Isotemp 202</td>
			<td style="width:192px;">Fishse Scientific</td>
			<td style="width:140px;">15-462-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Vortex</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">S0100 CAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spectrafuge 24D Digital Microcentrifuge</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">C2400</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">BIS-TRIS</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Primer Synthesis</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">OLIGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PCR Cabinet</td>
			<td style="width:192px;">Misonix</td>
			<td style="width:140px;">PCR6-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PCR tube with attached flat caps 0.2mL</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">20170-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">GoTaq Green Master Mix 2x</td>
			<td style="width:192px;">Promega</td>
			<td style="width:140px;">M7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:192px;">Promega</td>
			<td style="width:140px;">M7123</td>
			<td>The water comes with the GTG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spectrafuge Mini</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">C1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">SYBR Safe DNA Stain 10,000X Concentration</td>
			<td style="width:192px;">EDVOTEK</td>
			<td style="width:140px;">608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Froggarose LE (Molecular Biology Grade Agarose)</td>
			<td style="width:192px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:140px;">A87-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">GD 100 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:192px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:140px;">DM001-R500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Electrophoresis power pack&#160;</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">VWR 105</td>
			<td>EC Apparatus Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Fluor-S MultiImager&#160;</td>
			<td style="width:192px;">BioRad</td>
			<td style="width:140px;">170-7700 (Serial number 433B0154)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:299px;">Quantity One 1-D Analysis Software (V. 4.5.2)</td>
			<td style="width:192px;">BioRad</td>
			<td style="width:140px;">1709600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the lyme disease spirochete, borrelia burgdorferi, in ticks using nested pcr

ライム病は、スピロヘータの感染しているマダニマダニ咬傷を通して人間に感染しているのボレリアブルグドルフェリsensu lato 家族によって引き起こされる深刻な媒介性感染症です。北アメリカの主な病因は、狭義のボレリアブルグドルフェリです。地理的なリスク領域を拡大、堅牢な監視プログラム ダニ感染率を測定でき、臨床医、獣医師、および一般に調査結果を通信をサポートすることをお勧めします。ネストされたポリメラーゼの連鎖反応 (nPCR) の分子技術は長いこの目的のために使用されており、ダニや野生動物のボレリアの検出に中央・安価・堅牢なアプローチ。
この資料では、感染した標本を識別するために DNA 抽出液をチェックする nPCR のアプリケーションを示します。2 つの独立ボレリア目標は、遺伝子のこの手法でエンコードのフラジェリン B (ぜい肉) と外表面蛋白質 A , (OspA) が広く使用されています。プロトコルは、ティック コレクション、DNA 抽出、および 2 つのボレリアのそれぞれを検出する PCR の最初のラウンド-特定の軌跡。後続のポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) はより小さく、内部増幅断片を生成するのに新しいテンプレートとして最初の反作用の製品を使用します。ネストされたアプローチは、従来の PCR の感度と特異性に向上します。ダニは両方ボレリア遺伝子から内側 amplicons は agarose のゲルの電気泳動によって検出できるとき病原体陽性と見なされます。

nPCR は、複雑な環境試料調査中である場合は特に、特異性と病原体検出の感度を高めるためのエレガントなアプローチです。PCRボレリアぜい肉軌跡 (とOspA、描かれていない) の戦略的な地域の 2 つのラウンドが短いインナーの世代を通じてボレリアブルグドルフェリ細菌の存在を報告できる図 1に示されている、amplicons。ゲルの電気泳動によって解決されると、刻みからぜい肉とOspA反応生成物が視覚的に得点し、コントロールと比較します。図 2に各ゲルの上部にあるユニークな標本の識別子が提供されます、いいえテンプレートおよびエアロゾルのコントロール表されます左端と右、それぞれ、はしごに隣接します。
堅牢な増幅バンドは選択の実験サンプルにはっきりと見える、余剰のプライマーと残留 DNA (図 2) から簡単に区別。定める実験設計の原則に基づき、ダニをボレリアネガティブ コントロールを示す増幅、および内部 amplicons、ぜい肉、 OspAプライマーから生成される並列時の肯定的な考えは。この場合、標本 T907、T604、T606 ライム病原体 (図 2) の監視条件に会った。By contrast、T923 が陽性だけOspA、結果複数の可能な説明がある: A) 起源の目盛りはボレリア、陰性ですが外側または内側OspA PCR 準備もに汚染されていたテンプレート DNA (マイナス コントロールを介して試薬の全身汚染が排除されていることに注意)、B) ダニはライム病ボレリア、低テンプレート量や実験的なエラー防止ぜい肉、または C の増幅) 有機体が存在保存されたOspAシーケンスに含まれているが、フラジェリンに欠けていたまたはプライマーをアニールぜい肉の対象地域の不十分なアイデンティティを持っていた。確かに、さまざまな植物や動物の28を含む生物にOspA配列類似性を指摘されています。コンバースの状況より多くの増幅はフラジェリン遺伝子がないOspA遺伝子を保存、可能性があります関連ボレリア種。実際には、このプロトコル シナリオ 'A' が最も可能性の高い説明であることを示唆、ぜい肉プライマーを行う以上のOspA単一肯定的な結果が得られます。好戦的な標本のさらなる実験的解析、せずただし、じゃない単一肯定的な結果の原因を特定することが可能。あいまいなサンプルに対して技術的な複製数の増加は、以前の反応にも導入された汚染物質はアーカイブされた DNA に存在ないので彼らの真の状態の調整を助けるかもしれない。ただし、これらのプライマーとそれに続く反作用は決定的な結果を提供するために失敗した場合、他のボレリアの軌跡は PCR によって調査できます。これらの反応から生成される Amplicons のシーケンシャルな id の割り当てや緊張発散の程度を推定するための隔離集団間で比較もできます。Sapi および同僚は、ひと臨床サンプル35を使用して、このワークフローの例を提供します。
すべての要因は、輪郭を描かれたプロトコルと解釈の基準はそれぞれ 0.17%、0.0063% の偽陽性と偽負のレートを生成すると推定されていると見なされます。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig2.jpg"> 図 2: の検出ボレリアブルグドルフェリnPCR による個々 のタイマー刻みでぜい肉とOspA 。各目盛りに割り当てられたコードは、ゲルの上部に表され、アイデンティティに各試験片におけるOspAとぜい肉の検出を報告する縦に揃えます。レーン権利イメージのないテンプレート コントロールを表すの左にある B (右車線) がエアロゾル試験所環境の汚染をキャプチャするコントロールがあります。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56471/56471fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR at JoVE.com

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Nested pcr 法は、ライム病ライム病の病原のプローブ DNA を抽出し目盛りに適用できる敏感な具体的で、わかりやすい手法です。最初の PCR 実験は遺伝子特定のプライマーを使用し、内部のプライマーを使用して後続の反応のためのテンプレートとなる長い amplicons を生成します。

Nested pcr 法を使用してのタイマー刻みでライム病ライム病スピロヘータを検出

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

detecting-lyme-disease-spirochete-borrelia-burgdorferi-ticks-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

17.8K ビュー.  Mount Allison University. Nested pcr 法は、ライム病ライム病の病原のプローブ DNA を抽出し目盛りに適用できる敏感な具体的で、わかりやすい手法です。最初の PCR 実験は遺伝子特定のプライマーを使用し、内部のプライマーを使用して後続の反応のためのテンプレートとなる長い amplicons を生成します。

ビデオ: Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRアッセイを用いて定量的リアルタイムPCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

生物学

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

電離放射線への応答でγH2AX病巣の定量化

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

エメラルドアッシュボーラーの遺伝子発現の解析（ Agrilus planipennis）を使用して定量的リアルタイム- PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable concentration level. But the design of conventional PCR thermocycling hardware, predominantly based on massive metal heating blocks whose temperature is regulated by thermoelectric heaters, severely limits the achievable reaction speed1. Considerable electrical power is also required to repeatedly heat and cool the reagent mixture, limiting the ability to deploy these instruments in a portable format.
Thermal convection has emerged as a promising alternative thermocycling approach that has the potential to overcome these limitations2-9. Convective flows are an everyday occurrence in a diverse array of settings ranging from the Earth's atmosphere, oceans, and interior, to decorative and colorful lava lamps. Fluid motion is initiated in the same way in each case: a buoyancy driven instability arises when a confined volume of fluid is subjected to a spatial temperature gradient. These same phenomena offer an attractive way to perform PCR thermocycling. By applying a static temperature gradient across an appropriately designed reactor geometry, a continuous circulatory flow can be established that will repeatedly transport PCR reagents through temperature zones associated with the denaturing, annealing, and extension stages of the reaction (Figure 1). Thermocycling can therefore be actuated in a pseudo-isothermal manner by simply holding two opposing surfaces at fixed temperatures, completely eliminating the need to repeatedly heat and cool the instrument.
One of the main challenges facing design of convective thermocyclers is the need to precisely control the spatial velocity and temperature distributions within the reactor to ensure that the reagents sequentially occupy the correct temperature zones for a sufficient period of time10,11. Here we describe results of our efforts to probe the full 3-D velocity and temperature distributions in microscale convective thermocyclers12. Unexpectedly, we have discovered a subset of complex flow trajectories that are highly favorable for PCR due to a synergistic combination of (1) continuous exchange among flow paths that provides an enhanced opportunity for reagents to sample the full range of optimal temperature profiles, and (2) increased time spent within the extension temperature zone the rate limiting step of PCR. Extremely rapid DNA amplification times (under 10 min) are achievable in reactors designed to generate these flows.

We describe a novel method to perform DNA replication via the polymerase chain reaction (PCR). Thermal convection is harnessed to continuously shuttle reagents between denaturing, annealing, and extension conditions by maintaining opposing surfaces of the reactor at constant temperature. This inherently simple design promises to make rapid PCR more accessible.

ミクロ熱対流を使用して迅速なPCRの熱サイクル

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

ゼブラフィッシュを用いた病的ヒトゲノムの in vivoモデルで

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

高解像度メルト解析を用いたPCRを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.