この作品は、韓国国立研究財団（NRF）からJILへの新しい研究者グラント【2014R1A1A1005553]によってサポートされていました。 [2015-22-0133] JILへと延世大学の未来のリーダーチャレンジグラント

1. NGT-3DとNGB-3Dのためのソリューションを準備<ol><li> 0.1454 M NaCl溶液1 L、1 MのCaCl 2、1MのMgSO 4、溶原性ブロス（LB）、KH 2の1 M KPO 4緩衝液（108.3グラムの1 Lの1 Lの1 L：以下の無菌溶液を準備しますK 2 HPO 4のPO 4 35.6 gであり、1 LにH 2 Oを充填します）。これらのソリューションを使用してNGMの生産は以前のプロトコル10で見つけることができます。 </li><li> 121℃、15分のオートクレーブソリューション。 </li><li>無菌の5mg / mlのコレステロール溶液50mlを準備します。 50ミリリットルの円錐管では、コレステロールの0.25グラムと99.99％のエタノール50mlを混合し、よく混ぜます。 オートクレーブしないでください 。 0.45μmのシリンジフィルターで50mlの注射器を用いてコレステロール溶液を滅菌します。これはまた、任意の溶解していないコレステロールを除去します。 </li><li> 2&#39;-デオキシ-5-フルオロ（FUDR）株式の150 mMのの10ミリリットルを用意（オプション）。 15ミリリットルコニカルチューブでは、0.3693グラムを混ぜますFUDRおよび蒸留水10mlを。よくまぜろ。 </li></ol> 2. NGT-3DとNGB-3Dのための細菌培養を準備<ol><li>細菌と10mlのLBブロスに接種。 C.エレガンス供給のために使用される標準的な細菌は、 大腸菌株OP50です。 </li><li>文化一晩振とう培養器で37℃で細菌接種。 </li><li>連続希釈の準備のために、滅菌した15ミリリットルコニカルチューブにNaCl溶液のアリコート9ミリリットル。例えば、7チューブの合計に一定分量9mlをOP50株大腸菌の10 -7希釈を行います。 </li><li> NaCl溶液の9ミリリットルで、無菌の新しいチューブに無菌千μlのピペット、ピペット1mlの細菌培養物または希釈した細菌培養物を使用して、よく10ミリリットルの混合物をボルテックス。目的の細菌の希釈が達成されるまで繰り返します。 注：希望の細菌希釈タイプと条件細菌のと同様に、正確な実験条件に依存します。例えば、10 -6 - 6.5ミリリットルNGT-3Dのチューブ当たり200細菌コロニー- OP50株大腸菌の10 -8希釈は1から生成するのに十分でした。 10 -7 -コロニーの数は60を超えていたとき、ワームは、10 -6の希釈で発生し、確実に開発され、正常に再生しました。 NGB-3Dの場合は、10 -8の希釈を使用します。 </li></ol> 3.メイキングNGT-3DとNGB-3D（200ミリリットル） <ol><li>細菌培養物を準備した後、0.6グラムのNaCl、1グラムの造粒寒天、および500mlのフラスコ内の0.5グラムペプトンを混ぜます。フラスコに磁気攪拌棒を挿入します。 </li><li> 195ミリリットルに蒸留水を加え、アルミホイルでフラスコの口をカバーしています。 </li><li> 15分間121℃でオートクレーブ。 </li><li>撹拌プレート上にホットオートクレーブ処理フラスコを置き、少なくとも2時間、中程度の速度で攪拌します。 40℃にフラスコを冷却します。完成した寒天の曇りにつながる可能性があり、ここで、高温でから継続して十分に冷却するようにしてください。しかしながら、より低い温度は、寒天の早期硬化をもたらすことができます。 <ol><li>撹拌プレート上に配置する前に、40℃の水浴で15分間でフラスコを置き、冷却プロセスをスピードアップする（オプション）。 </li></ol></li><li>寒天培地の温度が40℃に達したとき、溶液を攪拌し続けるように、200μlの1 MのCaCl 2、5 mg / mlでのコレステロール溶液200μl、200μlの1 MのMgSO 4および5 mlの1 M KPO 4緩衝液を加えます1mMのCaCl 2を、5μg/ mlのコレステロール、1mMのMgSO 4を、1 mMのKPO 4の最終濃度まで。 <ol><li> NGT-3Dの寿命アッセイのために（オプション）120μM12の最終濃度に150mMのFUDRの80μlを添加します。 </li></ol></li><li>直接フラスコにステップ2.4からの細菌培養物を希釈した10ミリリットルの6ミリリットルを追加します。 <ol><li> （オプション）NGT-3Dの場合は、ステップ3.6前の寒天培地の6ミリリットルを削除し、別にそれを暖かく保ちます。このメディアが使用されます細菌フリー上層。 </li></ol></li><li>滅菌手順を使用して、無菌培養室にメディアを分配します。チャンバーのカバーがしっかりと閉じていることを確認します。 <ol><li>ステップ3.7からのメディアが完全に硬化する前に、上のステップ3.6.1から細菌を含まない寒天培地の層を作る、寒天の上面に形成されるの細菌コロニーを防止するために、（オプション）。これはNGT-3Dの上部にある細菌フリーゾーンを作成します。 </li><li> NGT-3Dの場合は、細菌の寒天層を作り、そして慎重に薄いbacteria-を作るために半硬化3Dメディアの上に細菌を含まない培地200μlのを分配するために8ミリリットル透明なプラスチック製試験管に6.5ミリリットルのメディアを注ぎます上部の自由層。 </li><li> NGB-3Dの場合は、25cm 2の透明なプラスチックの細胞培養瓶にメディアの65ミリリットルを注ぎます。この量は、25cm 2の細胞培養ボトルのボディを埋める必要があります。 </li></ol></li><li>細菌コロニーが成長できるようにするために、室温で1週間垂直室を残します少なくとも直径1mmのかなりの大きさ。 <ol><li> （オプション）NGT-3Dで寿命アッセイのために、FUDRの光劣化を防止するために、アルミホイルでチャンバーをカバーしています。 </li></ol></li></ol> NGT-3D（相対同腹サイズアッセイ）上でワームの人口の4メジャーフィットネス<ol><li>ピックや細菌フリーNGMプレート上の転送白金線を使用して、L4段ワームを選びます。ワームは自由に体に付着した細菌を除去するために、数分間に移動できるようにします。 </li><li>ステップ4.1を繰り返して、このワームは細菌から自由であることを確認してください。一般的に、4.1の2反復が十分にあります。 </li><li>慎重に白金線ピックで3Dメディアの表面にきれいなワームを置きます。ワームは、最終的には3D寒天マトリックス中に寒天を入力する必要があります。 </li><li>ゆるくいくつかの空気がチューブに入るためにできるようにカバーを閉じますが、寒天培地の乾燥を防止します。 </li><li> 20℃で96時間インキュベートします。 </li><li> 4日後、しっかりと蓋を閉じて置きます88℃の水浴にNGT-3D培養チャンバは、寒天を融解します。熱は虫を殺すが、自分の体はそのまま残ります。 注：NGT-3Dのための8ミリリットルのチューブを使用して、20から30分間のインキュベーションは、通常は十分です。 </li><li>ガラスピペットを使用して9センチプラスチックシャーレ上に溶融したメディアを転送します。ワームは、多くの場合、それらに固執することができますようにプラスチックピペットは、お勧めされていません。 </li><li>送信立体解剖顕微鏡を用いて、L3、L4でワーム、および成体段階の数を数えます。 F1及びF2世代はここで混乱することができますように、L2ステージと若いワー​​ムをカウントしないでください。したがって、このアッセイは、相対的なひなサイズ分析ではなく、合計ひなサイズのアッセイです。 </li></ol> 5.イメージとNGB-3Dでの録音ワームの動作<ol><li>白金線を使用して、L4段ワームをピックし、細菌フリーNGMプレートに移し、それが自由に数分間移動させることにより、表面に付着した細菌を除去します。 </li><li>インクルードをめざし確実にする手順を繰り返し5.1rmが細菌から自由です。 </li><li>慎重に白金線ピックと瓶の首に近いNGB-3Dの寒天表面の中央にきれいなワームを配置します。ワームは、最終的には3D寒天マトリックス中に寒天を入力する必要があります。 </li><li>寒天培地の乾燥を防止しながら、緩やかにいくつかの空気がチューブに入るためにできるようにカバーを閉じます。 </li><li>画像または伝送ステレオ解剖顕微鏡下でワームを記録。ワームが3Dマトリックスを通って移動するようにフォーカスを調整します。 </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

古典的な線虫の増殖培地プレートを使用して、 線虫の実験室での栽培は、 線虫の研究が提供していることが重要な発見の数百に非常に重要でした。ここで、我々はより正確に自然な立体生息環境を反映している環境で、 線虫を育成する新たな方法を提示します。他の方法は、3D 13の線虫を観察するために使用されているが、これは、固体三次元マトリックスにワームの栽培を可能にする最初のプロトコルです。ここに示されている二つの方法、NGT-3DとNGB-3Dは、科学者が3D栽培でフィットネス、発展と成長の質問をし、また、画像や3Dでワームを記録することができます。 NGT-3DとNGB-3Dは、標準的な2D NGMプレートにいくつかの違いがありますが、彼らはこのオリジナルの方法と同様であり、唯一のz軸にワーム栽培を追加するように調整します。したがって、我々は、開発、生殖能力と寿命が私たちの条件で正常に進行していることを見つけます。ザ目標は、任意の研究室が自分の研究のために使用することができるプロトコルを作成することでした。これらの方法は、非常に低コストで容易に再現、非常に簡単であり、ユーザの特定の実験に合わせてプロトコルの調整を可能にします。 プロトコルのステップのすべてが重要であるが、NGT-3DとNGB-3Dを作る上で重要なステップは、プロトコルの3.6にステップ3.4でオートクレーブ後の寒天の冷却温度です。温度は（40℃以下に数度）が低すぎるを冷却する場合は、寒天が硬化し始め、追加のソリューションは、寒天の中に適切に混在させることはできません。冷却が不十分（40°C以上の数度）である場合には、追加された細菌が死ぬかもしれ、コメントを追加しましたコレステロール溶液は実験のための無駄な寒天をレンダリング寒天を曇らせることがあります。また、注意の面積は、ステップ4.6です。水浴中でNGT-3D寒天を溶融すると、溶融を支援するためにしっかりと蓋を閉じてください。しかし、熱が発生する可能性があります危険なオフ &quot;ポップ&quot;と発射になるためのキャップ。安全のためには、水浴をカバーするのが最善です。プロトコルの多くの部分は、ユーザーには非常に適応可能です。例えば、我々はNGT-3Dのための明確なプラスチック製の試験管とNGB-3D用の25cm 2の明確な細胞培養瓶を（65ミリリットルの合計を保持している）を使用しています。ユーザが利用可能な明確なチューブやボトルの他のタイプも動作するはずです。また、細菌の増殖は調整可能です。 大腸菌株OP50は、一般的に私たちの実験のために好まれた少なくとも1ミリメートル、に成長すると一週間ほどかかります。我々の経験では、細菌のため若干短く、さらにははるかに長い成長時間はワームの成長や生殖能力に影響を与えていないように見えます。寒天濃度の調整は、しかし、ワームの動きに影響を与えます。寒天のより低い濃度は、水泳のような動きを示すワームになり、そしてより高い濃度は、全体の動きを阻害することができます。 NGB-3Dでの懸念の1つの領域は結露の問題でしたそして、水の蓄積。暖かい液体寒天が硬化するように、必然的にいくつかの結露は、特にボトルや寒天の界面で、時間をかけて開発しています。これは、水泳用液体14で行動や液体によってボトル全体に広がることができる細菌の増殖を、示しているワームのための問題を提起することができます。結露を防止することが困難です。二つの可能な救済は、このために存在します。まず、ワームが簡単にボトルの首に寒天表面の中心に置くことで、寒天を入力することができることを確認してください。第二に、我々は意図的にそれによってコロニーは、液体と寒天との界面に成長する機会を減少させる、NGB-3Dで低細菌の濃度を保ちます。 もう一つの懸念は、NGB-3Dでワームのイメージングです。 3Dでワームの画像の明瞭性と品質を向上させるために、コロニーは表面に近いことが、完全に寒天中に埋め込まれたままであるべきです。私たちは、surfaの近くにのみ埋め込まれたコロニーを成長しようとしました表面の細菌を含む寒天の薄層を配置することにより、CE、および残りのメディアが細菌無料でした。しかし、問題は完全には、この方法によって解決されませんでした。代わりに、我々は、一度に多くのNGB-3Dのボトルを生産し、表面に近い埋め込まれたコロニーが含まれているものだけを使用し、それによって、ワームは表面付近の植民地に移動する可能性を増加させることにしました。我々が調査していません1つのオプションは、我々がここで採用した造粒寒天以外の行列に固形培地を変えています。 z軸方向にワームを撮像することも困難なことができます。我々は、手動で粗いフォーカスを昇降させることによってこれを行うが、自動追跡プログラムは、このために存在する場合、それは非常に役に立つかもしれません。 希望は3DでC.エレガンスの栽培のためにここに示す手法が広く線虫の生物学者によって使用されるということです。多くの疑問が高齢化し、3Dでの行動を含め、ワームの生物学についてのままであり、科学者がで観察するものかどうか2Dは3Dでワームに関連します。実際、NGT-3Dを用いた以前の研究は、3D栽培が2D条件9で正常に再生する感覚変異体であったことを生殖適応度への影響を示しました。さらに、1つの研究では、2D 15に比べて3Dで変更された動きの挙動を示しました。最後に、このシステムは、特定の条件、変異体または操作は、その天然の3D環境で動物にトレーニング利点を与えるかどうかの質問に答えるために開始するために使用することができます。

The study of the nematode Caenorhabditis elegans in the laboratory has led to seminal discoveries in the field of biology over the last five decades1. C. elegans was the first multicellular organism to have its genome sequenced in 19982, and it has been invaluable in understanding the contributions of individual genes to the development, physiology, and behavior of a whole organism. Scientists now are looking to further understand how these genes may contribute to the survival and reproductive fitness of organisms in their natural environments, asking questions about ecology and evolution at the genetic level3-5. 
C. elegans once again can provide an excellent system to answer these questions. However, little is known about C. elegans biology in natural nematode habitats, and there are no current methods to simulate controlled natural conditions of C. elegans in the laboratory. In the lab, C. elegans is cultivated on the surface of agar plates seeded with E. coli bacteria6. In nature, however, C. elegans and related nematodes can be found sparsely inhabiting soils throughout the globe, but they are specifically found thriving in rotting fruits and vegetative matter7,8. These three-dimensional (3D) complex environments are quite different from the simple 2D environments to which worms are exposed to in the laboratory. 
To begin to answer questions about the biology of nematodes in a more natural 3D setting, we have designed a 3D habitat for laboratory cultivation of nematodes we called Nematode Growth Tube 3D or NGT-3D for short9. The goal was to design a 3D growth system that allows for comparable growth, development, and fertility to the standard 2D Nematode Growth Media (NGM) plates10. This system supports the growth of bacteria and nematodes over their entire life cycles in 3D, allows worms to move and behave freely in three dimensions, and is easy and inexpensive to manufacture and employ. 
In the current study, we provide a step-by-step method to manufacture NGT-3D and evaluate worm development and fertility. In addition to assessing worm fitness in 3D, we sought to image, video, and assess worm behavior and physiology in 3D cultivation. Thus, in addition to NGT-3D, we present here an alternate method called Nematode Growth Bottle 3D or NGB-3D, for the microscopic imaging of C. elegans during 3D cultivation. This will be especially important for the study of known behaviors identified in 2D, and the identification of novel behaviors unique to 3D cultivation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>224620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>DAEJUNG</td>
			<td>7548-4400</td>
			<td>58.44 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, dihydrate</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>CD0050</td>
			<td>2*H2O; 147.02 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>CD0122</td>
			<td>386.67 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>B&#38;J</td>
			<td>RP090-1</td>
			<td>99.99%; 46.07 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate, anhydrous</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>MN1988</td>
			<td>120.37 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, monobasic, anhydrous</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PB0445</td>
			<td>136.09 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#39;-Deoxy-5-fluorouridine</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>D2235</td>
			<td>246.19 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibasic, anhydrous</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PB0447</td>
			<td>174.18 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Purpose Test Tubes</td>
			<td>Stockwell Scientific</td>
			<td>ST.8570</td>
			<td>8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Tube Closures</td>
			<td>Stockwell Scientific</td>
			<td>ST.8575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flask</td>
			<td>SPL Lifescience</td>
			<td>70125</td>
			<td>25 cm^2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Definition Color Camera Head</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DS-Fi2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC-Based Control Unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DS-U3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS32000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of caenorhabditis elegans in three dimensions in the laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

NGT-3Dの建設は、寒天（ 図1A）全体に間隔をあけ小さな細菌コロニーを寒天で満たされた試験管になり、シンプルで簡単なプロトコルです。ワームは自由に細菌コロニーを発見し、消費し、寒天マトリックスを通って移動することができます。 C.エレガンスが再現し、NGT-3Dで正常に成長できるかどうかを確認するために、我々は標準的な2D NGMプレートで3Dで不妊治療や幼虫の発育を比較しました。相対ひなサイズのアッセイでは、成人のC.は NGT-3Dで雌雄同体はちょうど同様に細菌コロニーは、少なくとも60個のコロニー（ 図1B）と豊富で、標準的な2D NGMプレートで雌雄同体を再現エレガンス 。また、NGT-3Dで幼虫の開発も96時間（ 図1C）後の大人の状態でのワームの大半は細菌コロニーがたくさんあるときに通常進みます。しかし、細菌コロニーが疎である場合に3Dマトリックス中に、相対的なひなサイズ（ 図1B、左のバー）と幼虫の発育（ 図1C、左のバー）の両方がマイナスの影響を受けています。 3Dでの居住がワームの長期的な生理学上の任意の効果を持っているかどうかを検証するために、我々はNGT-3DとNGMプレートを比較寿命試験を行いました。 NGT-3Dにワームの平均寿命は、標準的なNGMプレートのための14.8±3.1日と比較して15.6±3.6日でした。 NGT-3DとNGMに住んでいるワームのための寿命曲線はほぼ同一でした。したがって、ワームは、3Dと2Dの条件で等しく良好に生き残るようです。 NGB-3Dを製造することも難しいことではありませんし、 図2Aに見られるような明確な、寒天を充填した培養瓶をもたらすべきです。簡単に細菌コロニーを表示するには、我々はOP50で、deoxyviolacein、濃い紅色細菌の代謝物11を表明しています大腸菌株（ 図2A、2B、リクエストに応じてご利用いただけ株）。ライブワーム送信立体解剖顕微鏡（ 図2B、 補足の動画1）の下で撮像することができます。 室温でNGT-3D及びNGB-3Dの記憶は、最大1ヶ月間、これらの培養チャンバの両方を維持するのに十分です。チューブまたはボトルに合うプラグ型又はスクリュー型キャップが適用される場合、寒天の乾燥はNGT-3DまたはNGB-3Dのいずれかのための問題ではありません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55048/55048fig1.jpg" /> 図1：NGT-3D で栽培 C.エレガンス の開発、生殖能力と寿命は 標準2D NGMのそれに匹敵します。 （A）細菌のいくつかの希釈でNGT-3Dの画像。左と右の5×10 -7希釈が含まれており、中央が1×10 -7希釈です。 60個未満のOP50コロニーへ（B）NGT-3Dで野生型ワームの相対的なひなサイズ（N = 24）、より大きいまたは60個のコロニー（N = 14）に等しい、または2D NGMプレート上（N = 29）。エラーバーは標準誤差を示します。以上60コロニーに等しい、または2D NGMプレート上に60個未満のOP50コロニー、とNGT-3DでL3、L4、大人の発達段階でのF1世代のワーム（C）パーセント。 （D）NGT-3DまたはNGMプレートで野生型のC.エレガンスの生存曲線。 NSは、有意に異なったログランク検定により計算されていない示します。この図は、イ・9から変更されています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55048/55048fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" srC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 55048 / 55048fig2.jpg&quot; /&gt; 図2：NGB-3D を使用して3Dでの イメージング C.エレガンス 。 NGB-3Dの（A、B）画像。濃い紫色の色素deoxyviolaceinを表現OP50株大腸菌のコロニー近くの大人エレガンスの（C）画像。スケールバーは500μmです。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55048/55048fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55048/55048supmov.jpg" /> 補足ムービー1：大人エレガンスが NGB-3Dでコロニーで大腸菌 OP50-violaceに近づきます。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55048/Jove_Mov_1.mp4">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

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Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

我々はNGT-3DとNGB-3Dと呼ばれる3D線虫の栽培システムを構築するための簡単な方法を提示します。これらは、標準的な2D実験室のC.エレガンス培養プレートより自然な線虫（Caenorhabditis elegans）の生息地に類似している生息地における線虫のフィットネスや行動を研究するために使用することができます。

の栽培<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;ラボにおける三次元で

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

cultivation-caenorhabditis-elegans-three-dimensions

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

17.7K ビュー.  Yonsei University. 我々はNGT-3DとNGB-3Dと呼ばれる3D線虫の栽培システムを構築するための簡単な方法を提示します。これらは、標準的な2D実験室のC.エレガンス培養プレートより自然な線虫（Caenorhabditis elegans）の生息地に類似している生息地における線虫のフィットネスや行動を研究するために使用することができます。 

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Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

アイソレーションと試験管内で</emの>活性化線虫（Caenorhabditis elegans）精子

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

生物学

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

計測線虫（Caenorhabditis elegans）</em96穴マイクロタイタープレートの>寿命

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

固体プレートベースの食餌制限線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

におけるプロスタグランジンの抽出と分析<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Hemi-laryngeal Setup for Studying Vocal Fold Vibration in Three Dimensions

The voice of humans and most non-human mammals is generated in the larynx through self-sustaining oscillation of the vocal folds. Direct visual documentation of vocal fold vibration is challenging, particularly in non-human mammals. As an alternative, excised larynx experiments provide the opportunity to investigate vocal fold vibration under controlled physiological and physical conditions. However, the use of a full larynx merely provides a top view of the vocal folds, excluding crucial portions of the oscillating structures from observation during their interaction with aerodynamic forces. This limitation can be overcome by utilizing a hemi-larynx setup where one half of the larynx is mid-sagittally removed, providing both a superior and a lateral view of the remaining vocal fold during self-sustained oscillation.
Here, a step-by-step guide for the anatomical preparation of hemi-laryngeal structures and their mounting on the laboratory bench is given. Exemplary phonation of the hemi-larynx preparation is documented with high-speed video data captured by two synchronized cameras (superior and lateral views), showing three-dimensional vocal fold motion and corresponding time-varying contact area. The documentation of the hemi-larynx setup in this publication will facilitate application and reliable repeatability in experimental research, providing voice scientists with the potential to better understand the biomechanics of voice production.

This paper introduces a protocol for the preparation of hemi-larynx specimens facilitating a multi-dimensional view of vocal fold vibration, in order to investigate various biophysical aspects of voice production in humans and non-human mammals.

3 つの次元で声帯振動を勉強のため片側喉頭セットアップ

The voice of humans and most non-human mammals is generated in the larynx through self-sustaining oscillation of the vocal folds. Direct visual ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of reference fish model systems, such as zebrafish and medaka. In recent years, an emerging fish &#8211; the turquoise killifish (Nothobranchius furzeri) &#8211; has been adopted by a growing number of research groups in the fields of biology of aging and ecology. With a captive life span of 4 - 8 months, this species is the shortest-lived vertebrate raised in captivity and allows the scientific community to test &#8211; in a short time &#8211; experimental interventions that can lead to alterations of the aging rate and life expectancy. Given the unique biology of this species, characterized by embryonic diapause, explosive sexual maturation, marked morphological and behavioral sexual dimorphism - and their relatively short adult life span -&#160;ad hoc husbandry practices are in urgent demand. This protocol reports a set of key husbandry measures that allow optimal turquoise killifish laboratory care, enabling the scientific community to adopt this species as a powerful laboratory animal model.

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Laboratory housing of turquoise killifish can be scaled up&#160;to house and efficiently raise thousands of individual fish in a centralized water filtration system, employing the same infrastructure used for standard zebrafish facilities. Here we detail a list of standardized procedures that allow efficient killifish maintenance.

研究室住宅のターコイズ メダカ (による furzeri) のためのプロトコル

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

そのまま線虫の酸素消費量の測定

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...