我々は、国立衛生研究所（R15 LBへGM065444 - 03）と衛生研究所（NIH）と糖尿病および消化器腎臓病研究所（KO）の国立研究所の学内研究プログラムから資金提供を承認したいと思います。 NSFの賞（DBI - 0923402）はLSM700共焦点顕微鏡の買収資金を提供。我々はまた、一般的な支援と博士アンディゴールデンから原稿上で有用なコメントに感謝します。クレジットは、共有リソース、プロトコル、およびアイデアのために全体の線虫C. elegansコミュニティに行きます。

1。線虫の培養<ol><li>適切なCを取得する虫は虫Caenorhabditis遺伝ストックセンター（CGC）からまたは同僚からの株。 </li><li> OP50細菌の芝生（3）を接種したNGM寒天プレート上に線虫を成長する。 25 GFP株の成長の分析のため° Cを推奨します。 </li><li>あなたの顕微鏡の実験前日には、シードのプレート上に少なくとも40 L4幼虫を選択し、℃で一晩25℃でプレートを置きます。これらのワームは、実験のための若年成人になります。 </li></ol> 2。注射それはそのようなリソソームやミトコンドリアなどの構造を表示することが望ましい場合、大人の可視化の前に蛍光色素を注入することができます。 <ol><li>乾燥アガロースインジェクションパッドを準備します。 （これは事前に多くの日にかを行うことができます） <ol><li>水に溶けた2％アガロースを準備します。パスツールピペットで22X54 mmのカバーガラスの上に2滴を置く。ドロップの上にクロス賢明な別のカバーガラスを置きます。パッドの直径が約1.5 cmであるまで、適切な厚さを達成するために、上部カバーガラスに押してください。 5〜10分放置します。 </li><li>トップカバーガラスを取り外します。 1時間80℃のオーブンでそれを配置することにより、アガロースのパッドを脱水または一晩ベンチに座ることができます。 </li></ol></li><li> MitoTrackerによりまたはLysotrackerの溶液を調製します。 <ol><li>卵のバッファに蛍光剤を希釈する。我々は通常、MitoTrackerによりまたはLysotrackerの1:10希釈液を使用してください。 </li><li>注射針は、キャピラリー1.2 ODのガラスで作られています。ニードルプラーを使用して、注射針を引き抜きます。 </li><li>バック希釈染料で針を埋めるために引っ張らPastuerのピペットを使用してください。 </li><li>使用するまで、光のない、加湿チャンバーに針を置きます。 </li></ol></li><li>プレインジェクション：顕微鏡と針を設定する。 <ol><li>射出装置に注射針をマウントします。私たちの装置は、DICイメージング機能を搭載したニコンTE200倒立顕微鏡のステージ上にマウントされているナリシゲダイレクトドライブマニピュレータです。 </li><li>圧力調整器に接続されている1.2mmのID管に針を接続してください。圧縮空気または窒素のどちらかが外部の圧力源として使用することができます。 20から25 psiにレギュレータを設定します。 </li><li>注射パッドの上に重鉱物オイルを2滴（パラフィン油）を配置します。 </li><li>顕微鏡にインジェクションパッドを配置し、油に針を下ろします。圧力が印加されたときに流体が針から自由に流れることを確認してください。射出圧力を適用し、液体が針から流れ出すかどうかを観察。そうでなければ、そっと針の末尾を分割する必要があるでしょう。針が静かに注入パッド上に配置壊れたカバーガラスの小さなビットに先端を駆動することによって分けることができます。針が流れている後は、次の手順に進みます。 </li></ol></li><li>注射。 <ol><li>前の表示胚へ約1時間、注入パッド上の油滴に若い成虫を転送する。解剖顕微鏡を使ってこの転送を実行します。ワームを転送するための尖った先端を白金線のワームのピックを使用してください。 </li><li>彼らはパッドの上に直接横たわっているように、10ワーム - 3を手配する。注射の場合は、それが最も簡単ですワームは、互いに平行に並べられ、少し未満ワームの長さが離れて。されている場合ワームは、注入のパッドにしたらそれはすぐに仕事やワームは、乾燥から死ぬ前に、注入プロセスを完了することが重要です。 </li><li>注入顕微鏡の顕微鏡ステージ上にワームでカバーガラスを配置。遠位生殖腺管の中央部（花軸）に焦点を当てる。その後、同じ焦点面に針の先端を移動するためにマイクロマニピュレーターを使用してください。水平方向にワームが針によって穿刺されていることのステージを移動します。針の先端が花軸の内側になると、圧力を適用し、生殖腺は、染料混合物でいっぱいにすることができます。注射パッドの上に、すべてのワームの生殖腺両腕を注入する。 </li><li>注入後は、ワームに卵バッファの約0.5mlを提供するために引っ張らパスツールピペットを使用してください。これは、脱水で死ぬからそれらを維持し、それらを射出手順から回復できるようになります。 </li><li>ワームは、光のない、加湿チャンバー内で室温で1-2時間で回復することができます。 </li></ol></li></ol> 3。胚を表示するためのアガロースパッド<ol><li>卵のバッファで溶融、2％アガロースを準備します。 </li><li>パスツールピペットで、きれいな顕微鏡スライド上に溶融アガロースの3滴を入れて。 </li><li>それらをカバーするテープにラベルを付けるの一つの層を持つ2つの他のスライドの間でスライドを配置。これらは、アガロースパッドが正しい厚さであることを保証するスペーサーとして機能する。 </li><li>垂直に下にアガロース滴上に第2のきれいな顕微鏡スライドを置きます。トップスライドがガイドのスライドからテープの上に物を置かないまで押し下げます。 </li><li>あなたが観察するための胚をマウントする準備ができてちょう​​ど前に、上部のスライドを削除します。 </li></ol><ol><li>ワームが注入されていない場合は、次の2つの手順に従ってください。そうでなければ、それらをスキップします。 <ol><li>前日に調製されたプレートからの若い成虫を選択してください。あなたは若い成人の内部に胚を見ることができるはずです。 </li><li>シーディングされていないのNGMプレート上に50から20までワームを選択してください。ワームは、それらにスタックしている細菌のほとんどを失うことになるようにワームが数分のためにシーディングされていないプレート上で約クロールすることができます。 </li></ol></li><li>成虫から若い胚を入手する<ol><li> 18ミリメートル2ガラスのカバーガラス（1.5のカバーガラスの厚さが望ましい）の真ん中に卵のバッファの5-20液滴を配置。 </li><li>卵バッファのドロップにシーディングされていないプレートまたは注射パッドからワームを移動します。 </li><li> 26ゲージの注射針で開いているワームをカット。外陰部の近くにワームを開いてカット。あなたは、胚がワームから水が漏れるはずです。 </li></ol></li><li>顕微鏡スライド上にマウントする<ol><li>アガロースのパッドを用いて調製し、胚とカバーガラスの上にそれを下げていた顕微鏡のスライドを反転。 </li><li>延長時間の経過が必要な場合は、dessicationを防ぐためにカバーガラスの端をシールするためにワセリンを使用してください。 </li></ol></li></ol> 5。顕微鏡検査<ol><li>適切な胚を見つける。 <ol><li>顕微鏡のステージ上にスライドを配置。胚を見つけるために10倍レンズをスキャン。 </li><li>初期段階の胚を見つけるには、母体の減数分裂を完了する過程にある胚を検索してください。彼らは短縮を受けていないので、減数分裂の胚は、後に胚と区別することができます。 （胚の減数分裂を完了した後に、細胞膜と前端に卵の殻の間に大きな差を見ることができます。） </li><li>一度識別した適切な胚発生の記録のために高倍率のレンズに移動し、胚を上演。 </li></ol></li><li>イメージング<ol><li>この例では、我々はmCherryを表現胚を想像されています：：H2BとGFP：：Ubをタグ融合タンパク質。我々はツァイスLSM700従来のレーザー走査型顕微鏡を使用しています。 </li><li>画像は63X 1.4NAレンズを使用して収集されます。 488と555レーザーは最小のレーザパワーと最大ゲインで使用されています。 AZのスタックは10〜15秒に収集されます。退色の程度に応じて30〜60時間のポイントが収集されます。 Zスタック画像は、最終的なタイムラプスビデオの最大投影画像に縮小されます。 </li></ol></li></ol> 6。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig1.jpg" alt="図1" /> 図1 C言語で最初に有糸分裂への施肥エレガンス。 <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig2.jpg" alt="図2" /> 図2マイクロインジェクションの手順。 補足ビデオ1 GFPのタイムラプスビデオ：。。減数分裂胚におけるユビキチンプラスLysotrackerブルーは、 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/2852/2852fig3.avi">ビデオを表示するにはここをクリックしてください。</a>

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	<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833-e833 (2008).</li><li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgenic+C.+elegans+by+Biolistic+Transformation.">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation.</a> J Vis Exp. (42), e2090-e2090 (2010).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+Caenrohabditis+elegans.">The Genetics of Caenrohabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division+WormBook.">Cell division WormBook.</a> , (2006).</li><li>McNally, K. L., McNally, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+initiates+the+transition+from+anaphase+I+to+metaphase+II+during+female+meiosis+in+C.+elegans.">Fertilization initiates the transition from anaphase I to metaphase II during female meiosis in C. elegans.</a> Dev Biol. 282, 218-230 (2005).</li><li>Sato, K., Sato, M., Audhya, A., Oegema, K., Schweinsberg, P., Grant, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+caveolin-1+trafficking+in+the+germ+line+and+embryo+of+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic regulation of caveolin-1 trafficking in the germ line and embryo of Caenorhabditis elegans.</a> Mol Biol Cell. 17, 3085-3094 (2006).</li><li>Stitzel, M. L., Pellettieri, J., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+DYRK+Kinase+MBK-2+Marks+Oocyte+Proteins+for+Degradation+in+Response+to+Meiotic+Maturation.">The C. elegans DYRK Kinase MBK-2 Marks Oocyte Proteins for Degradation in Response to Meiotic Maturation.</a> Curr Biol. 16, 56-62 (2006).</li><li>Schetter, A., Askjaer, P., Piano, F., Mattaj, I., Kemphues, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoporins+NPP-1,+NPP-3,+NPP-4,+NPP-11+and+NPP-13+are+required+for+proper+spindle+orientation+in+C.+elegans.">Nucleoporins NPP-1, NPP-3, NPP-4, NPP-11 and NPP-13 are required for proper spindle orientation in C. elegans.</a> Dev. Biol. 289, 360-371 (2006).</li><li>Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+during+fertilization+in+C.+elegans.">Calcium dynamics during fertilization in C. elegans.</a> BMC Dev Biol. 1, (2001).</li><li>Badrinath, A. S., White, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+patterns+of+mitochondrial+redistribution+in+the+early+lineages+of+Caenorhabditis+elegans+and+Acrobeloides+sp.+PS1146.">Contrasting patterns of mitochondrial redistribution in the early lineages of Caenorhabditis elegans and Acrobeloides sp. PS1146.</a> Dev. Biol. 258, 270-275 (2003).</li><li>Johnston, W. L., Krizus, A., Dennis, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eggshell+is+required+for+meiotic+fidelity,+polar-body+extrusion+and+polarization+of+the+C.+elegans+embryo.">The eggshell is required for meiotic fidelity, polar-body extrusion and polarization of the C. elegans embryo.</a> BMC Biol. 4, 35-35 (2006).</li><li>Parry, J. M., Velarde, N. V., Lefkovith, A. J., Zegarek, M. H., Hang, J. S., Ohm, J., Klancer, R., Maruyama, R., Druzhinina, M. K., Grant, B. D., Piano, F., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGG-4+and+EGG-5+Link+Events+of+the+Oocyte-to-Embryo+Transition+with+Meiotic+Progression+in+C.+elegans.">EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans.</a> Curr Biol. 19, 1752-1757 (2009).</li><li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging.">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys J. 75, 2015-2024 (1998).</li><li>Zinselmeyer, B. H., Dempster, J., Wokosin, D. L., Cannon, J. J., Pless, R., Parker, I., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+and+multidimensional+analysis+of+cell+dynamics.">Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics.</a> Methods Enzymol. 461, 349-378 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

精子との融合後、接合子は、動的な一連のイベントを受ける。これらのイベントは、急速に発展胚に比較的静的な細胞から卵​​母細胞を変換する。多くの生物で、細胞質の再編成は、胚の極性を確立し、卵の活性化にとって重要です。 C.線虫の胚は卵活性化および胚発生のこれらの初期の事象を観察するための素晴らしい機会を提供します。受精後に比較的急速に胚は透明であり、初期の発達のイベントが発生します。C.は虫の研究者が開発の初期段階に関与する蛍光標識タンパク質を発現する多くの有用なトランスジェニック系統を生成している。 RNAiまたは変異体と一緒にこれらの菌株を使用すると、多細胞生物（5、6、7、8）の開発の根底にある分子経路を解剖するための強力なシステムを提供します。このビデオの記事では、C言語の初期胚発生時にイベントを記録するために、これらのツールやテクニックを使用する実用的なアプローチを提示エレガンス。 成熟したC.虫の卵母細胞は、私は、減数分裂前期で逮捕され、成人の雌雄同体の貯精嚢に受精されています。受精後、卵母細胞が減数分裂IとIIの残りの部分を進行する。これらの段階は、蛍光標識ヒストンH2B（5）を用いて観察することができます。母体の減数分裂の完了時に、精子のDNAが凝縮されたままです（図1参照）。減数分裂の終了後、母親と父親のDNAが脱凝縮した二前核の形になります。母親の前核は父系の前核に向かって移行し、彼らは、胚の中央付近に合流する。有糸分裂は、すぐに前核の会議の後に陥ります。これらのイベントのすべては、時間未満で起こる。従って、この一連のイベントのタイムラプス顕微鏡を容易に行うことができます。この手法を実行すると、共焦点顕微鏡にアクセスするために加えて、線虫の培養で特定の施設だけでなく、基本的な顕微鏡のスキルが必要です。 ここに示す例では、トランスジェニックC.を利用：ユビキチンとmCherry：：：H2Bつの蛍光タンパク質、GFPを発現する線虫株 。共焦点レーザ走査型顕微鏡は、これらの2つのタンパク質の動的な局在を観察するために使用されます。さらに、我々は蛍光標識Lysotrackerの注入は受精後の胚におけるリソソームの運命を追跡するために使うことができることを示している。ラベルの付いたトラッカーの注入は、またミトコンドリアや地元のカルシウム濃度の可視化（9）のために行うことができます。理論的には、注入プロトコルは、胚の蛍光標識分子の任意のタイプを表示するために使用することができる。これは、いくつかのケースで標識した小分子、タンパク質、脂質、などが含まれる可能性がある、それはワームが取り込みなどMitoTrackerにより（10）などのいくつかの染料を容易に意志のように実際にラベルが付いたトラッカーを注入する必要はありません。しかし、我々は、浸漬とlysotrackerの注入の両方を試して、胚における可視化のための注射の方がはるかに良い結果を発見した。 技術的な考慮事項： この手順で示した技術的な課題は、マイクロインジェクション法だけでな​​く、イメージングごく初期の胚の難しさなどがあります。 microinjectionsについては、アガロースインジェクションパッドの厚さは、成功した注射のための非常に重要です。パッドが厚すぎる場合、ワームはdessicateとすぐに死んでしまう。パッドが薄すぎると、ワームは、注入プロセス中にパッドに固執しません。 初期胚は、温度やバッファ条件などの環境条件に敏感であることができる。野生型の胚は精子のDNAと減数分裂II（4）完成の分程度で前核移行の脱凝縮を開始する必要があります。 20分以内には、まず細胞質分裂が開始する必要があります。胚は非常に高いレーザー強度にさらされているか、実装時の過熱または粉砕されている場合、このプロセスが中断されることがあります。このような胚は、開発を逮捕されます。この問題が発生した場合、実験は減少し、レーザパワーや厚いアガロースパッドで繰り返される必要があります。 C. elegansの胚は、すぐに受精後までは、卵の殻を分泌しない。受精と卵の殻の分泌との間の短い時間の間に、胚は母親（11）の外で実行可能ではありません。いくつかのラボでは子宮内でイメージング胚（5、12）で、この課題を避けている。 子宮内イメージングでは、そのような中、または単に受精後に発生するイベントをキャプチャする機能など、特定の利点を提供しています。しかし、この手法は、深部組織のイメージングを可能にする顕微鏡システムを使用する必要があります。このような二光子や多光子などのシステムは、特にこの（13、14）に適しています。従来のレーザースキャンまたは回転するディスク共焦点顕微鏡を使用する場合、最良の画像は、HAその胚から得られるここで説明するようにVE成虫から切り取られて。 イメージングシステムの考慮事項： 使用される共焦点イメージングシステムの種類は、ユーザーのニーズに依存します。保管したいが、可能な限り最高の解像度で画像を取得する場合、一般的に、レーザースキャニングシステムが推奨されています。一方、回転するディスクシステムは、より良い画像取得と画像処理、高度に動的なプロセスに適している比較的急速であり、退色/光毒性が低減されます。 特定の画像処理パラメータは、実験計画や雇用の共焦点イメージングシステムに応じて異なります。多次元イメージングでは、一つには、収集対象となるチャネル、焦点面、および時間点の数を考慮する必要があります。退色や光毒性の制限の影響により、画像の有限の数は、任意の実験で取得することができます。あなたが取得するチャンネル数を増やすことを選択した場合このように、、、おそらく焦点面および/または時間のポイントとその逆の数を減らす必要があります。取得できる画像の総数は、撮像される蛍光体の強度だけでなく、使用されている共焦点顕微鏡の感度に影響されるようになります。より強い蛍光体と、より敏感な楽器は、短い露光時間を必要とするため、少ない光退色や光毒性を生成します。 多数またはイメージングシステムが利用可能です。私たちは自分の研究室で使用されているシステムに関する詳細が得られます。ディスク共焦点顕微鏡を回転させて画像のワームの胚では、プランアポ目的をNA 60X/1.4を搭載したニコンTE2000U倒立顕微鏡を使用してください。顕微鏡は、横河電機CSU10回転するディスクユニット、浜松C9100 - 13 EM CCDカメラ、および405、491、561および655 nmでの出力を持つ4つの固体レーザを含むスペクトル応用研究LMM5レーザーマージモジュールに接続されています。このシステムを使用して我々は、1つまたは2つのチャンネル、六から一二焦点面、および25から50タイムポイントを（30〜60秒間隔で）キャプチャすることができます。典型的な露光時間は100〜200ミリ秒です。 レーザー走査型共焦点顕微鏡とイメージング胚を実現するには、2チャネルと4つの固体レーザ（405、488、555、と635 nm）を装備したツァイスLSM700を使用してください。このシステムは、胚のイメージングに使用計画 - アポ63X/1.4NAの目的でツァイスAxioはオブザーバー倒立顕微鏡に接続されています。システムはまた、限られた画像処理および分析を提供する画像取得用ツァイスZENソフトウェアを使用しています。 two蛍光色素とするときには、イメージング、我々は通常、1から5の焦点面に（〜0.5μm程度離れて）収集し、Zスタックを15秒ごとに収集する。著しい退色が発生するまでのコレクションは継続されています。最終的なタイムラプスビデオを生成するには、Zスタック画像はZENソフトウェアの最大投影ツールを使用して統合されています。動画はaviファイルなどのソフトウェアからエクスポートされます。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>物</th></tr><tr><td>卵バッファ</td><td></td><td></td><td> 5mMのHepes緩衝液pH7.2、110mmの塩化ナトリウム、4mmの塩化カリウム、5mMのMgのアセテート、5mMのCaCl 2で </td></tr><tr><td> MitoTrackerにより</td><td>インビトロジェン</td><td> M - 7512 </td><td></td></tr><tr><td> Lysotracker </td><td>インビトロジェン</td><td> L - 7525 </td><td></td></tr><tr><td>注入キャピラリーピペット</td><td>ハーバード装置、ケント、イギリス</td><td> GC120F - 10 </td><td></td></tr><tr><td>ニードルプラー</td><td> Kopfは</td><td> 700Cモデル</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクター装置</td><td> Tritech研究</td><td> MINJ - 1マイクロインジェクションレギュレータ</td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse microscopy of early embryogenesis in caenorhabditis elegans

線虫は、しばしば初期の発達過程の研究におけるモデルシステムとして使用されています。胚の透明性、遺伝資源、および変換の相対的な容易さは、Cを作る資質です。初期胚発生のための優れたモデルは、 エレガンス 。レーザーベースの共焦点顕微鏡と蛍光標識タグは、研究者が胚に特異的な細胞の構造とタンパク質をフォローすることができます。例えば、一つは蛍光標識色素を使用して、そのようなリソソームやミトコンドリアなどの特定の細胞小器官を、従うことができます。これらの染料は、成体の生殖腺へのマイクロインジェクションにより初期胚に配信することができます。また、特定のタンパク質の局在は、蛍光タンパク質タグを使用して追跡することができる。例としては、蛍光リソソーム色素と同様に蛍光標識ヒストンとユビキチンタンパク質の使用例を示すここに表示されます。標識されたヒストンは、DNAを可視化するため、細胞周期の段階を識別するために使用されます。 GFP -タグ付きユビキチンは、初期胚でユビキチン化小胞のダイナミクスを明らかにする。ラベル付けリソソームとGFPの観察：：ユビキチンは、ユビキチン化さ小胞とリソソームとの間の共局在があるかどうかを判断するために使用することができます。リソソーム色素のマイクロインジェクションのための手法が提示されます。 transgenenic株を生成するための手法は（1、2）他の場所に表示されます。イメージングのために、胚は成体両性の線虫から切り取られており、標準的なレーザー走査型共焦点顕微鏡や回転するディスク共焦点顕微鏡でタイムラプス顕微鏡続いて2％アガロースパッドに装着。この方法論は、初期胚発生の高解像度可視化のために用意されています。

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Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

この記事では、線虫の胚発生の初期のイベントの可視化のための手法について説明<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;。

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

time-lapse-microscopy-of-early-embryogenesis-in-caenorhabditis-elegans

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

17.9K ビュー.  University of Alabama in Huntsville. この記事では、線虫の胚発生の初期のイベントの可視化のための手法について説明線虫（Caenorhabditis elegans）。

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Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Okay, so what I'd like to do today is to show you how to construct a flow chamber, a fusion chamber for imaging on an upright microscope. What then I then do is I create two spaces using film. So what I do is I take the para film, I cut it into small strips.Next I'm going to, this will basically form the channels for the, the walls, and I dry them with a tilted air. I put the cover slip on top of the para, And here's the finished. Then I heat it on a heat block to melt the param and basically create a seal.So what this is, is the, the cover glass here, and then on top of the cover glass is two layers of phim as you see right here. And then on top of this, again, there's a, it's a 22 by two two mil meter cover slip. This one right here, which I pressed against the param to fall the seal.Okay, so the liquid goes in in one direction here and I can suck it out with a filter paper here in this direction. And I'll show you how to do that in a bit. So what I like to do is I like to put it in a humidified chamber, which is very simple.Take two kind of elevated strips and have a filter of paper underneath. And to keep it noisy as I, I put the cover, cover slip on the flow chamber on. Now the way you introduce a solution to the chamber is that you just put the pipet tip at the entrance of the chamber and you just split.Now what I do is I incubate the chamber with the lid closed for 10 minutes. What I usually do to suck the liquid out from the other side is to use it, get a filter paper and cut it into thin strips like this. And I take one of these thin strips and I simultaneously apply the solution into the entrance while putting the filter paper at the exit to suck the exchange, the solution.So you'll see the liquid flowing through the solution. And then I wait for five minutes for the mid close. Now what I'm ready to do is to actually put that the actin it and the actin, I actually have to polymerize, I polymerize inside the flow chamber and it's just the same procedures before.So because like this, and then now that the action is polymerized, I wash out all the un excess un polymerized action using a large volume of just buffer. So here I have about a hundred microliters and it's a few reaction chamber volumes worth of buffer. Just, you know, when the filter paper becomes saturated, I have to change the direction.Okay?And so I'm ready to do imaging with this. So perfusion chamber with actin attached to it. Now I take the slide, mount it under the microscope, and since I'm imaging with an oil objective, I'm gonna put some immersion oil on the top surface of the cover, grass touch, such so assess solution or protein or anything on acting inside.So what I do is I can actually exchange the solution side while I'm doing the time lapse imaging. As such.

タイムラプス顕微鏡で分解アクチンの監視

生物学

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

アイソレーションと試験管内で</emの>活性化線虫（Caenorhabditis elegans）精子

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

タイムラプスビデオ顕微鏡を用いた細胞のランダムな移行の定量分析

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

における酸素欠乏によって誘導された仮死状態を可視化するために時間の経過顕微​​鏡の使用<em&gt; Cエレガンス</em&gt;胚

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

におけるプロスタグランジンの抽出と分析<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

SOX10中の顔面の開発の可視化：楓トランスジェニックゼブラフィッシュラインタイムラプス共焦点顕微鏡を用いて

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

タイムラプス構造照明顕微鏡のためのミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

刺激されたラマン散乱顕微鏡を用いた カエノラム型エレガンス における脂質蓄積ダイナミクスの無標識イメージング

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...