この作品は、モナッシュ大学、国民の健康および医学研究評議会とモナッシュ肺と睡眠研究所からの助成金によって賄われていた。著者は共焦点の顕微鏡検査の映像とヘルプのモナッシュ健康、ジュディ ・ キャラハン、アレックス Fulcher、Kirstin Elgass、カムデン Lo のモナッシュ マイクロ イメージング (MMI) で臨床免疫学のスタッフを感謝したいし、著者認める MMI 設備モナッシュ大学。著者は、施設、モナッシュ組織プラットフォームの科学的な技術的な支援を認めます。

このプロトコルに続く承認実験: (1) 倫理委員会のモナッシュ医療センター、および (2) メルボルン大学の倫理委員会の動物による人間。
 1 気管支肺胞洗浄 (BAL) マクロファージ <ol><li>肺マクロファージを取得する使用バル: (1) 人間は気管内吸引を用いた気管支鏡検査 6、および (2) マウスで科目 13。. 
	注意: マクロファージの獲得は一般にこれらの細胞のいくつかの活性化を引き起こします。マクロファージは潜在的な健康上の問題を調査するため, 気管支鏡検査が必要な患者から得られた、すべての科目はメッツ (これは個々 のプロジェクトごとに決定する必要があります) の解析に適したあります。
	<ol><li>フォーム ペレットにバル ソリューションとスピンダウン (500 x g で 10 分間) を取る、培 (ロズウェル パーク記念研究所中 (RPMI) 1% と 5% 牛胎児血清 L-グルタミン) 室内温度で 2 回洗浄し、文化メディ 4 ml を希釈してum</li>。
		<li>に応じて、要求の形式的な差分カウント; 細胞の大部分 (一般に &#62; 80%) マクロファージ 6 になります 。
		注: この一般にによって実行されます異なるセル タイプ 6 の形態学上の外観を使用して臨床的組織学サービス</li>。
		<li>実行可能なマクロファージ細胞はトリパン ブルー色素排除と診断使用してバル ソリューションにカウントします 。
		注: 手順 1.1 で述べたようにバル ソリューション、人間およびマウスから取得されます</li>。
		37 ° C で 24 ウェル プレートに 500 μ L の培地も、残すあたりで coverslips に 10 x <li>追加 1 4 5 マクロファージ一晩; セルは、coverslips に固執します。人間のサンプル追加抗生物質 (例えば ペニシリン、ストレプトマイシン、10 4 U/mL) 細菌汚染を防止する</li>。
	</ol></li></ol> 2。バル マクロファージの免疫蛍光ラベリング/顕微鏡的 注: 細胞がカバーガラス上守られている上記のよう。
<ol><li>は培養培地を削除し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で一度セルを洗浄します。10 分の 2% パラホルムアルデヒド/過ヨウ素酸/リジン (PLP) の定着剤でセルを修復する</li>
	<li>簡単に PBS のセルを洗浄し、0.2% permeabilize 20 分 PBS でトゥイーン 20</li>
	<li>10% 5% ウシ血清アルブミン (BSA) を 30 分 PBS で希釈した鶏血清と細胞をブロック</li>
	室温 37 (テーブルの材料 でより具体的な詳細表示) 1: 100 の濃度で 1 時間 <li>加温プライマリおよびアイソタイプ コントロール抗体 ° C 
	注: バル サンプル大食細胞の特異的マーカーは通常必要ありません</li>。
	<li>一次抗体の添加後、PBS のセルを洗浄し、さらに室温で 40 分間対応する二次抗体とインキュベートします</li>。
	<li>PBS およびレーザー励起 405、488、561 647 nm と 40 X (前述) 共焦点顕微鏡を用いた可視化のメディアを DAPI ベース マウントをマウント内のセクションを洗って、1.0 NA 石油目的</li>。
</ol> 3。肺組織検体 注: 体内 の肺組織の研究に、関連するばく露後サンプルの研究 (例えば、前述の o &#39; サリバン ら 7). この実験に最も適切な露出が伝染性の微生物、特に細菌。このメソッドに使用できるマウス系統は C57BL/6 または BALB/c マウス、10-12 週齢、体重 25-30 g、男性。
<ol><li>(400 mg/kg) ケタミン ・ キシラジン (40 mg/kg) の腹腔内注射での安楽死マウス。胸腔内を開き、肺と心臓手術用鉗子、はさみを使用して公開します。
	<ol><li>30 の血管から血液を洗浄する右心室に 21 ゲージ針を使用して温かみのある PBS を吹き込む s、30 の 2 %plp 固定液 10 mL を注入 (右心室) に s.</li>
		<li>を使って開いて胸腔洗浄暖かい PBS (42 ° C)。21 g 針と大きさに切った 0.8 mm チューブを気管挿管し、800 μ L (42 ° C) に予め温めておいたを注入、低融点アガロース溶液の 3% をポイントします</li>。
		<li>ネクタイは、編みシルク (4.0 USP) と気管をオフします。スレッド、カニューレの挿入ポイントのすぐ下の気管の周りに置き、シンプルなオーバーハンド ノットを介して固定します。Agarose を固める、肺の周りの氷冷 PBS を管理します。肺と心臓をはさみと鈍的切離を使用して胸腔内からブロックとして削除します。個別に各肺を削除し、2 の 16 h のため修正 %plp またはホルマリン 4 ° C</li>
		<li>は PBS の標本をティッシュまで 4 ° C で保存します。肺組織を取得するこれらのメソッドは、上記 13 きた</li>。
	</ol></li> <li>肺組織を準備するサンプルは、次の手順を使用します。
	<ol><li>室温で 24 時間 10% 天然緩衝ホルマリンで修正肺組織 (3.1 の手順で切除)。75% エタノールに転送し、入れてティッシュ プロセッサ (2.5 h 75% エタノール、無水エタノールで 3 h、3.5 h 溶剤 3 b、パラフィンで 3 h) 12 時間サイクルで</li>。
		室温で保存されているホルマリン固定のパラフィン埋め込まれたの (FFPE) ブロックを作成する標準的なパラフィンで <li>埋め込み 。
		注: この段階でそれは一般に標準的なスライドの肺のセクションをカットする便利な</li>。
		<li>ミクロトームを使用して 4-5 μ m の厚みで FFPE 肺セクションをカットし、充電されると、スライドに塗った O で前述のようにマウント &#39; サリバン ら 7</li> <li>スライドをマウント、coverslips 60 × 24 mm (サイズ 1.5) にメディアをマウントの 3 滴を入れ、上のスライドを反転、余分なメディアを押し出します。密閉マニキュアで密封し、常温で保存します</li>。
	</ol></li></ol> 4。肺組織のサンプルの準備/顕微鏡 <ol><li>デ ワックス、水分補給、抗原検索ソリューションの FFPE 肺の組織サンプルを前処理します。
	<ol><li>乾燥オーブン、FFPE スライド 60 ° C で 60 分室温で 5 分間 70% エタノール溶液に 30 分と転送のキシレン溶液でスライドを置きます。水道水でリンスします</li>。
		<li>場所耐熱ラップであり、10 で 10 分間圧力鍋で HIER 抗原検索 m/mol/L トリス、1 モル/EDTA pH 9.0。20 分洗浄 5 分にロッカーの上、一度 PBS でロッカーの水道水の 2 倍のために涼しい</li>。
		<li>ブロック 5% 10% 鶏血清中の部屋の温度で 30 分間 BSA/PBS</li>。
	</ol></li> <li>組織を染色します。
	<ol>マクロファージにおけるメッツを定義、1% の一次抗体 (MMP 9、H3Cit、および F4/80) を追加 <li>BSA/PBS (抗体量に関する特定の詳細は 表の資料 に記載されて) 1/100 倍希釈液を 4 ° C で 16 時間。ロッカー上で 5 分間 PBS で 2 回洗って</li>。
		<li>対応するセカンダリと孵化によって達成する蛍光検出抗体 1 %bsa/PBS 室温で 40 分。抗体: (1) 鶏反マウス 488 (緑)、(2) 鶏の反やぎ 594 (赤) とロバ (3) 抗マウス (遠赤) 647</li>。
		<li>PBS および DAPI 含むクロマチンの汚損のためメディアをマウントをマウント内のセクションを洗うです</li>。
	</ol></li> <li>頭倒立顕微鏡に接続を走査型共焦点レーザーによる蛍光画像を取得します。
	<ol><li>エキサイト 405, 488, 561, 647 と準備 nm のレーザーです。線順次をクリックして単一の平面の 512 x 512 ピクセルの画像をキャプチャ、20 X 0.1 を使用して (2 ラインの平均) ボタンを平準化 NA 空気と 40 X 1.0 NA オイル目標</li>。
		<li>それぞれの結果 (すなわち、10 高出力フィールドの (HFOV) コントロールのビュー、刺激のサンプルのため など、それぞれのマウスの 10) のデータと分析のセクションごとの少なくとも 10 のフィールドの表示を取得します 。
		注: フィールド全体の代表的なサンプルを得るためには、マトリックス システム使用できますにフィールドが分割にさまざまなセクションと同じ行列を使用してビューのフィールドを選択各別のサンプルのため (例えば フィールドは 9 セクションに分けることができ、2 つ HFOV の撮影中心、4 つのコーナーから).</li>
	</ol></li></ol> 5。三次元 (3 D) 画像のメッツ 注: メッツは 3次元構造、複数 z スタックで、再構成、画像は貴重な情報を与える可能性があります。
<ol><li>1.8 mm、0.1 から 0.5 の速度振幅で、vibratome を使用して 200 μ m でのパラフィン ブロックから肺標本をセクション mm/s.</li>
	<li>それぞれ血清 (10% 牛胎児血清と 10% 鶏血清) の 20% に肺組織をブロックし、補われる PBS で 3.75 %permeabilize 穏やかな動揺の下で室温で 7 h のトリトン X 100 です</li>。
	<li>(抗体濃度は 表の資料 に記載されて) マイクロ遠心チューブ用の 200 μ L のボリュームに関連する一次抗体 (MMP 9、H3Cit、および F4/80) 4 ° C で 16 時間のセクションを染色します</li>。
	<li>Pbs は、1 時間室温で関連する二次抗体とインキュベートする前に 10 分の 3 回のセクションを洗う</li>
	<li>PBS でスライドを顕微鏡にカバー スリップを追加する前に 20 分のためのソリューションの DAPI (1:5, 000) のため肺のセクションを染色します</li>。
	<li>倒立共焦点顕微鏡 (40 × 1.3 NA) 405 装備を用いた蛍光画像を取得 440 nm nm、473 nm、543 nm ・ 635 nm レーザー</li>。
	<li>40 × 1.3 NA 石油目的のための最適な z 区分と 0.54 μ m の厚みの 3-D z スタックを記録します 。
	注: 個々 の顕微鏡によって使用されるソフトウェアが異なります。補足ファイル 1 で 1 つの顕微鏡のためのソフトウェアの使用方法の例を提供します</li>。
</ol> 6。画像解析 注: 試料の分析は特定のイメージング解析ソフトウェアの使用を必要とし、材料表 の例のとおりです。記載されている以下の点が重要な結果の分析に使用される特定のプログラムに依存している間です。
<ol><li>バル分析サンプル DAPI の青のチャネルを選択し、セルの最小サイズを割り当てることによって <ol><li>マクロファージ数の定義 (例えば、&#62; 直径 18 μ m)。フィールドごとの大食細胞の総数を測定関連のソフトウェアを使用しています</li>。
		<li>は、他のマーカー (例えば MMP12、PAD2、および H3Cit) の共発現で DAPI によって検出された細胞のクロマチンの存在によって、メットの特徴を持つセルの数をカウントします 。
		注: 分析できるマーカー数利用できるレーザーの数によって異なりますが、理想的な DAPI、に加えて他の少なくとも 2 つのマーカーを含めるべき。他以下の MET の過剰発現 (例えば, 細胞クロマチンと拡大核細胞数) のための特定のパラメーターを使用できます</li>。
		<li>バルで、MET の過剰発現を比較する (コントロール、煙、煙/DNase 処理グループと)、サンプル分析サンプルあたり 100 バル マクロファージの最小します</li>。
		二次抗体とアイソタイプを測定する <li>蛍光性のレベルを制御; 各サンプルの蛍光性のための 100 のセルの最小値を測定します。(例えば H3Cit) の各マーカーの蛍光バック グラウンドの平均レベルを測定標準のソフトウェアを使用しています</li>。
		MET の式を定義する <li>(例えば H3Cit、MMP9 の共発現と細胞のクロマチン) 典型的な表現型と細胞をカウントし、各 MET の (例えば H3Cit、MMP9) マーカーの蛍光性のレベルを測定します。背景とアイソタイプ コントロールの上ではなかった自分を汚す場合メッツを産生する細胞を除外します</li>。
		<li>人間のバル サンプルのメッツをするマクロファージの割合については各サンプルの 100 セルの最小値を分析します。マウスのサンプルの細胞は小さく、メッツを定義するは難しいと分析 (例えば、200 のマクロファージ) の各サンプルに対して細胞の大きい数</li>。
	</ol></li> <li>肺組織検体の解析 <ol><li>肺組織のメッツの存在を決定する F4/80 など特定の大食細胞のマーカーを使用します</li>。
		<li>肺組織のセクション 6.1 を参照に記載されている他のパラメーターと細胞クロマチンを発現する細胞の F4/80 の共局在を使用してメッツの存在を定義します</li>。
		<li>は、二次抗体とサンプルの背景の蛍光性のレベルおよびアイソタイプ コントロールを決定します。メッツを背景の上は解析から除外します</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin?.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?.</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).</li><li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+balancing:+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases.">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers immunol. 4, 1 (2013).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. 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D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).</li><li>Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PAD4+in+NET+formation.">Activation of PAD4 in NET formation.</a> Front Immunol. 3, 360 (2012).</li><li>Lewis, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PAD4+activity+is+sufficient+to+disrupt+mouse+and+human+NET+formation.">Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation.</a> Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).</li><li>Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+the+IL-6+Trans-Signaling/Mechanistic+Target+of+Rapamycin+Complex+1+Axis+in+Pulmonary+Emphysema.">Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema.</a> Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).</li><li>Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps.">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell host &amp; microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li><li>Wong, K. W., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+exploits+human+interferon+gamma+to+stimulate+macrophage+extracellular+trap+formation+and+necrosis.">Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis.</a> J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).</li></ol>

著者はこの作品に関して開示があります。

このレビューで説明している手法はネット14の存在を定義するために使用しました。マクロファージは、バルのサンプルで支配的なセルの種類とコレクションのこのメソッドは、メッツを勉強するために最適です。赤血球が、バルの存在する場合、これらの細胞は塩化アンモニウムを使用して分離する必要があります。バル プロシージャが一般にマクロファージをアクティブにし、メッツ非刺激のサンプル中に存在すると期待されます。バル マクロファージは通常非常に付着です。バル マクロファージ一般的に必要はありません特定のマーカーとしてこれらの細胞支配的なセルの種類は、その形態によっても区別することができます。バル、80% の細胞がマクロファージ (と好中球が 5% 未満) より大きいの通常、洗浄後、一般的に付着性の白血球の (すなわちマクロファージ) の6まま。ヒトの好中球とマクロファージを区別する能力に疑問がある場合好中球エラスターゼなど好中球マーカーを使用することがあります。肺組織、大食細胞は他の細胞の種類を区別することは困難、特定のマクロファージのマーカー (例えばF4/80) が必要です。マクロファージが自動蛍光をあるので、背景とアイソタイプ コントロールの使用は重要である;これは、特に刺激のサンプル ケースです。
メッツの存在を定義する最良の方法はまだ未定します。特定経路/プロセス、好中球とマクロファージの両方に共通である: (1) 粒状プロテアーゼ、ヒストン、および (3) パッドの (2) シトルリン。その PAD4 は好中球の PAD2 が単球/マクロファージで目立つです。F4/80 の使用はマウスのマクロファージの広く受け入れられたマーカーがヒトのマクロファージは、このような明確に定義されたマーカーを持っていないと MET の過剰発現のひと肺組織を評価するとき、これは問題が発生します。他の多くの細胞型とメッツは、肺胞壁にプッシュする傾向がある肺組織における MET 発現解析が難しくなります。場合は断面のフラット、メッツは視覚化に最適ティッシュ セクションを分析する場合メッツがどう、メットが困難になる可能性があります別の平面にある場合があります。この問題は、z-スタック メッツとさまざまな側面でのメッツを可視化する可能性を検査するためのより深い組織 (3 D) 面を有効にすることである程度対処できます。
肺サンプルでメッツの存在を定義するための広く受け入れられた方法がないです。説明の方法は、ネットを可視化するために使用されているものに基づいています。チョウら説明マイトジェン PMA には、マクロファージ細胞株でメッツが誘導される細胞クロマチン15の存在により評価しました。その後の研究は、結核によるメッツのin vitro における細胞クロマチンと H3Cit16の存在によって定義されていることを示した。私たちを示している生体内で糸球体腎炎モデルにおけるメッツが腎臓共局在ミエロペルオキシダーゼ、ヒストンやクロマチン7で定義されているように存在しています。最後に、我々 は細胞のクロマチンと MMP126の組み合わせでメッツの in vitroひと肺マクロファージの存在を実証しました。私たちのメソッドは、この炎症反応の重要なファセットを研究する他の研究者によって使用できます。
慢性炎症性疾患で重要な役割を持っていることメッツは認めそうです。NETosis につながるプロセスがまだよく定義されていません。メッツの研究トラップ形成のメカニズムに重要な洞察力があります。それ以上のマーカーとプロトコルの開発とメッツの機能に関する研究はさらに病でメッツの役割を定義が。
我々 はこのプロトコルで識別した重要なステップがあります。人間のバル サンプルが細菌の二次汚染を持っている可能性が、培地に抗生物質の使用は汚染を制限するため重要です。第一次および二次抗体の蛍光は、製造元が同じでも異なります。最後に、肺組織検体の分析、バル サンプルより複雑、標準化されたアプローチを開発する時間が必要です。

好中球細胞外トラップ (ネット)、最初ブリンクマンらによって記述されていた1彼らは (特に細菌) への感染への応答で主に作り出され、ホストの防衛1,2で重要な役割を持っています。彼らは、非感染性疾患、血管炎、全身性エリテマトーデス (SLE); などへの応答で発生することも記載されています。・ マイトジェン ホルボール 12 myrisate 13-アセタート (PMA)2,3。最近、他の細胞型が大食細胞を含む細胞外のトラップを生成しても認識されています。マクロファージ細胞外トラップ (メッツ) はまだ文学4,5で明確に定義されたエンティティではありません。メッツの存在を検出するためのメソッドも確立の in vitroとin vivoの6,7。この記事でメッツの共焦点顕微鏡を用いた測定が表示されます。
(アポトーシス8) など他の細胞細道からそれを区別する NETosis の主な機能はクロマチンと組み合わせての押出: ヒストン (H3Cit)9のシトルリン (1)、(2) 顆粒プロテアーゼ10 の共発現、ペプチジル アルギニン アルギニンデイミナーゼ (PAD) 4 の (3) の関与11,12。マクロファージはまた H3Cit、顆粒プロテアーゼおよびパッドを表現し、メッツの存在を定義するこれらの機能を使用することができます。
メッツは、肺胞と肺の気道内に存在の支配的な細胞のマクロファージで、感染症/炎症細胞性免疫応答を監督の初期のロールとして、肺の特に重要な役割があります。また、肺の大部分は空スペース (例えば肺胞内) が、メッツは空き領域、固形臓器とは対照的に拡大する可能性があること。
共焦点顕微鏡は網の存在を定義する最も広く使われている方法です。まだでは、メッツを測定する明確に定義された方法はないです。ネットの測定法は、このプロトコルではメッツの存在を測定に適応されています。このメソッドの主な要件は、共焦点の顕微鏡検査および適切なイメージング ソフトウェアにアクセスし分析。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human samples: Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB5103</td>
			<td>10 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human MMP12</td>
			<td>Novus Biological</td>
			<td>NB110-57214</td>
			<td>1:100 concentration not quantifiable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human MMP9</td>
			<td>Novus Biological</td>
			<td>AB119906</td>
			<td>1:200 ascites, no concentration given</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human PADI2/PAD2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB16478</td>
			<td>7 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human PADI4/PAD4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB128086</td>
			<td>10.1 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NE</td>
			<td>LifeSpan Bioscience</td>
			<td>LS-B4244</td>
			<td>25 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse samples: Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse MMP9</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AF909</td>
			<td>10 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB5103</td>
			<td>10 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse F4/80</td>
			<td>In-house (hybridoma)</td>
			<td>In house</td>
			<td>20 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human Anti-HNE /NE</td>
			<td>Sapphire Bioscience</td>
			<td>LS-B4244</td>
			<td>25 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human &#173;&#173;&#173;&#173;PADI4/PAD4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB128086</td>
			<td>10.1 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super-frost plus slides</td>
			<td>Menzel</td>
			<td>S41104A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi-prolong gold</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-rabbit AF 488/</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-rabbit AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-goat AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>a-21468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-mouse AF488</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-mouse AF 647</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>550878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Programs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1 Confocal scanning microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV1200 Confocal scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue sources</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>r8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan black</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K2753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>42904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>327204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent 3B</td>
			<td>Hi-Chem</td>
			<td>2026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 12 ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 x 24 ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c57 black 6</td>
			<td>Monash animal research platform (MARP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c</td>
			<td>MARP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy

好中球細胞外トラップ (網) の存在を定義するために使用する主な方法は、共焦点顕微鏡です。確立された共焦点顕微鏡によるマクロファージ細胞外トラップ (メッツ) を可視化する方法を変更しました。これらの細胞外のトラップは、顆粒プロテアーゼ、シトルリン化ヒストン ペプチジル アルギナーゼ アルギニンデイミナーゼ (PAD) などの他のコンポーネントの共発現細胞クロマチンの存在によって定義されます。メッツの式は一般的に刺激への暴露後に測定し、非刺激のサンプルと比較しています。サンプルは背景とアイソタイプ コントロールの含まれています。細胞を分析するには、明確に定義された画像解析ソフトを用いてします。メッツの存在を定義する共焦点顕微鏡を使用することがあります体外と体内の肺組織の両方。

メッツは、バル サンプル、肺組織、3次元画像でより厚い肺セクションからビジュアル化する可能性があります。メッツ バル サンプルの可視化の例は、図 1に示すです。メッツの形態は、成熟の段階によって異なります。顕微鏡の最初の検出機能は、セルの端に核の運動です。その後に、H3Cit と顆粒のプロテアーゼなどの他の共発現メディエーターの細胞クロマチンが続きます。以前の段階でセルはまだ表現される細胞外トラップでほぼ球形の形に。後の段階で会った形成は細胞体の伸びが特徴です。
肺組織メッツは図 2のとおりです。肺は、肺のアーキテクチャを定義する流体に水増しは、メッツは、肺胞の壁に対して一般的にプッシュされます。メッツの形態は、カットされた面組織によっても異なります。肺組織検体に使用される標準的な断面は、厚さ 4-5 μ m です。厚い切片がべきである複数の画像を有効にして、メッツを 3d で表示できます。抗体は肺組織にはこれまで突き通るのみ、25-50 μ m の切片厚が最適です。図 3に、ビデオ 1で, 3次元画像の例です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig1.jpg"> 
図 1: バル メッツ。開発のさまざまな段階で刺激後に形成された人間のバル メッツです。メッツは H3Cit、MMP9 の共発現と細胞のクロマチンに特徴づけられました。クロマチン (A)、(B) H3Cit (C) MMP9、(D) 結合されたイメージの染色。パネルの挿入、アイソタイプ コントロールです。スケール バー = 10 μ m (アイソタイプの 15 μ m)。初期メットは右上隅で、ほぼ球形の形をしています。成熟したメットがフィールドの真ん中に表示されます。画像は、レーザー走査型共焦点顕微鏡と 40 x 1.0 NA 石油目的を使用して撮影されました。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56459/56459fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig2.jpg"> 
図 2: 肺組織メッツ。マウス メッツ刺激後の肺組織の。メッツは、(大食細胞マーカー) として H3Cit、MMP9、F4/80 の共発現と細胞のクロマチンによって特徴付けされています。パネル (A) メッツ; の数を測定するために使用の典型的な高出力フィールドのビューを示しています。パネル (B-F) は、高倍率の下で破線の正方形領域を示します。(F)、(E) F4/80、(D) MMP9 (C) H3Cit (B) クロマチン結合されたイメージの染色。[挿入] パネルは、アイソタイプ コントロールです。スケール バー = 20 μ m (アイソタイプの 20 μ m)。メッツは、肺胞の壁に対して一般的に押されます。画像は、レーザー走査型共焦点顕微鏡と 40 × 1.3 NA 石油目的を使用して撮影されました。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56459/56459fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig3.jpg"> 
図 3: 肺セクションの三次元ビュー 。マウス肺組織は修正され、25-35 μ m 厚いセクションにカットします。組織はメッツのマーカーの付いた、1 μ m の厚みでセクションをイメージします。画像は、メトロポリタンの 3次元画像を作成する z スタックと組み合わせていた。画像は、レーザー走査型共焦点顕微鏡と 40 × 1.3 NA 石油目的を使用して撮影されました。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56459/56459fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/56459/56459video1.jpg"> 
ビデオ 1: 肺セクションの三次元ビュー 。ビデオは、図 3で紹介するサンプルに対応します。軸の目盛 = 5 μ m.<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56459/Mets_1.avi" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>

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Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

マクロファージ細胞外トラップは、新しく記述されたエンティティです。この資料に共焦点の顕微鏡検査方法に集中して体外と体内の肺検体から可視化方法します。

共焦点顕微鏡を用いた可視化マクロファージ細胞外トラップ

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

visualizing-macrophage-extracellular-traps-using-confocal-microscopy

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K ビュー.  Monash Medical Centre. マクロファージ細胞外トラップは、新しく記述されたエンティティです。この資料に共焦点の顕微鏡検査方法に集中して体外と体内の肺検体から可視化方法します。

ビデオ: Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

好中球細胞外トラップ：それらを生成して可視化する方法

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

免疫・感染学

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

HIVとライブ共焦点顕微鏡の蛍光クローンを使用して、HIVの可視化細胞間伝達

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

脾臓の生体顕微鏡検査：寄生虫モビリティと血流​​の定量的解析

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

の非溶解性エキソサイトーシスの可視化<em&gt;クリプトコッカス·ネオフォルマンス</em&gt;デジタル光学顕微鏡を使用したマクロファージから

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role in fighting infections, recent research has demonstrated that they may be involved in many other disease processes, including cancer progression. Isolating purified NETs is a crucial element to allow the study of these functions.
In this video, we demonstrate a simplified method of cell free NET isolation from human whole blood using readily available reagents. Isolated NETs can then be used for immunofluorescence staining, blotting or various functional assays. This enables an assessment of their biologic properties in the absence of the potential confounding effects of neutrophils themselves.
A density gradient separation technique is employed to isolate neutrophils from healthy donor whole blood. Isolated neutrophils are then stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce NETosis. Activated neutrophils are then discarded, and a cell-free NET stock is obtained.
We then demonstrate how isolated NETs can be used in an adhesion assay with A549 human lung cancer cells. The NET stock is used to coat the wells of a 96 well cell culture plate O/N, and after ensuring an adequate NET monolayer formation on the bottom of the wells, CFSE labeled A549 cells are added. Adherent cells are quantified using a Nikon TE300 fluorescent microscope. In some wells, 1000U DNAse1 is added 10 min before counting to degrade NETs

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

In the following protocol, we describe a very simple way to isolate Neutrophil Extracellular traps (NETs) from human whole blood using readily available reagents. We then demonstrate how the isolated NETs can be used in an in vitro adhesion assay with cancer cells.

簡体ヒト好中球細胞外トラップ（のNET）の単離と取扱い

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

蛍光寿命イメージングによる細胞内のスネアを可視化

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

NETQUANTを用いた好中球細胞トラップの自動画像ベース定量

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, periodontitis, mucosal infections and, most notably, early childhood caries. In all of these conditions, the pH in the biofilm matrix impacts microbe-host interactions and thus the disease progression. The present protocol describes a confocal microscopy-based method to monitor pH dynamics inside cross-kingdom biofilms comprising Candida albicans and Streptococcus mutans. The pH-dependent dual-emission spectrum and the staining properties of the ratiometric probe C-SNARF-4 are exploited to determine drops in pH in extracellular areas of the biofilms. Use of pH ratiometry with the probe requires a meticulous choice of imaging parameters, a thorough calibration of the dye, and careful, threshold-based post-processing of the image data. When used correctly, the technique allows for the rapid assessment of extracellular pH in different areas of a biofilm and thus the monitoring of both horizontal and vertical pH gradients over time. While the use of confocal microscopy limits Z-profiling to thin biofilms of 75 &#181;m or less, the use of pH ratiometry is ideally suited for the noninvasive study of an important virulence factor in cross-kingdom biofilms.

The protocol describes the cultivation of cross-kingdom biofilms consisting of Candida albicans and Streptococcus mutans and presents a confocal microscopy-based method for the monitoring of extracellular pH inside these biofilms.

共焦点顕微鏡を用いたクロスキングダムバイオフィルムの細胞外pHのモニタリング

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by neutrophils in response to systemic inflammation or pathogens. Although NETs have previously been shown to augment clot formation and inhibit fibrinolysis in humans and dogs, the role of NETs in cats with cardiogenic arterial thromboembolism (CATE), a life-threatening complication secondary to hypertrophic cardiomyopathy, is unknown. A standardized method to identify and quantify NETs in cardiogenic arterial thrombi in cats will advance our understanding of their pathological role in CATE. Here, we describe a technique to identify NETs in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded thrombi within the aortic bifurcation, extracted during necropsy. Following deparaffinization with xylene, aortic sections underwent indirect heat-induced antigen retrieval. Sections were then blocked, permeabilized, and ex vivo NETs were identified by colocalization of cell-free DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), and neutrophil elastase (NE) using immunofluorescence microscopy. To optimize the immunodetection of NETs in thrombi, autofluorescence of tissue elements was limited by using an autofluorescence quenching process prior to microscopy. This technique could be a useful tool to study NETs and thrombosis in other species and offers new insights into the pathophysiology of this complex condition.

We describe a method to identify neutrophil extracellular traps (NETs) in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded feline cardiogenic arterial thrombi using heat-induced antigen retrieval and a double immunolabeling protocol.