עבודה זו מומן על ידי מענקים אוניברסיטת מונש, הבריאות הלאומיים, המועצה למחקר רפואי, ריאות מונש ואת מכון שינה. המחברים רוצה להודות לצוות אימונולוגיה קלינית בבית הבריאות מונש, ג'ודי קלהאן, אלכס פולקו, השולחן שלי Elgass ו קמדן Lo של מונש מיקרו הדמיה (MMI) לעזרה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית הדמיה, ולהכיר המחברים את המתקנים MMI אוניברסיטת מונש. המחברים להכיר את מתקני וסיוע המדעית והטכנית של פלטפורמת היסטולוגיה מונש.

פרוטוקול זה בעקבות ניסויים אושרה: (1) בני אדם לפי האתיקה הוועדה של מונש מרכז רפואי וכן בעלי חיים (2) על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת מלבורן.
 1. מקרופאגים Bronchoalveolar שטיפה (BAL) <ol><li>BAL שימוש כדי להשיג מקרופאגים ריאות ב: (1) האדם נושאים על ידי ברונכוסקופיה 6 ו- (2) עכברים באמצעות שאיפה אינטרה-הנשימה 13 . 
	הערה: רכישת המקרופאגים גורמת בדרך כלל יש הפעלה של תאים אלה. מקרופאגים מתקבלים מן חולים הזקוקים ברונכוסקופיה לחקור בעיה רפואית פוטנציאלית ועוד נושאים לא כל יכול להיות מתאים לניתוח של המטס (יהיה צורך לקבוע עבור כל פרוייקט בודדים).
	<ol><li>קח את פתרון BAL ו ספין למטה (500 x g 10 דקות) לטופס גלולה, לשטוף פעמיים עם תרבות בינוני (רוזוול פארק אנדרטת מכון בינוני (RPMI) עם סרום עגל העוברי 5%, 1%-גלוטמין) בטמפרטורת החדר, ואז לדלל תאים 4 מ של תרבות medi המ.</li>
		<li>במידת הצורך, בקשה רשמית ספירה מבדלת; רוב התאים (בדרך כלל &#62; 80%) יהיה מקרופאגים 6. 
		הערה: זה בדרך כלל יבוצעו על ידי שירות היסטולוגיה קליניים באמצעות המראה מורפולוגיות של סוגי תאים שונים 6.</li>
		<li>בצע תא מקרופאג קיימא לסמוך על הפתרון BAL באמצעות הדרה Trypan blue ו- hemocytometer. 
		הערה: BAL מתקבל פתרון של בני אדם ועכברים כאמור בשלב 1.1.</li>
		<li>הוסף 1-4 x 10 מקרופאגים 5 כדי. ובכן 24 צלחות על coverslips ב 500 µL של תרבות בינוני לכל טוב ולהשאיר לילה ב 37 מעלות צלזיוס; התאים מקנא coverslips. לדוגמאות אנושי, להוסיף אנטיביוטיקה (למשל, פניצילין, סטרפטומיצין, 10 4 U/mL) כדי למנוע זיהום חיידקי.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunofluorescence Labeling/מיקרוסקופיה של מקרופאגים BAL הערה: תאים מתקיימים על coverslips כאמור לעיל-
<ol><li>להסיר את המדיום תרבות ולשטוף את התאים פעם עם פוספט buffered סליין (הציבורי). לתקן תאים לשבועיים paraformaldehyde/periodate/ליזין (פיפ) 2% במשך 10 דקות</li>
	<li>לשטוף את התאים לזמן קצר ב- PBS ולאחר מכן permeabilize ב- 0.2% 20 Tween ב- PBS במשך 20 דקות</li>
	<li>גוש תאים עם 10% עוף sera ב- 5% שור אלבומין (BSA) מדולל ב- PBS במשך 30 דקות</li>
	נוגדנים <li>Incubate עם שליטה ראשי ו isotype לשעה בטמפרטורת החדר בריכוזים בטחונות (פרטים ספציפיים יותר מפורטים בטבלה של חומרים) ב- 37 מעלות צלזיוס. 
	הערה: עבור הדגימות BAL, סמן ספציפי של מקרופאגים נדרש בדרך כלל לא.</li>
	<li>לאחר התוספת של נוגדנים העיקרי, לשטוף את התאים ב- PBS, דגירה נוסף עם נוגדנים משניים המתאימים למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לרחוץ בסעיפים PBS ו הר דאפי מבוססי הרכבה בינונית להמחשת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (כאמור לעיל) לייזר excitations 647 561, 488, 405 ננומטר, 40 X, נה 1.0 שמן המטרה.</li>
</ol> 3. דגימות רקמה בריאה הערה: ויוו במחקרי של רקמת הריאה, לומדים את הדוגמאות לאחר חשיפת הרלוונטי (למשל, כפי שתואר על ידי O &#39; סאליבן. et al. 7). החשיפה הרלוונטי ביותר עבור ניסוי זה הם אורגניזמים זיהומיות, בעיקר חיידקים. זנים העכבר יכול לשמש עבור שיטה זו הם עכברים C57BL/6 או BALB/c, בן 10-12 שבועות, משקל 25-30 גרם וזכר.
<ol><li>Euthanize עכברים, באמצעות הזרקה בקרום הבטן של קטאמין (400 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (40 מ"ג/ק"ג). פתח את חלל בית החזה, לחשוף את הריאות והלב באמצעות מלקחיים כירורגיים ומספריים.
	<ol><li>להשרות PBS חמים באמצעות מחט 21-מד לתוך החדר הימני כדי לשטוף את הדם מכלי הדם ב-30 s, ואז להשרות 10 מ"ל של 2% מקבע פיפ ב-30 (לתוך החדר הימני).</li>
		<li>להשתמש חמים PBS (42 ° C) שטיפת בחלל החזה פתוח. לצנרר קנה הנשימה עם מחט 21-מד וחתיכת אבובים 0.8 מ מ חיתוך לפי מידה, להזריק µL 800 של ומחוממת מראש (עד 42 ° C), התכה נמוכה הצבע 3% agarose פתרון.</li>
		<li>העניבה off קנה הנשימה במשי קלועה (4.0 USP). מניחים את החוט סביב קנה הנשימה, מתחת נקודת הכניסה של הצינורית, ואבטח אותו באמצעות קשר בוהן פשוט. כדי לחזק את agarose, לנהל PBS קר כקרח סביב הריאות. הסר את הריאות והלב כבלוק בחלל בית-החזה בעזרת מספריים והן עמום. להסיר את כל הריאה בנפרד ולתקן אותם ואז עבור 16 h ב- 2% פיפ או פורמלין ב-4 מעלות צלזיוס</li>
		<li>לאחסן את דגימות PBS ב 4 ° C עד רקמות חלוקתה. אלה שיטות לקבלת רקמת הריאה היה שתואר לעיל 13.</li>
	</ol></li> <li>להכין את רקמת הריאה דגימות השתמש בשלבים הבאים.
	<ol><li>תיקון רקמת הריאה רקמות (resected בשלב 3.1) בפורמלין באגירה טבעי 10% במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. להעביר 75% אתנול ולשים במעבד רקמות על מחזור של 12 שעות, (2.5 h ב- 75% EtOH, 3 h ב- EtOH מוחלטת, 3.5 h ב- 3B הממס, ובמשך 3 h בפרפין).</li>
		<li>הטבע בפרפין סטנדרטי כדי ליצור בלוקים (FFPE) פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע, אשר מאוחסנים בטמפרטורת החדר. 
		הערה: בשלב זה, זה בדרך כלל נוח לחתוך הסעיפים ריאות עבור שקופיות רגילה.</li>
		<li>לחתוך הסעיפים הריאה FFPE-4-5 מיקרומטר עובי באמצעות מיקרוטום והר טעונה, מצופה שקופיות כאמור מתוארת על ידי O &#39; סאליבן. et al. 7</li> <li>הר שקופיות, לשים 3 טיפות של הרכבה בינונית על coverslips 60 מ"מ x 24 מ"מ (גודל 1.5), היפוך השקופית על coverslip ולדחוף את עודף בינוני. הרמטית לאטום עם לק ולאחסן בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li></ol> 4. הכנה/מיקרוסקופיה של דגימות רקמה בריאה <ol><li>דה-שעווה, נוזלים, pretreat המדגם רקמת הריאה FFPE עם אנטיגן אחזור פתרון.
	<ol><li>התנור יבש FFPE שקופיות עבור 60 דקות ב 60 מעלות צלזיוס. אז לשים את השקופיות בפתרון קסילן במשך 30 דקות והעברת לפתרון אתנול 70% למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף במי ברז.</li>
		<li>המקום חום הוכחה ניילון נצמד ובכפוף חיר-אנטיגן אחזור בסיר לחץ במשך 10 דקות 10 מ'/מול/ליטר טריס, pH 1 mmol/EDTA 9.0. מגניב עבור 20 דק לשטוף פעמיים במי ברז למשך 5 דקות על כיסא נדנדה, אז פעם אחת עם PBS על הנדנדה.</li>
		<li>בלוק עם הנסיוב עוף 10% 5% BSA/PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li> <li>מכתים את הרקמה.
	<ol><li>להגדיר המטס מקרופאגים, להוסיף ראשי נוגדנים (MMP-9, H3Cit ו- F4/80) 1% BSA/PBS עבור h 16 ב 4 ° C-דילול 1/100 (פרטים ספציפיים לגבי כמויות נוגדן מוצגים בטבלה של חומרים). תשטוף פעמיים עם PBS למשך 5 דקות על כיסא נדנדה.</li>
		נוגדנים <li>להשיג זיהוי פלורסנט על ידי דגירה עם משני המתאים 1% BSA/PBS למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר. נוגדנים הם: (1) עוף אנטי עכבר 488 (ירוק), (2) עוף אנטי-עז 594 (אדום), ועכבר (3) חמור נגד 647 (אדום רחוק).</li>
		<li>לרחוץ בסעיפים PBS ו הר המכילות דאפי הרכבה בינונית עבור צביעת כרומטין.</li>
	</ol></li> <li>להשיג פלורסנט תמונות באמצעות לייזר קונפוקלי סריקת הראש מחובר במיקרוסקופ הפוכה.
	<ol><li>להלהיב ההכנה עם 405, 488, 561 647 ננומטר לייזר. ללכוד תמונות פיקסל 512 x 512 מטוס יחיד על ידי לחיצה על הקו-רציפים, בהחלקה לחצן (בממוצע קו 2) באמצעות 20 X 0.1 והאוויר נה נה 40 X 1.0 שמן מטרות.</li>
		<li>לקבל לפחות 10 שדות ראייה לכל מקטע עבור ניתוח נתונים עבור כל תוצאה (קרי, 10 ובעוצמת שדות ראייה (HFOV) עבור הפקד, 10 עבור מדגם מגורה, וכדומה, עבור כל עכבר). 
		הערה: כדי לקבל במדגם מייצג של כל השדה, מטריצה המערכת יכולים לשמש אשר מחולק השדה לתוך מקטעים שונים עבור כל דגימה שונה המטריקס באותו משמש כדי לבחור שדות ראייה (למשל, השדה יכול להיות מחולק למקטעים 9 ומועברים למרכז, 4 הפינות, שני HFOV).</li>
	</ol></li></ol> 5. תלת-ממדיים (3-D) הדמיה של המטס הערה: כפי. המטס מבנים תלת-ממדיים, על ידי לקיחת z מרובים-מחסנית תמונות, אשר הם מחדש, רשאי למסור מידע בעל ערך.
<ol><li>סעיף דגימות ריאות מבלוקים פרפין, על שימוש vibratome בבית משרעת שוכן בגובה 1.8 מ"מ ומהירות של 0.1-0.5 מיקרומטר 200 מ"מ/ס</li>
	<li>לחסום את רקמת הריאה עם 20% של הסרום המתאים (10% עגל עוברית סרום ו- 10% עוף סרום) ולאחר מכן permeabilize PBS שיושלם ו- 3.75% טריטון-X 100 עבור 7 שעות בטמפרטורת החדר תחת עצבנות עדין.</li>
	<li>כתם הסעיפים עבור h 16 ב 4 ° C עם נוגדנים העיקרי הרלוונטי (MMP-9, H3Cit ו- F4/80) 200 כרכים µL צינורות microcentrifuge (נוגדן ריכוזים מוצגים בטבלה של חומרים).</li>
	<li>לשטוף את הסעיפים ב- PBS, 3 פעמים במשך 10 דקות לפני המקננת עם נוגדנים משניים הרלוונטיים בטמפרטורת החדר במשך ה 1</li>
	<li>כתם הסעיפים ריאות עבור דאפי (1:5, 000) בתמיסה למשך 20 דקות, לפני הוספת את שער גולשת המיקרוסקופ שקופיות ב- PBS.</li>
	<li>להשיג תמונות פלורסצנטיות באמצעות הפוכה קונאפוקלית במיקרוסקופ (40 x 1.3 NA) מצוידים עם 405 ננומטר, 440 ננומטר, 473 nm, 543 ננומטר, 635 ננומטר לייזר.</li>
	<li>להקליט z-במחסן תלת-ממדי של 0.54 עובי מיקרומטר עם אופטימלית חלוקתה z עבור המטרה שמן 40 x 1.3 נה. 
	הערה: התוכנה ששימשה משתנה בהתאם המיקרוסקופ בודדים. דוגמה של איך התוכנה יכול לשמש עבור מיקרוסקופ אחד מסופק 1 הקבצים המשלימים.</li>
</ol> 6. ניתוח תמונה הערה: הניתוח של דגימות מחייב שימוש תוכנה ספציפית ניתוח ההדמיה, דוגמאות מפורטים בטבלה של חומרים. בזמן הניתוח של התוצאות תלויות התוכנית ספציפיים השתמשו, הנקודות המפורטות להלן חשובים.
<ol><li>ניתוח של בל דגימות <ol><li>הגדר המספר של מקרופאגים על-ידי בחירת ערוץ הצבע הכחול על דאפי הקצאת בגודל מינימלי עבור התאים (למשל, &#62; 18 מיקרומטר בקוטר). באמצעות התוכנות הרלוונטיות, למדוד את המספר הכולל של מקרופאגים לכל שדה.</li>
		<li>לספור את מספר תאי יש את התכונות של המטרופוליטן על ידי הנוכחות של כרומטין חוץ-תאית שזיהה דאפי עם ביטוי משותף של סמנים אחרים (למשל, MMP12, PAD2 ו- H3Cit). 
		הערה: מספר סמנים ניתן לנתח תלויה במספר של לייזרים זמינים, אך באופן אידיאלי בנוסף דאפי, לפחות שני סמנים אחרים צריך להיות כלול. השני פחות פרמטרים ספציפיים עבור ביטוי MET (למשל, מספר תאים עם כרומטין חוץ-תאית, של גרעין מוגדלת) יכול לשמש.</li>
		<li>כדי להשוות את הביטוי MET ב BAL לנתח דגימות (בין הבקרה, עשן, עשן/DNase התייחסו לקבוצות), מינימום של 100 מקרופאגים BAL לדגימה.</li>
		<li>למדוד נוגדנים משניים, isotype לשלוט רמות קרינה פלואורסצנטית; למדוד מינימום של 100 תאים בכל מדגם עבור קרינה פלואורסצנטית שלהם. למדוד את הרמה הממוצעת של רקע זריחה עבור כל סמן (למשל, H3Cit) באמצעות תוכנה סטנדרטית.</li>
		<li>להגדיר ביטוי MET, לספור את התאים עם פנוטיפ אופייני (למשל, חוץ-תאית כרומטין עם שותף ביטוי H3Cit MMP9), עבור כל MET, למדוד את רמת קרינה פלואורסצנטית סמנים (למשל, H3Cit, MMP9). לא לכלול תאים בהפקת המטס אם צביעת שלהם לא היה מעל רקע ושליטה isotype.</li>
		<li>לדוגמאות BAL אנושי, לנתח מינימום של 100 תאים עבור כל דגימה עבור האחוז של מקרופאגים שהופכים הגרורות. לקבלת דוגמאות מאתר, התאים הם קטנים יותר, המטס קשה להגדיר, לנתח מספר גדול יותר של תאים עבור כל דגימה (למשל, מקרופאגים 200).</li>
	</ol></li> <li>ניתוח של דגימות רקמה בריאה <ol><li>כדי לקבוע הנוכחות של המטס ברקמת הריאה, השתמש הסמן מקרופאג ספציפיים כגון F4/80-</li>
		<li>להגדיר את הנוכחות של המטס ברקמת הריאה באמצעות שיתוף הלוקליזציה של F4/80 בתאים המבטאים כרומטין חוץ-תאית עם פרמטרים אחרים, כמפורט בסעיף 6.1.</li>
		<li>לקבוע את רמות קרינה פלואורסצנטית רקע בדגימות עם נוגדנים משניים, הפקדים isotype. אל תכלול המטס ניתוח שאינם מעל הרקע.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin?.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?.</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).</li><li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+balancing:+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases.">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers immunol. 4, 1 (2013).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression.">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).</li><li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).</li><li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).</li><li>Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PAD4+in+NET+formation.">Activation of PAD4 in NET formation.</a> Front Immunol. 3, 360 (2012).</li><li>Lewis, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PAD4+activity+is+sufficient+to+disrupt+mouse+and+human+NET+formation.">Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation.</a> Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).</li><li>Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+the+IL-6+Trans-Signaling/Mechanistic+Target+of+Rapamycin+Complex+1+Axis+in+Pulmonary+Emphysema.">Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema.</a> Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).</li><li>Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps.">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell host &amp; microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li><li>Wong, K. W., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+exploits+human+interferon+gamma+to+stimulate+macrophage+extracellular+trap+formation+and+necrosis.">Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis.</a> J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).</li></ol>

המחברים יש אין גילויים לעשות ביחס לזה לעבוד.

השיטה המתוארת בסקירה זו מבוססת בשימוש עבור הגדרת הנוכחות של רשתות14. מקרופאגים עד כה סוג התא דומיננטי בדגימות BAL, שיטה זו של אוסף זה מתאים במיוחד ללמוד הגרורות. אם תאי דם אדומים נוכח הכדור, תאים אלה צריך להיות lysed על-ידי שימוש אמוניום כלוריד. ההליך BAL יהיה בדרך כלל להפעיל את המקרופאגים, לכן הוא צפוי כי יהיו המטס נוכח דגימות לא מגורה. המקרופאגים BAL הם בדרך כלל מאוד חסיד. המקרופאגים BAL בדרך כלל לא יזדקקו סמן ספציפיים כמו תאים אלה הם הסוג תא דומיננטי, ניתן להבחין גם על ידי המורפולוגיה שלהם. בדרך כלל בל, יותר מ 80% של התאים מקרופאגים (והם נויטרופילים פחות מ-5%), ואחרי מספר שוטף, נשארות בדרך כלל רק לויקוציטים חסיד (קרי, של המקרופאגים)6. אם יש ספק לגבי היכולת להבחין מקרופאגים לבין נויטרופילים בבני אדם, עשוי לשמש סמן נויטרופילים כגון elastase נויטרופילים. רקמת הריאה, סמן מקרופאג ספציפיים (למשל, F4/80) נדרש כמו מקרופאגים שקשה להבדיל בין סוגי תאים אחרים. מקרופאגים יש אוטומטית-זריחה אז השימוש בפקדי רקע ו- isotype חשובה; זה במיוחד במקרה של דגימות מגורה.
הדרך הטובה ביותר להגדיר את הנוכחות של המטס עדיין נקבע. מסלולים/תהליכים ספציפיים, אשר הינן נפוצות כדי נויטרופילים ומקרופגים הם: פרוטאזות פרטנית (1), (2) citrullination של שינויים היסטוניים, ובמשטח (3). PAD4 הוא ספציפי יותר נויטרופילים, בעוד PAD2 בולט יותר ומונוציטים/מקרופאגים. השימוש F4/80 הוא סמן היטב מקובל מאתר מקרופאגים, אבל מקרופאגים האנושי אין כזה סמני מוגדרים היטב, זה עלול להוות בעיות בעת הערכת רקמת הריאה האנושי לביטוי MET. ניתוח ביטוי MET ברקמת הריאות עשוי להיות קשה יותר ישנם סוגי תאים רבים אחרים, הגרורות נוטים להיות נדחף אל הקירות מכתשי. בעת ניתוח קטעי רקמה, מטס הם דמיינו בצורה הטובה ביותר כאשר הם שטוחים חתך; אם הגרורות הן במישור אחר שזה יכול להיות קשה לקבוע אם MET קיים. בעיה זו ניתן להתייחס במידה מסוימת על ידי ביצוע z-במחסן כדי לאפשר רקמות עמוק (תלת-ממדי) מטוסים לבחינת המטס ואת הפוטנציאל להמחיש הגרורות בהיבטים שונים.
אין שיטה היטב המקובלים להגדרת הנוכחות של המטס בדגימות ריאות. השיטות שתואר מבוססים על אלה המשמשים להמחשת רשתות. . צ'או et al. מתואר כי mitogen PMA המושרה המטס macrophage התא בשורה, מוערך על ידי הנוכחות של כרומטין חוץ-תאית15. מחקר עוקבות הוכיח כי שחפת Mycobacterium המושרה המטס במבחנה, כפי שהוגדר על ידי הנוכחות של כרומטין חוץ-תאית, H3Cit16. אנחנו הראו ויוו במודל של דלקת פקעיות הכליה, כי המטס נוכח הכליה כפי שהוגדרו על ידי כרומטין היסטון, myeloperoxidase שותף מקומי7. בסופו של דבר, אנחנו הראו הנוכחות של המטס במבחנה באמבריולוגיה מקרופאג על ידי השילוב של כרומטין חוץ-תאית ו MMP126. השיטה שלנו יכול לשמש על ידי חוקרים אחרים מחקר זה היבט חשוב של תגובת דלקתית.
סביר כי המטס תוכר יש תפקיד מרכזי ב מחלה דלקתית כרונית. התהליכים שמובילים NETosis הם עדיין לא מוגדר היטב. המחקר של המטס עשוי לספק תובנות מנגנוני היווצרות השמנה משמעותית. הפיתוח של פרוטוקולים עם סמנים נוספים ומחקרים פונקציונלי של המטס נוסף יגדירו את התפקיד של המטס במחלה.
יש שלבים קריטיים שאנו זיהינו ב פרוטוקול זה. הדגימות BAL האנושי צפויים להיות זיהום חיידקי משני ועל השימוש באנטיביוטיקה במדיום תרבות חשוב עבור הגבלת הזיהום. הנוגדנים והמשניים יכול להשתנות שלהם פלורסצנטיות, אפילו עם מאותו יצרן. לבסוף, הניתוח של דגימות רקמות הריאה מורכבת יותר דגימות BAL ודורש זמן לפתח בגישה סטנדרטית.

מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות), שתוארו לראשונה על-ידי. Brinkmann et al. 1 הם מיוצרים בעיקר בתגובה לזיהום (במיוחד לחיידקים) ויש להם תפקיד חשוב ב מארח ההגנה1,2. הם גם תוארו להתרחש בתגובה מחלות שאינן זיהומיות, כולל דלקת בכלי הדם, זאבת אדמנתית מערכתית (מירה כהן); ו mitogen phorbol 12-myrisate 13-אצטט (PMA)2,3. זה לאחרונה הוכר כי סוגי תאים אחרים אולי גם לייצר מלכודות חוץ-תאית, כולל מקרופאגים. מלכודות חוץ-תאי מקרופאג (גרורות) עדיין אינם ישות מוגדרים היטב הספרות4,5. לאחרונה הקמנו שיטות כדי לזהות הנוכחות של המטס גם במבחנה וגם ויוו6,7. במאמר זה, המדידה של המטס שימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית יתוארו.
תכונות עיקריות של NETosis אשר להבחינו מסלולים סלולר אחרים (כגון אפופטוזיס8) הם ההבלטה של כרומטין בשיתוף עם: (1) citrullination של שינויים היסטוניים (H3Cit)9, (2) ביטוי משותף של פרוטאזות גרגר10 , (3) מעורבות של peptidyl deiminase ארגינין (PAD) 411,12. מקרופאגים אקספרס גם H3Cit, גרגר פרוטאזות, PAD, ניתן להשתמש בתכונות אלה כדי להגדיר את הנוכחות של המטס.
המטס ייתכן תפקיד חשוב במיוחד בריאה, כפי מקרופאג התא דומיננטי נוכח alveoli ואת דרכי הנשימה של הריאות, יש את התפקיד הראשוני של בימוי התגובה החיסונית הסלולר זיהום/דלקת. בנוסף, בעוד הרבה של הריאות הוא חלל ריק (למשל, בתוך alveoli), הגרורות מסוגלים פוטנציאלי להרחיב השטח הזמין, בניגוד לאיברים מוצקים.
השיטה הנפוצה ביותר מגדירים את הנוכחות של רשתות היא על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. יש עדיין אינה דרך ברורה כדי למדוד את המטס. הטכניקה לשקילת רשתות כבר מותאם כדי למדוד את הנוכחות של המטס ב פרוטוקול זה. הדרישות העיקריות של שיטה זו הם גישה מיקרוסקופיה קונפוקלית ותוכנת הדמיה המתאים לניתוח.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Human samples: Primary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human MMP12</td><td>Novus Biological</td><td>NB110-57214</td><td>1:100 concentration not quantifiable</td></tr><tr><td>Mouse anti-human MMP9</td><td>Novus Biological</td><td>AB119906</td><td>1:200 ascites, no concentration given</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human PADI2/PAD2</td><td>Abcam</td><td>AB16478</td><td>7 ug/ml</td></tr><tr><td>Mouse anti-human PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ug/ml</td></tr><tr><td>Sheep anti-human NE</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mouse samples: Primary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse MMP9</td><td>Abcam</td><td>AF909</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rat anti-mouse F4/80</td><td>In-house (hybridoma)</td><td>In house</td><td>20 ug/ml</td></tr><tr><td>Sheep anti-human Anti-HNE /NE</td><td>Sapphire Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>Mouse anti-human &amp;shy;&amp;shy;&amp;shy;&amp;shy;PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ug/ml</td></tr><tr><td>Super-frost plus slides</td><td>Menzel</td><td>S41104A</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-prolong gold</td><td>Molecular probes</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9434</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Secondary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 488/</td><td>Life technologies</td><td>A-21441</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-21442</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-goat AF 594</td><td>Life technologies</td><td>a-21468</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-mouse AF488</td><td>Life technologies</td><td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-sheep AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11018</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-mouse AF 647</td><td>Life technologies</td><td>A-21463</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-sheep AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Isotype control</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1</td><td>BD Bioscience</td><td>550878</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG2a</td><td>BioLegend</td><td>400201</td><td></td></tr><tr><td>Sheep IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software Programs&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 Confocal scanning microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV1200 Confocal scanning microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue sources&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>r8758</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sudan black</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27387</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2753</td><td></td></tr><tr><td>Natural formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42904</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576</td><td></td></tr><tr><td>Solvent 3B</td><td>Hi-Chem</td><td>2026</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 12 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1815</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 60 x 24 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6875</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mice&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>c57 black 6</td><td>Monash animal research platform (MARP)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c</td><td>MARP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy

שיטה העיקרי המשמש להגדרת הנוכחות של מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות) הוא מיקרוסקופיה קונפוקלית. אנחנו ששינית מבוסס מיקרוסקופיה קונפוקלית שיטות כדי להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג (גרורות). אלה מלכודות חוץ-תאית מוגדרים על ידי הנוכחות של כרומטין חוץ-תאית עם ביטוי משותף של רכיבים אחרים כמו גרגר פרוטאזות, שינויים היסטוניים citrullinated peptidyl arginase deiminase (מקלדת). הביטוי של המטס בדרך כלל נמדד לאחר חשיפה לגירוי, לעומת דגימות לא מגורה. דוגמאות כלולים גם על רקע ושליטה isotype. התאים הם ניתחו באמצעות תוכנת ניתוח התמונה מוגדרים היטב. מיקרוסקופיה קונפוקלית עשוי לשמש כדי להגדיר את הנוכחות של המטס גם במבחנה וגם ויוו ברקמת הריאה.

מטס, ניתן לאבחן מדגימות BAL, רקמת הריאה, בסעיפים ריאות עבה יותר עם תמונות תלת-ממדיות. דוגמה של המטס דמיינו במדגם BAL מוצג באיור1. המורפולוגיה של הגרורות ישתנה בהתאם שלהם שלב של התבגרות. התכונה הראשונה לזיהוי על מיקרוסקופ הוא התנועה של הגרעין לקצה של התא. זה מלווה כרומטין חוץ-תאית עם המגשרים ביטוי שיתוף אחרים, כגון H3Cit, גרגר פרוטאזות. בשלבים מוקדמים יותר, התא עדיין יש בערך עגול עם המלכודת חוץ-תאי ביטא. בשלבים מאוחרים יותר, היווצרות MET מאופיין על ידי התארכות של הגוף של התא.
רקמת הריאה המטס מוצגים באיור2. כמו הריאות הם בניפוח עם נוזל כדי להגדיר את הארכיטקטורה ריאות, יהיה הגרורות בדרך כלל דחף על הקירות מכתשי. המורפולוגיה של הגרורות גם משתנים בהתאם נחתך המטוס הרקמה. הסעיפים סטנדרטי המשמש עבור דגימות רקמות הריאה הם 4-5 מיקרומטר עובי. רקמות להקשיה לאפשר מספר תמונות להילקח, הגרורות ואז ניתן לצפות בתלת-ממד. הנוגדנים רק יחדור כה לתוך רקמת הריאה, עובי סעיף של 25-50 מיקרומטר אופטימלית. דוגמה של תמונה תלת-ממדית מוצג באיור 3 ו 1 וידאו.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig1.jpg"> 
איור 1: BAL המטס. המטס BAL האנושי נוצר אחרי גירוי בשלבים שונים של פיתוח. המטס התאפיינו כרומטין חוץ-תאית עם שותף ביטוי H3Cit MMP9. צביעת עבור כרומטין (א), (B) H3Cit, (ג) MMP9 (D) את התמונה הממוזגת. הלוח הם פקדים isotype. גודל ברים = 10 מיקרומטר (מיקרומטר 15 עבור isotype). בשלב שלפני כן מוצג בפינה הימנית העליונה ויש לו צורה כדורית בערך. MET בוגרת יותר מוצג במרכז השדה. התמונות צולמו באמצעות לייזר סורק מיקרוסקופ קונפוקלי ויעד של 40 x 1.0 נה שמן. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56459/56459fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig2.jpg"> 
איור 2: רקמת הריאה המטס. המטס מאתר ברקמת הריאה לאחר גירוי. הגרורות יש מתאפיינת כרומטין חוץ-תאית עם ביטוי משותף של H3Cit, MMP9 F4/80 (כמו סמן מקרופאג). לוח (A) מראה אופייני ובעוצמת שדה מבט נהגו למדוד את מספר הגרורות; פאנלים (B–F) מראים את אזור כיכר מקווקו תחת הגדלה גבוהה יותר. צביעת עבור כרומטין (B), H3Cit (ג), (ד) MMP9, F4 (E) / 80 (F) את התמונה הממוזגת. החלונית insert היא הפקד isotype. גודל ברים = 20 מיקרומטר (מיקרומטר 20 עבור isotype). המטס יידחפו באופן כללי הקירות מכתשי. התמונות צולמו באמצעות לייזר סורק מיקרוסקופ קונפוקלי ויעד של 40 x 1.3 נה שמן. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56459/56459fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig3.jpg"> 
איור 3: תצוגה תלת-ממדית סעיף ריאה. רקמת הריאה העכבר היה קבוע, חותכים למקטעים עבה מיקרומטר 25-35. רקמות עם סמנים תוויות עבור מטס, עם תמונה עם מקטעים-עובי 1 מיקרומטר. תמונות משולב עם ערימה-z כדי ליצור תמונה תלת-ממדי המטרופוליטן. התמונות צולמו באמצעות לייזר סורק מיקרוסקופ קונפוקלי ויעד של 40 x 1.3 נה שמן. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56459/56459fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/56459/56459video1.jpg"> 
וידאו 1: תצוגה תלת-ממדית סעיף ריאה. הסרטונים מקביל דגימות המוצג באיור3. ציר קרציות = 5 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56459/Mets_1.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

מלכודות חוץ-תאי מקרופאג הם ישות שתואר לאחרונה. מאמר זה יתמקד מיקרוסקופיה קונפוקלית שיטות, איך הם דמיינו במבחנה , ויוו מדגימות ריאות.

להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

visualizing-macrophage-extracellular-traps-using-confocal-microscopy

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Views.  Monash Medical Centre. מלכודות חוץ-תאי מקרופאג הם ישות שתואר לאחרונה. מאמר זה יתמקד מיקרוסקופיה קונפוקלית שיטות, איך הם דמיינו במבחנה , ויוו מדגימות ריאות.

Video: Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic inflammation. Neutrophil ETs (NETs) consist of a mesh of DNA, histone proteins, and various granule proteins (i.e., myeloperoxidase, elastase, and cathepsin G). Other immune cells, including macrophages, can also produce ETs; however, to what extent this occurs in vivo and whether macrophage extracellular traps (METs) play a role in pathological mechanisms has not been examined in detail. To better understand the role of METs in inflammatory pathologies, a protocol was developed for visualizing MET release from primary human macrophages in vitro, which can also be exploited in immunofluorescence experiments. This allows further characterization of these structures and their comparison to ETs released from neutrophils. Human monocyte-derived macrophages (HMDM) produce METs upon exposure to different inflammatory stimuli following differentiation to the M1 pro-inflammatory phenotype. The release of METs can be visualized by microscopy using a green fluorescent nucleic acid stain that is impermeant to live cells (e.g., SYTOX green). Use of freshly isolated primary macrophages, such as HMDM, is advantageous in modeling in vivo inflammatory events that are relevant to potential clinical applications. This protocol can also be used to study MET release from human monocyte cell lines (e.g., THP-1) following differentiation into macrophages with phorbol myristate acetate or other macrophage cell lines (e.g., the murine macrophage-like J774A.1 cells).

Presented here is a protocol to detect macrophage extracellular trap (MET) production in live cell culture using microscopy and fluorescence staining. This protocol can be further extended to examine specific MET protein markers by immunofluorescence staining.

בגירוי חוץ-גופית והדמיה של שחרור מלכודת השמנה ב הבדיל מונוקרוציט האדם הנגזר

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). This study analyzes the morphological and compositional changes in NETs induced by microbial and chemical stimuli using standardized in vitro methodologies for NET induction and characterization with human cells. The procedures described here allow the analysis of NET morphology (lytic or non-lytic) and composition (DNA-protein structures and enzymatic activity), and the effect of soluble factors or cellular contact on such characteristics. Additionally, the techniques described here could be modified to evaluate the effect of exogenous soluble factors or cellular contact on NET composition.
The applied techniques include the purification of polymorphonuclear cells from human peripheral blood using a double density gradient (1.079-1.098 g/mL), guaranteeing optimal purity and viability (&#8805; 95%) as demonstrated by Wright's staining, trypan blue exclusion, and flow cytometry, including FSC versus SSC analysis and 7AAD staining. NET formation is induced with microbial (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida albicans) and chemical (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, and the NETs are characterized by DNA-DAPI staining, immunostaining for the antimicrobial peptide cathelicidin (LL37), and quantification of enzymatic activity (neutrophil elastase, cathepsin G, and myeloperoxidase). The images are acquired through fluorescence microscopy and analyzed with ImageJ.

Presented here is a protocol for the induction and analysis of in vitro neutrophil extracellular traps (NETs). Quantification of DNA, cathelicidin (LL37), and enzyme activity yielded data that show the variability in the composition and morphology of NETs induced by microbial and chemical stimuli under similar controlled conditions.

ניתוח מורפולוגי וקומפוזיציוני של מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות המושרות על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Immunofluorescence התוויות של האדם ומורין נויטרופילים מלכודות ממומנת ב-פרפין רקמה מוטבעת

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Medicine

צביעה והדמיה כדי להמחיש מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

מחבר זרקור: דימות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים ברקמות אדם ועכבר 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

הדמיה אימונופלואורסצנטית של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים ברקמות אדם ועכבר

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Macrophage Extracellular Traps

Source: Zhang, Y., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/60541">In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates in vitro stimulation of macrophage extracellular traps (METs) in human monocyte-derive macrophages using different inflammatory stimuli such as TNF-alpha, PMA, and HOCL. The video also demonstrates the method of SYTOX dye staining of METs for visualization.

גירוי חוץ גופי והדמיה של מלכודות חוץ-תאיות של מקרופאגים

1. Polarization of HMDM

	Under sterile conditions, prepare the M1 priming media by adding interferon &#947; (IFN&#947;; 20 ng/mL) and lipopolysaccharide ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Imaging and Visualization Techniques

Visualization of Extracellular Traps in Macrophages from Human Bronchoalveolar Lavage Fluids

Source: Sharma, R. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56459">Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the immunolabeling of macrophage extracellular traps, METs, in bronchoalveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid, and their visualization using a confocal microscope.

הדמיה של מלכודות חוץ-תאיות במקרופאגים מנוזלי שטיפה ברונכואלבאולריים אנושיים

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Bronchoalveolar Lavage (BAL) ...

להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

בגירוי חוץ-גופית והדמיה של שחרור מלכודת השמנה ב הבדיל מונוקרוציט האדם הנגזר

ניתוח מורפולוגי וקומפוזיציוני של מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות המושרות על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים

Immunofluorescence התוויות של האדם ומורין נויטרופילים מלכודות ממומנת ב-פרפין רקמה מוטבעת

הדמיה אימונופלואורסצנטית של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים ברקמות אדם ועכבר

הדמיה אימונופלואורסצנטית של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים ברקמות אדם ועכבר

הדמיה אימונופלואורסצנטית של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים ברקמות אדם ועכבר

גירוי חוץ גופי והדמיה של מלכודות חוץ-תאיות של מקרופאגים

הדמיה של מלכודות חוץ-תאיות במקרופאגים מנוזלי שטיפה ברונכואלבאולריים אנושיים