The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.

注：全ての実験は、地元の機関倫理指針に従って行った。 1.採血<ol><li>肘前venipuctureを通じて、グリーントップ（ヘパリン処理）チューブに健康なボランティアからの血液の14のチューブを収集し、氷上にセトリングする前に、各チューブを反転させる。最適な好中球の収量を確保するために、実験の15分 - 10内の血液を収集する。 </li></ol>全血から2.好中球の単離<ol><li>血液を希釈するCaおよびMgを含まないPBS 5mlの血液の各緑のトップチューブを洗ってください。 4×50ミリリットルコニカルチューブのそれぞれにおいて、RTでリンパ球分離媒体（LSM）の15ミリリットルを追加します。 18 G針を使用すると、鋭いLSM-血液インタフェースを作成する、慎重にLSMに希釈された血液の層60 mlシリンジに取り付けられた。 注：可能な限り層の混合を避ける。 </li><li>休憩なしで21℃で30分間、800×gで遠心し。 注：突然の休憩することができます異なる層の混合を引き起こす。 </li><li>底に赤血球および好中球堆積物を観察します。吸引し、底面のみ赤色層を残して、リンパ球および単核細胞が含まれているこれらの層の間のインタフェースを取り除くことを確認して、トップ2層（プラズマとLSM）を捨てる。 </li><li>各チューブに、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）20mlの6％デキストラン溶液20mlを加える。穏やかに赤血球および好中球の層と混合し、室温で30分間静置する各チューブを反転させる。 注：これは赤血球（RBC）は底に沈降することができます。 </li><li> 30分後、新鮮なチューブに好中球の豊富な上清を転送し、RBCペレットを捨てる。 5分間、4℃で450×gで遠心し上清。遠心分離後、上清を捨てる。ペレットは、主に好中球およびいくつかのRBCが含まれます。 </li><li>滅菌水の4.5ミリリットルに溶解緩衝液の0.5ミリリットルを追加することによって、溶解液を準備します。 TでRBCを残りの溶解彼は1チューブにすべて再懸濁させたペレットを転送する、ソリューションを溶解する5ミリリットルを用意しました。 10分間の暗所に室温で溶解を許可します。 </li><li> 5分間、4℃で450×gで遠心し。上清を捨て、残りの溶解溶液を取り除くために、4℃で450×gで再びCaおよびMgと遠心することなく、5ミリリットルのPBSでペレットを洗浄。この時点で得られたペレットは、好中球が含まれています。冷3％RPMI 30mlにペレットを再懸濁し、氷上に置く。 注：3％RPMI、3％ウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI培地を補充することにより行われる</li><li>メチレンブルー染色を使用してサンプルの純度を確認してください。 &gt; 95％の細胞は、マルチ肺葉核を有する顆粒にする必要があります。細胞の&gt; 95％の生存率を確認し、最終的な好中球の収量をカウントし、トリパンブルー染色を使用してください。 5×10 6の好中球/ mlの最終濃度を得るために、氷冷3％RPMI中の好中球を希釈する。 </li></ol> 3.のNETジェネレーション<ol><li> 500 nは好中球を刺激するPMAのM（好中溶液30ml当たり）、37℃、5％CO 2で4時間20mmのグリッド150×25ミリメートルフラット組織培養皿上でインキュベートする。これはNETosisできるようになります。 </li><li>刺激の4時間後、軽く底に付着したネットや好中球の層を残し、培地を吸引除去し、捨てる。この層を破壊しないでください。 </li><li>皿当たりCaおよびMgなし冷PBS 15mlの合計を使用して、底部からすべての付着性材料をリフトオフするためにシャーレの底にPBS 15mlをピペッティングすることによって、各皿の底を洗浄する。 </li><li> 4℃で450×gで10分間15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に各皿（ステップ3.3）を洗浄することから得られた溶液を収集します。好中球および残りの細胞は、無細胞NETリッチな上清を残して、底部にペレット化します。 </li><li>ディバイド1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに上清と4℃で18000×gで10分間スピン。これは、すべてのDNAがペレット化することができます。 注：より大きなTUでの遠心分離BESような高い速度は、通常の遠心分離機に達成可能であれば簡単に、より少ない時間がかかり、それ以外の場合は、高速のマイクロ遠心機を使用するために小さいチューブ内の上清を分割する必要があります。 </li><li>上清を捨て、100μlのPBSあたり2×10 7の好中球に相当する濃度に氷冷PBSで一緒に取得したすべてのペレットを再懸濁します。これは、その後の実験のために使用することができる無細胞NETストックが得られる。 </li><li>分光光度法または代替のDNAの定量化ツールを使用して得られた試​​料中のDNAの濃度を測定する。 180 ng /μLで - サンプル中の適切な濃度は、140との間の範囲でなければならない。 </li></ol> 4. NET-癌細胞の静的接着アッセイ<ol><li>以前に96ウェル平底プレートにウェル当たりNET株式を取得し、暗所で4℃でコートウェルO / Nに許可する100μlのを追加します。 </li><li> 12〜20時間後に、細胞の均一な単層の形成を確認顕微鏡下で井戸の底の自由のNET（ 図1）。この時点で、優しく下部にNET単分子層を破壊することを確認しないこと、ウェルからすべての非接着材料を吸引。 </li><li>各ウェルに、1％ウシ血清アルブミン（BSA）のブロッキング溶液100μlを加え、室温で1時間放置する。 </li><li> 0.25％トリプシン溶液2mlを用いたT-75フラスコからA549癌細胞を切り離す。一度、デタッチ5分間、4℃で450×gでトリプシン処理した細胞と遠心分離機にA549のメディアの10ミリリットルを追加します。 100μlのメディアごとに2×10 4癌細胞の濃度を得るために、メディアで上清と再懸濁細胞を捨てる。 NOTE：A549細胞を別々に増殖させた。簡単に述べると、細胞を培養し、10％FBSおよび1％ペニシリンストレプトマイシンを含有するDMEM F12培地中で維持し、37℃、5％CO 2でインキュベートした。 70一度 - 80％の細胞集密度に達した後、それらを0.25％トリプシン-EDTAを用いて剥離し、同じ培地に再懸濁した上述した。 </li><li>培地1ml当たりCFSEを1μl添加し、室温で10分間染色し去ることによりCFSEを用いて染色癌細胞。染色した後、5分間、4℃で450×gで遠心ダウンその後、100μlのメディアあたり2×10 4の癌細胞の濃度を得るために、培地の初期容量で上清を再懸濁細胞を捨てる。 </li><li>穏やかに吸引し、ブロッキング溶液とウェル当たりNETの単層の上に、100μlのと等価であるメディアに2×10 4がん細胞を追加し、37℃、5％CO 2で90分間付着させ、ブロッキングのNETの1時間後。静かに細胞を吸引し、非接着細胞を洗浄するために、各ウェルに100μlのPBSを追加。 </li><li>いくつかのウェルでは、ネットを分解するために洗浄を10分間ウェル当たりDNAse1の1000Uを追加します。これは、負の対照として役立つ。他のウェルでは、車両制御（VC）として機能するもの、10分間、ウェルあたり100μlの滅菌水を追加します。 注：conditioあたり3回の反復nは、通常、サンプルサイズを増加させるために行われる。 </li><li>吸引し、ウェルが底にのみNETは、接着、癌細胞を残すのすべての液を捨て、。 （ 図1）NETSに付着する癌細胞を固定し、蛍光顕微鏡下でアッセイを読み取るためにウェルあたり4％ホルムアルデヒド溶液100μlを加える。プロットし、結果を分析する（ 図3）。 </li></ol>

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない

このビデオで実証好中球細胞外トラップ単離プロトコールは、好中球の単離およびNET形成のために文献で使用される様々なテクニックを兼ね備えています。これは、かなり複雑な変数のプロセスを簡素化し、他のプロトコルよりも少ない工程で精製された無細胞ネットを分離するための非常に信頼性と複製可能な方法を提供しています。また、容易に入手可能な試薬をプロトコル簡潔に追加し、大幅にコストを削減使用される。 NET濃度は容易に特定の目標（17）に合わせて操作することができるように、静的接着アッセイに向けてのNETのアプリケーションは、この分離技術によってもたらされる柔軟性を実証するのに役立つ。したがって、示された技法によって単離さNETは、様々な動的接着アッセイを含むアッセイの種類、遊走アッセイ、増殖アッセイの免疫蛍光および共焦点イメージング、電子顕微鏡法、フローサイトメトリー、ならびに伝統的なウェスタンブロッティングのために使用することができる。 </p&gt; その成功のために重要であるこのプロトコルのステップ数がある。まず、好中球が誤ってアポトーシスに至る分離プロセス中に活性化されてもよい。それは、ヒュームフードの下で無菌条件下で、すべての単離工程を実行することが重要である、チューブの積極的な混合を避ける、RBC溶解工程の後に氷上ですべてのサンプルを維持し、工程間の長い待ち時間を避ける。アッセイの目標は、密着性を評価する目的でコートウェルにある場合、これがあっても保証されますように第二に、それはウェルあたりを示唆NET濃度だけでなく、 &quot;NETストック」で提案された最終DNA濃度を尊重することが重要ですおよびネットの一貫した単分子層。より低い濃度は、ウェルの斑状のコーティング、したがって信頼性の低い結果を生じ得る。最後に、その破壊を防止するためのアッセイを行いながら慎重にNET単層を処理するためにも重要である。これにより、調整することによって容易にすることができる井戸の両側に吸引し、ピペットの強さ。 この手法の限界は、それがまだほとんど4時間PMA刺激の増加によるのNETを生成するためにかなりの時間を必要とするという事実を含む。また、血液のかなりの量は、1つの実験に必要十分な数の好中球を単離するために必要とされる。好中球を廃棄する際に間違いなく最初の遠心分離工程でのNETのかなりの量の損失（ステップ3.4。）があります。この時点で純損失を最小限にするために変更が大幅に最終NETの収量を増加する可能性があります。慎重な実験計画と時間管理を必要とするそれらの単離の24時間、 - また、孤立したネットは、12以内に使用しなければなりません。

好中球細胞外トラップ（のNET）タンパク質とヒストンの何百によって装飾された外DNAの鎖から構成される新たに発見された好中球由来の要素です。これらは、特定の刺激後の感染および炎症の文脈における好中球によって分泌され、それらが最初に感染に対する好中球の防御機構の一部であることが認められた。これらは、最初の細菌、ウイルスおよび真菌1-3を含む種々の微生物の侵入者の捕獲を促進することが示された。微生物の捕捉することは、両方の直接NET関連タンパク質3,4及び間接的に食細胞5,6の地元の募集を通じてによってその破壊につながる。のNETの役割は、しかし、防衛をホストするために制限されていないようです。より最近では、彼らは、自己免疫疾患7,8、血栓9、妊娠関連障害10、さらに癌の進行において重要な役割を果たすことが示されている11,12。したがって、NETは、多様な生理学的プロセス、多数の重要な役割を果たしていると思われる。しかしながら、このような研究の新規な性質を考えると、多くのNETは、それらの効果を発揮するメカニズムについて解明されていない。ここで、我々は、好中球の不在内のネットの単離のための簡便法を提示する。 次のビデオでは、我々は、ヒト全血からのNETを単離するために簡略化され、容易な技術を実証する。無細胞のNETは、次いで、接着、増殖および遊走のような多くのアッセイならびにブロッティング、染色、imuunofluorescence含むインビトロの実験で使用することができる。他のプロトコルは、しかし、彼らは通常、長い複雑な、高価な、そして多くの場合、低い収率13である、13、19が存在する。この簡略化されたプロトコルは、基本的な試薬を使用し、好中球を単離するために必要なステップの数が減少するので。手順の長さを最小化する収量を最大化しながら、再。 以下の方法は、好中球の単離のための別の技術は、以前に生きた好中球の非常に純粋な試料を得た単純なプロトコルを得るために、文献に記載され組み合わせる。文献で ​​示唆したように、静脈血をEDTAチューブに回収し、好中球活性化14を回避するために10分以内に使用されている。我々は、ヘパリン化全血、最初にBoyumら15によって記載され、フィコール密度遠心分離技術から適応方法から顆粒球および赤血球を分離するためにリンパ球分離培地（LSM）密度勾配遠心分離を使用する。 LSMナトリウムピリオドンのためのジアトリゾ酸ナトリウムを代入し、好中16-18を単離するために多くの研究において成功裏に使用されてきたBoyum製剤の変形例である。 差動密度遠心分離後、単球およびリンパ球は廃棄される。赤血球は、次いで沈降さ6％デキストラン溶液14を使用して、残りのRBCをトリパンブルーおよびメチレンブルー染色によって確認された純粋な好中球の集団を得るために溶解される。 多くの物質は、リポ多糖（LPS）、および酢酸ミリスチン酸ホルボール（PMA）およびインターロイキン（IL-8）-3,5,6-含む、 インビトロおよびインビボの両方NETosisを誘導するために使用されてきた。以下のプロトコールでは、単離された好中球はアポトーシス19,20を促進することなく一貫した信頼NET形成を可能にするのに十分な濃度であることが示されている4時間、500 nMのPMAで刺激する。 単離後、我々は、このプロトコルから得られた無細胞のNETは、接着アッセイにおいて使用することができる方法を示す。 DNAse1で消化し ​​、前述のようにのNETを分解するために使用されるので、制御2,3,11として機能する。他のオプションはNET formatiを阻害する好中球エラスターゼ阻害剤（NEI）の使用を含むこれ、上の目標は、NET形成を阻害するのではなく、それらの分解11を達成するためにあるときに許容可能な代替手段です。 NEIが変化多数の機能を有するが、それは以前にNET堆積が、クロマチン脱凝縮、核の脱顆粒及び好中球の死12の閉塞を通してNEIによって阻害され得ることが示されている

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="983">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:75px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:573px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">305-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextran hydrochloride (powder)</td>
			<td style="width:75px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">DE130</td>
			<td>6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RPMI-1640 Medium with L-glutamine</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">350-000-CL</td>
			<td>3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">BD Pharm Lyse Lysing buffer</td>
			<td style="width:75px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:75px;">Sigma-Alrdrich</td>
			<td style="width:119px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse1</td>
			<td>Roche</td>
			<td style="width:119px;">11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F12 DMEM</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">319-075-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CFSE</td>
			<td style="width:75px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm)</td>
			<td style="width:75px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simplified human neutrophil extracellular traps (nets) isolation and handling

好中球細胞外トラップ（ネットは）最近、好中球の抗菌装備一式の一部として同定されている。別に感染との戦いにおける役割から、最近の研究は、それらが癌の進行を含む多くの他の疾患プロセスに関与し得ることを実証した。精製されたネットを分離すること、これらの機能の研究を可能にする重要な要素である。 このビデオでは、我々は容易に入手可能な試薬を用いて、ヒト全血からの無細胞NET単離の簡便法を実証する。単離されたNETは、その後、免疫蛍光染色、ブロッティングまたは様々な機能的アッセイのために使用することができる。これは、好中球自身の潜在的な交絡効果がない場合に、それらの生物学的特性の評価を可能にします。 密度勾配分離技術は、健康なドナーの全血から好中球を単離するために使用される。単離された好中球は、その後12-マイアにより刺激されるNETosisを誘導するISTATE 13-アセテート（PMA）。活性化された好中球は、その後破棄され、無細胞NETストックが得られる。 次に、A549ヒト肺癌細胞との接着アッセイにおいて使用することができる方法を孤立のNET実証する。 NETストックをコーティングするために追加された96ウェル細胞培養プレートのO / Nであり、ウェルの底に適切なNET単層形成を確認した後、CFSEで標識したA549細胞のウェルに使用される。接着細胞を、ニコンTE300蛍光顕微鏡を使用して定量化される。いくつかのウェルでは、1000U DNAse1はネットを分解するために数え10分前に追加されます

NETは静的接着アッセイの成功の達成は、癌細胞の添加前のNETの単層（ 図1）を有するウェルの適切なコーティングを必要とします。それ以降のすべてのステップは、その層を破壊しないように注意して行う必要があります。のNETの適切な層を形成する場合には、 図2Aおよび図2Cに示すようにのNETに大きな癌細胞の接着を見ることが期待される。この効果は、 図2B及び図2Dに示すようにのNETを分解するDNAse1の添加によって抑止される。逆に、車両制御（ 図3）の存在下でのNETにA549接着の有意な減少があってはならない。高倍率視野（HPF）当たりの平均癌細胞接着の良好な推定を得るためには、ウェル当たり少なくとも4つのランダムHPFSをカウントすることが推奨される。よく、技術的な問題が原因のNETでコーティングされていないフィールドはCOUNのために考慮されるべきではないこれらとしての設定結果を改ざんする可能性があります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52687/52687fig1.jpg" /> 図1. NET単層。（A）は、均一のNETの単分子層を通してだけでなく、のNETの中断された層を有するウェルの（B）不満コーティングに反対を示したのNETでコーティングした96ウェルプレートのウェルの光学顕微鏡像。スケールバーは40μmで表す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52687/52687fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52687/52687fig2.jpg" /> インビトロでのネットに図2. A549癌細胞の接着。（A）A549癌細胞（矢印）、in vitroでのNETの単層に付着する。 （B）AdditiDNAse1のに有意に癌細胞接着のレベルを減少させる。 （C）は（C）の前及びDNAse1の（D）を添加した後、蛍光顕微鏡（ニコンTE300）の下で蛍光灯下でのNET上の癌細胞の接着の代表的な画像を示す。スケールバーは40μmで表す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52687/52687fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52687/52687fig3.jpg" /> インビトロ接着アッセイ。グラフパッドソフトウェア図3.結果のNETにA549肺癌細胞接着アッセイからの結果をプロットし、分析した。 DNアーゼの存在下では、接着は、未処理のNETと比較して13.90パーセントであった。ビヒクル対照（VC）の存在下で、接着は、未処理のNETと比較して77.26パーセントであった。データは平均として提示される+/-SEM。有意性は、**はp &lt;0.001をクラスカル·ワリス検定を用いて決定した。

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Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

以下のプロトコールでは、容易に入手可能な試薬を用いて、ヒト全血からの好中球細胞外トラップ（のNET）を単離するための非常に簡単な方法を記載している。次に、単離されたNETは、癌細胞を用いたin vitro接着アッセイにおいて使用することができる方法を示す。

簡体ヒト好中球細胞外トラップ（のNET）の単離と取扱い

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

29.7K ビュー.  McGill University. 以下のプロトコールでは、容易に入手可能な試薬を用いて、ヒト全血からの好中球細胞外トラップ（のNET）を単離するための非常に簡単な方法を記載している。次に、単離されたNETは、癌細胞を用いたin vitro接着アッセイにおいて使用することができる方法を示す。 

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Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

好中球細胞外トラップ：それらを生成して可視化する方法

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

免疫・感染学

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

ヒト好フローチャンバー接着アッセイ

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

脂質好中球の変化と好中球細胞外トラップのその後の形成を研究する方法

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are networks of DNA, histones and neutrophil proteins. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay.

イヌ好中球細胞外トラップリリースの定量化のためのシンプルな蛍光アッセイ

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

共焦点顕微鏡を用いた可視化マクロファージ細胞外トラップ

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in diameter. MPs are a newly evolving, important part of cell-to-cell communication and signaling machinery. Because of their size and the nature of their release, until recently MP existence was overlooked. However, with improved technology and analytical methods their function in health and disease is now emerging. The protocols presented here are aimed at isolating and characterizing PMN-MPs by flow cytometry and immunoblotting. Moreover, several implementation examples are given. These protocols for MP isolation are fast, low-cost, and do not require the use of expensive kits. Furthermore, they allow for the labeling of MPs following isolation, as well as pre-labeling of source cells prior to MP release, using a membrane-specific fluorescent dye for visualization and analysis by flow cytometry. These methods, however, have several limitations including purity of PMNs and MPs and the need for sophisticated analytical instrumentation. A high-end flow cytometer is needed to reliably analyze MPs and minimize false positive reads due to noise or auto-fluorescence. The described protocols can be used to isolate and define MP biogenesis, and characterize their markers and variation in composition under different stimulating conditions. Size heterogeneity can be exploited to investigate whether the content of membrane particles versus exosomes is different, and whether they fulfill different roles in tissue homeostasis. Finally, following isolation and characterization of MPs, their function in cellular responses and various disease models (including, PMN-associated inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Diseases or Acute Lung Injury) can be explored.

New protocols are described here to isolate and characterize microparticles derived from human and mouse neutrophils. These protocols utilize ultracentrifugation, flow cytometry, and immunoblotting techniques to analyze microparticle content, and they can be used to study the role of microparticles derived from various cell types in cellular function.

分離と機能研究の好中球由来の微粒子のキャラクタリゼーション

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

体外蛍光顕微鏡による犬の好中球細胞外トラップ形成: ダイナミックな定量的分析

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

NETQUANTを用いた好中球細胞トラップの自動画像ベース定量

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

高スループット アッセイを行い好中球細胞外トラップ形成の定量化

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...