Bu eser hibe Monash Üniversitesi, Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi ve Monash akciğer ve uyku Enstitüsü tarafından finanse edildi. Yazarlar Imaging confocal mikroskobu ile Klinik İmmünoloji Monash sağlık, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass ve Camden Lo, Monash mikro Imaging (MMI) personel yardım için teşekkür etmek istiyorum ve yazarlar MMI İmkanları kabul Monash Üniversitesi. Yazarlar imkanları ve Monash Histoloji platformu bilimsel ve teknik yardım kabul edersiniz.

yılında deneyler bu iletişim kuralı izler: (1) insanlar tarafından Etik Komitesi, Monash Tıp Merkezi ve Melbourne Üniversitesi Etik Komitesi hayvanlar (2).
 1. Bronchoalveolar lavaj (BAL) makrofajlar <ol><li>Kullanım akciğer makrofajlar edinmek için BAL: (1) insan denekleri Bronkoskopi 6 ve (2) fareler tarafından içi trakeal aspirasyon kullanarak 13 . 
	Not: Makrofajlar edinimi genellikle bazı etkinleştirme bu hücrelerinin neden olur. Makrofajlar potansiyel bir tıbbi sorunu araştırmak için Bronkoskopi gerektirir hastalardan elde edilen ve tüm konular (bunun için tek tek her proje belirlenecek gerekir) METs çözümlenmesi için uygun olabilir.
	<ol><li>BAL çözüm ve (10 min için 500 x g) aşağı spin için bir Pelet biçiminde, iki kez kültür orta (Roswell Park Memorial Enstitüsü orta (RPMI) ile % 5 fetal buzağı serum ve % 1'l-glutamin) oda sıcaklığında yıkayın ve hücre kültür medi 4 ml seyreltik Um.</li>
		<li>Gerekirse, istek resmi bir fark sayısı; hücrelerin çoğu (genellikle &#62; % 80) makrofajlar 6 olacak. 
		Not: Bu genellikle farklı hücre türleri 6 morfolojik görünümünü kullanarak bir klinik Histoloji hizmeti tarafından gerçekleştirilecek.</li>
		<li>Gerçekleştir uygun makrofaj hücre saymak Trypan mavi dışlama ve bir hemasitometre kullanarak BAL çözüm. 
		Not: BAL çözüm insan ve fare 1.1 adımda belirtildiği gibi elde edilir.</li>
		<li>Ekle 1-4 x 10 5 makrofajlar kültür orta iyi ve bırakın başına 500 µL coverslips 24-şey plakaları için 37 ° C'de gecede; hücreleri coverslips için uygun olacaktır. İnsan örnekleri için antibiyotik ekleyin (örneğin, penisilin ve streptomisin, 10 4 U/mL) bakteriyel kontaminasyonu önlemek için.</li>
	</ol></li></ol> 2. Ayirt etiketleme/mikroskobu BAL makrofajlar, Not: yukarıda da belirtildiği gibi hücreleri coverslips yapıştırılır.
<ol><li>Kültür orta kaldırmak ve fosfat tamponlu tuz (PBS) bir kez hücrelerle yıkayın. % 2 paraformaldehyde/periodate/lizin (PIP) sabitleştirici 10 dakika süreyle hücreleri tamir</li>
	<li>Yıkama PBS kısaca hücrelerde ve %0,2 permeabilize ara 20 dakika sonra 20 dakika süreyle PBS</li>
	<li>Blok hücreleri % 10 tavuk sera içinde %5 sığır serum PBS için 30 dk içinde seyreltilmiş albumin (BSA) ile</li>
	<li>Incubate ilköğretim ve izotip kontrol ile antikor için konsantrasyonlarda (daha özel ayrıntıları Malzemeler tablo içinde listelenen) 1: 100 37 oda sıcaklığında 1 h ° C. 
	Not: BAL örnekleri için belirli bir işaretleyici makrofajlar, genellikle gerekli değildir.</li>
	<li>Birincil antikorlar eklenmesi sonra PBS hücrelerde yıkama ve daha fazla oda sıcaklığında 40 min için ilgili ikincil antikorlar ile kuluçkaya.</li>
	<li>PBS ve montajı ile DAPI tabanlı montaj orta confocal mikroskop lazer uyarilmalar 405, 488, 561 ve 647 nm ve X 40 at (yukarıda belirtildiği gibi) kullanarak görselleştirme için bölümlerde yıka, 1.0 NA petrol hedefi.</li>
</ol> 3. Akciğer doku örnekleri Not: için in vivo çalışmalar Akciğer doku örnekleri ilgili maruz kaldıktan sonra çalışma (O tarafından açıklandığı gibi örneğin, &#39; Sullivan vd. 7). bu deneme için en uygun pozlama bulaşıcı mikroorganizmalar, özellikle bakteri vardır. Bu yöntem için kullanılabilecek fare suşları C57BL/6 veya BALB/c fare, 10-12 hafta yaşlı, ağırlık 25-30 g ve erkek vardır.
<ol><li>Ketamin (400 mg/kg) ve xylazine (40 mg/kg) mayi bir enjeksiyon yoluyla Euthanize fareler. Göğüs boşluğuna açın ve akciğer ve kalp cerrahi forseps ve makas kullanarak ortaya çıkarmak.
	<ol><li>Sıcak PBS 30 kapları kandan dışarı yıkamak için sağ ventrikül 21'lik iğne kullanarak demlemek s, 10 mL % 2 PIP sabitleştirici 30 demlemek s (içine sağ ventrikül).</li>
		<li>Sıcak PBS (42 ° C) lavaj açık göğüs boşluğu kullanın. Trakea 21'lik iğne ve boyutuna, kesme 0.8 mm boru parçası ile entübasyon ve Önceden ısıtılmış (için 42 ° C), 800 µL enjekte, düşük erime noktası % 3 özel çözüm.</li>
		<li>Kravat Trakea örgülü ipek (4.0 USP) ile kapalı. Hemen altında kanül, ekleme noktasını Trakea etrafında iplik yerleştirin ve basit bir yukarıdan aşağı düğüm güvenli. Özel kuvvetlendirmek için akciğer çevresinde buz gibi PBS yönetmek. Akciğer ve kalp makas ve künt diseksiyon kullanarak göğüs boşluğuna bir blok olarak kaldırın. Her akciğer tek tek kaldırmanız ve sonra onları saptamak için 2 16 h % PIP veya formalin 4 ° C.</li>
		<li>Örnekler doku kesit kadar 4 ° C'de PBS içinde saklayın. Akciğer dokusu elde etmek için bu yöntemleri yukarıda açıklanan 13 olmuştur.</li>
	</ol></li> <li>Akciğer doku hazırlamak için örnekler aşağıdaki adımları kullanın.
	<ol><li>Düzeltme akciğer dokuları (3.1 adımda rezeke) doku % 10 formalin oda sıcaklığında 24 h için doğal arabelleğe alınmış. Aktarım için % 75 etanol ve 12 h döngüsü (2.5 s %75 alkol, 3 h mutlak alkol, Çözücü 3B ve 3 h parafin için 3,5 h) doku işlemcide koymak.</li>
		<li>Embed içinde oda sıcaklığında saklanan formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) blok oluşturmak için standart parafin. 
		Not: Bu aşamada, akciğer bölümler standart slaytlar için kesmek genellikle uygun.</li>
		<li>4-5 µm kalınlık bir microtome kullanarak FFPE akciğer bölümleri kesme ve ücret, daha önce O tarafından açıklandığı gibi kaplanmış slaytlar üzerinde monte &#39; Sullivan vd. 7</li> <li>Slaytlar bağlamak, 60 x 24 mm coverslips (boyutu 1,5) Montaj orta 3 damla koymak, slayt coverslip üzerinde ters çevir ve aşırı orta itmek için. Hermetik oje ile mühür ve mağaza oda sıcaklığında.</li>
	</ol></li></ol> 4. Hazırlık/mikroskobu Akciğer doku örneklerinin <ol>de-wax, suyla temasa ve FFPE Akciğer doku örneği antijen alma çözümü ile pretreat için <li>.
	60 ° C'de 60 dk için FFPE <ol><li>fırın kuru slaytlar Sonra slaytlar Ksilen çözüm 30 dk ve transfer için % 70 etanol çözüm oda sıcaklığında 5 min için koymak. Musluk suyu durulama.</li>
		<li>Yer ısı geçirmez plastik wrap ve HIER-antijen alma bir düdüklü tencere 10 10 dk içinde tabi m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9.0. 5 min bir rock'çı, sonra bir kez PBS ile rocker için musluk suyundaki iki kez 20 dk. yıkama için serin.</li>
		<li>% %5 10 tavuk serum ile blok BSA/PBS, oda sıcaklığında 30 dk için.</li>
	</ol></li> <li>Doku leke.
	<ol><li>METs makrofajlar tanımlamak, birincil antikorlar (MMP-9, H3Cit ve F4/80) % 1'eklemek için BSA/PBS 1/100 seyreltme (antikor tutarlarla ilgili belirli ayrıntıları Malzemeler tablo içinde listelenen) yönü 4 ° C'de 16 h için. Bir rocker üzerinde 5 min için PBS ile iki kez yıkayın.</li>
		%1 <li>elde floresan algılama ile ilgili ikincil kuluçka tarafından antikor BSA/PBS 40 dakika oda sıcaklığında. Antikor vardır: (1) tavuk Anti-fare 488 (yeşil), (2) tavuk Anti-keçi 594 (kırmızı) ve (3) eşek Anti-fare 647 (çok kırmızı).</li>
		<li>PBS ve montajı ile Kromatin boyama için montaj orta DAPI içeren bölümlerde yıkayın.</li>
	</ol></li> <li>Floresan görüntü ters bir mikroskop bağlı kafa tarama confocal lazer kullanarak elde.
	<ol><li>Excite 405, 488, 561 ve 647 hazırlıkla nm lazerler. Çizgi-sıralı üzerinde tıklatarak tek uçak 512 x 512 piksel görüntü yakalama, 20 X 0,1 kullanarak (2 satır ortalama) düğme tesviye NA hava ve 40 X 1.0 NA petrol hedefleri.</li>
		<li>Elde etmek için analiz bölümüne ve veri (örneğin, 10 yüksek güçlü alanları bakış açısı (HFOV) denetimi, uyarılmış örnek, vb, her fare için 10) her sonuç için başına en az on alanları bakış. 
		Not: tüm alanı temsil edici bir örnek almak için bir matris sistemi hangi alanı ayrılmıştır kullanılabilir içine farklı bölümler ve aynı matris görüş alanları seçmek için kullanılan farklı her örnek için (örneğin, alan 9 bölümlere ayrılabilir ve merkezi ve 4 köşe, iki HFOV alınır).</li>
	</ol></li></ol> 5. Üç boyutlu (3-D) görüntüleme, METs Not: METs 3-b yapılardır gibi birden çok z-yığın alarak yeniden, görüntüler, değerli bilgiler verebilir.
<ol><li>200 µm 1.8 mm ve hız 0.1-0,5 olarak ayarlamak bir genlik adlı bir vibratome kullanarak, parafin blok gelen akciğer numuneler bölümünde mm/s.</li>
	<li>Blok akciğer dokusu ile ilgili serum (% 10 fetal buzağı serum ve % 10 tavuk serum) % 20'si ve takıma PBS ve %3,75 permeabilize Triton-X 100 nazik ajitasyon altında oda sıcaklığında 7 h için.</li>
	<li>Bölümleri ile ilgili birincil antikorlar (MMP-9, H3Cit ve F4/80) 4 ° C'de 16 h için microcentrifuge tüpler (antikor konsantrasyonları Malzemeler tablo içinde listelenen) 200 µL cilt leke.</li>
	<li>PBS, 1 h için oda sıcaklığında ilgili ikincil antikorlar ile kuluçka önce 10 dakika için 3 kez bölümlerde yıkama</li>
	<li>Kapak paket fişi için mikroskop ekleme PBS içinde slaytlar önce akciğer bölümler 20 dk, çözüm DAPI (1:5, 000) için leke.</li>
	<li>405 ile donatılmış bir confocal ters mikroskop (40 x 1.3 NA) kullanarak floresan görüntü elde nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm ve 635 nm lazerler.</li>
	<li>3-b z-yığınları 0,54 µm kalınlık 40 x 1.3 NA petrol amaç için en iyi z kesit ile rekor. 
	Not: kullanılan yazılım bireysel mikroskop bağlı olarak değişir. Nasıl belgili tanımlık bilgisayar yazılımı-ebilmek var olmak kullanılmış için bir mikroskop bir örneği ek dosya 1 ' de sağlanan.</li>
</ol> 6. Görüntü analizi Not: analiz örnekleri belirli görüntüleme analizi yazılımı kullanımı gerektirir ve örnekler Malzemeler tablo içinde listelenir. Analiz sonuçlarının kullandığınız belirli programa bağlıdır iken, listelenen aşağıdaki önemli noktalardır.
<ol><li>Mavi kanal DAPI için seçerek ve hücrelerin en az boyutu atama BAL analiz örnekleri <ol><li>tanımla makrofajlar sayısı (örneğin, &#62; çapı 18 µm). İlgili yazılım kullanarak makrofajlar her alanı için toplam sayısını ölçmek.</li>
		<li>Hücre dışı Kromatin DAPI tarafından diğer işaretleri (örneğin, MMP12, PAD2 ve H3Cit) Co ifade ile tespit varlığı ile bir MET özelliklere sahip hücreleri say. 
		Not: Analiz edilebilir işaretleri sayısı lazerler kullanılabilir sayısına bağlıdır, ancak ideal DAPI ek olarak, en az iki başka işaretleri dahil edilmelidir. Diğer daha az belirli parametreleri MET ifade (örneğin, hücreleri ekstrasellüler Kromatin ve genişlemiş bir çekirdeğe sayısı) için kullanılabilir.</li>
		<li>BAL MET ifadede karşılaştırmak için en az 100 BAL makrofajlar örnek başına örnekleri (Denetim arasında duman, duman/Dnaz tedavi grupları), analiz.</li>
		İkincil antikor ve izotip ölçmek için <li>kontrol Floresans düzeyde; en az 100 her örnek için onların Floresans hücrelerde ölçmek. Arka plan floresan (örneğin, H3Cit) her işaretçi için ortalama düzeyini ölçmek standart yazılım kullanarak.</li>
		<li>MET ifade, tanımlamak için tipik fenotip (örneğin, H3Cit ve MMP9 ortak ifadesi ile hücre dışı Kromatin) içeren hücreleri saymak ve her MET Floresans işaretleri (örneğin, H3Cit ve MMP9) düzeyini ölçmek. Eğer onların boyama arka plan ve izotip kontrol değildi METs üreten hücreleri dışlamak.</li>
		<li>İnsan BAL örnekleri için en az 100 hücre METs yapmak makrofajlar yüzdesi için her örnek için analiz. Fare örnekleri için hücreleri daha küçüktür ve METs daha sert tanımlamak için olarak, daha büyük bir sayı (örneğin, 200 makrofajlar) her örnek için hücre analiz.</li>
	</ol></li> <li>Analiz Akciğer doku örnekleri <ol><li>METs huzurunda Akciğer doku belirlemek için belirli makrofaj marker F4/80 gibi kullanın.</li>
		<li>6.1 bölümünde listelenen diğer parametrelerle ekstraselüler Kromatin hızlı hücrelerdeki F4/80 co lokalizasyonu kullanarak akciğer dokusunda METs varlığı tanımlayın.</li>
		<li>Arka plan Floresans örneklerinde ile ikincil antikor düzeyleri ve izotip denetimlerini belirler. Arka plan üstüne olmayan analiz METs dışlamak.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin?.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?.</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).</li><li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+balancing:+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases.">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers immunol. 4, 1 (2013).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression.">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).</li><li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).</li><li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).</li><li>Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PAD4+in+NET+formation.">Activation of PAD4 in NET formation.</a> Front Immunol. 3, 360 (2012).</li><li>Lewis, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PAD4+activity+is+sufficient+to+disrupt+mouse+and+human+NET+formation.">Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation.</a> Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).</li><li>Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+the+IL-6+Trans-Signaling/Mechanistic+Target+of+Rapamycin+Complex+1+Axis+in+Pulmonary+Emphysema.">Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema.</a> Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).</li><li>Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps.">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell host &amp; microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li><li>Wong, K. W., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+exploits+human+interferon+gamma+to+stimulate+macrophage+extracellular+trap+formation+and+necrosis.">Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis.</a> J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).</li></ol>

Yazarlar ile ilgili olarak bu işi yapmak için hiçbir açıklamalar var.

Bu derlemede açıklanan yöntemi tabanlı ağlar14varlığı tanımlamak için kullanılan tarih. Makrofajlar tarafından çok BAL örneklerinde baskın hücre tipi vardır ve bu yöntem koleksiyon METs eğitimi için özellikle uygundur. Kırmızı kan hücreleri içinde BAL varsa, bu hücreleri amonyum klorür kullanarak lysed. BAL yordam genellikle makrofajlar devreye giriyor ve bu nedenle bu METs un uyarılmış örnekleri mevcut olacak bekleniyor. BAL makrofajlar genellikle çok yapışık. Bu hücreler baskın hücre tipi vardır ve aynı zamanda onların morfolojisi tarafından ayırt edilebilir gibi BAL makrofajlar genellikle belirli bir işaretleyici gerek kalmaz. Genellikle bir BAL, hücrelerin % 80'i makrofajlar (ve nötrofil % 5'den az), büyük ve sonra birden çok yıkar, genellikle sadece yapisan lökosit (Yani, makrofajlar)6kalır. İnsanlarda nötrofiller makrofajlar ayırmak için yetenek hakkında şüphe varsa, nötrofil bir işaretleyici nötrofil elastase gibi kullanılabilir. Akciğer dokusunda makrofaj diğer hücre türlerinden ayırt etmek zor olduğu gibi bir belirli makrofaj işaretleyici (örneğin, F4/80) gereklidir. Arka plan ve izotip denetimlerini önemlidir bu yüzden makrofajlar otomatik Floresans var; Bu özellikle teşvik örnekleri ile durumdur.
METs varlığı tanımlamak için en iyi yolu belirlenecek kalır. Belirli yolları/süreçler, nötrofiller ve makrofajlar için ortak olan vardır: (1) taneli proteaz, Histon ve PAD (3) citrullination (2). PAD2 monosit/makrofajlar içinde daha belirgin iken PAD4 nötrofiller için daha belirlidir. Fare makrofajlar, iyi kabul edilen avans F4/80 kullanılır ama insan makrofajlar gibi iyi tanımlanmış işaretleri var mı ve bu insan Akciğer doku MET ifade değerlendirirken sorunları oluşturabilecek. MET ifade akciğer dokusunda analiz birçok hücre türleri ve METs alveoler duvarlar basılması eğilimi olarak daha zor olabilir. Ne zaman onlar are düz kesit doku bölümleri analiz ederken, METs en iyi görüntülenir; METs bir MET olup olmadığını belirlemek zor olabilir farklı bir düzlemde ise mevcuttur. Bu sorunu bir ölçüde METs ve farklı yönleriyle METs görselleştirmek için potansiyel incelenmesi için daha derin doku (3-b) uçaklar etkinleştirmek için z-yığınlar yaparak ele alınması.
METs varlığı akciğer örneklerinde tanımlamak için iyi kabul edilen bir yöntem değil. Açıklanan yöntemleri ağlar görüntülenmesi için kullanılan temel alır. Chow vd. mitojenle PMA makrofaj hücre kültürünü METs indüklenen hücre dışı Kromatin15varlığı ile değerlendirildi olarak nitelendirdi. Bir sonraki çalışma Mycobacterium tüberküloz METs in vitro hücre dışı Kromatin ve H3Cit16varlığı tarafından tanımlandığı gibi indüklenen gösterdi. Biz manken glomerülonefrit, METs mevcut ortak yerelleştirilmiş Kromatin, Histon ve myeloperoxidase7tarafından tanımlandığı şekilde böbrek vivo göstermiştir. Son olarak, hücre dışı Kromatin ve MMP126birleşimiyle METs vitro insan akciğer makrofaj olarak varlığını göstermiştir. Bizim yöntem diğer müfettişler tarafından inflamatuar yanıt bu önemli faset araştırma için kullanılabilir.
METs önemli bir rol kronik enflamatuar hastalığı olduğu kabul edilecektir muhtemeldir. Hala iyi tanımlanmış NETosis için yol işlemlerdir. METs çalışmanın önemli anlayışlar içine tuzak oluşum mekanizmaları sağlayabilir. Daha fazla geliştirme daha fazla işaretçileri olan iletişim kurallarının ve METs fonksiyonel çalışmaları METs rolü hastalığında tanımlayabilirsiniz.
Biz bu protokol için belirledik kritik adımlar vardır. İnsan BAL örnekleri ikincil bakteriyel kontaminasyon olması muhtemeldir ve kültür orta antibiyotik kullanımı kirlenme sınırlandırmak için önemlidir. Birincil ve ikincil antikor bile ile aynı üreticinin kendi Floresans değişebilir. Son olarak, akciğer doku örnekleri analiz daha BAL örnekleri daha karmaşıktır ve standartlaştırılmış bir yaklaşım geliştirmek için zaman gerektirir.

Nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar), ilk olarak Brinkmann vd tarafından açıklanan 1 onlar enfeksiyon (özellikle bakteri) yanıt olarak ağırlıklı olarak üretilen ve konak savunma1,2' önemli bir role sahiptir. Onlar da yanıt olmayan bulaşıcı hastalık, vaskülit ve sistemik lupus Eritematozus (SLE); de dahil olmak üzere için gerçekleşmesi için tarif edilmistir ve mitojenle phorbol 12-myrisate 13-asetat (PMA)2,3. Bu son zamanlarda diğer hücre tipleri aynı zamanda hücre dışı tuzakları, makrofajlar da dahil olmak üzere neden olabilir kabul edilmiştir. Makrofaj hücre dışı tuzakları (METs) henüz edebiyat4,5iyi tanımlanmış bir varlık değildir. Biz son zamanlarda METs olup olmadığını belirlemek için yöntemleri kurduk vitro ve in vivo6,7. Bu makalede, METs confocal mikroskobu kullanılarak ölçüm açıklanacaktır.
Kromatin ile birlikte ekstrüzyon (gibi Apoptozis8) hücresel diğer yolları ayırmak NETosis temel özellikleri şunlardır: (1) citrullination histonlarla (H3Cit)9, (2) ortak ifade granül proteaz10 ve peptit arginin deiminase (PAD) 4 (3) katılımı11,12. Makrofajlar da ifade H3Cit, granül proteaz ve PAD ve bu özellikler METs varlığı tanımlamak için kullanılabilir.
METs makrofaj baskın hücre mevcut alveoller ve akciğerin airways ve hücresel immün yanıt enfeksiyon/iltihap için yönetmenlik ilk rolü vardır akciğerde, özellikle önemli bir rolü olabileceğini. Akciğer çok boş alanı (örneğin, içinde alveoller), Ayrıca, METs içine belgili tanımlık yer elde edilebilir, sağlam organların aksine genişletmek potansiyel olarak mümkün iken.
NETs varlığı tanımlamak için en çok kullanılan tarafından confocal mikroskobu yöntemidir. Henüz METs ölçmek için açıkça tanımlanmış bir yol değil. NETs ölçme tekniği METs huzurunda bu protokolü ölçmek için adapte edilmiştir. Bu yöntemin temel gereksinimleri confocal mikroskobu ve uygun görüntüleme yazılımı erişim analizi için vardır.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Human samples: Primary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human MMP12</td><td>Novus Biological</td><td>NB110-57214</td><td>1:100 concentration not quantifiable</td></tr><tr><td>Mouse anti-human MMP9</td><td>Novus Biological</td><td>AB119906</td><td>1:200 ascites, no concentration given</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human PADI2/PAD2</td><td>Abcam</td><td>AB16478</td><td>7 ug/ml</td></tr><tr><td>Mouse anti-human PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ug/ml</td></tr><tr><td>Sheep anti-human NE</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mouse samples: Primary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse MMP9</td><td>Abcam</td><td>AF909</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rat anti-mouse F4/80</td><td>In-house (hybridoma)</td><td>In house</td><td>20 ug/ml</td></tr><tr><td>Sheep anti-human Anti-HNE /NE</td><td>Sapphire Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>Mouse anti-human &amp;shy;&amp;shy;&amp;shy;&amp;shy;PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ug/ml</td></tr><tr><td>Super-frost plus slides</td><td>Menzel</td><td>S41104A</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-prolong gold</td><td>Molecular probes</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9434</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Secondary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 488/</td><td>Life technologies</td><td>A-21441</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-21442</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-goat AF 594</td><td>Life technologies</td><td>a-21468</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-mouse AF488</td><td>Life technologies</td><td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-sheep AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11018</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-mouse AF 647</td><td>Life technologies</td><td>A-21463</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-sheep AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Isotype control</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1</td><td>BD Bioscience</td><td>550878</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG2a</td><td>BioLegend</td><td>400201</td><td></td></tr><tr><td>Sheep IgG</td><td>In house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software Programs&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 Confocal scanning microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV1200 Confocal scanning microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue sources&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>r8758</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sudan black</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27387</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2753</td><td></td></tr><tr><td>Natural formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42904</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576</td><td></td></tr><tr><td>Solvent 3B</td><td>Hi-Chem</td><td>2026</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 12 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1815</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 60 x 24 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6875</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mice&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>c57 black 6</td><td>Monash animal research platform (MARP)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c</td><td>MARP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy

Confocal mikroskobu, nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) varlığı tanımlamak için kullanılan bir birincil yöntemidir. Makrofaj hücre dışı tuzakları (METs) görselleştirmek için kurulan confocal mikroskobu yöntemleri değiştirdiniz. Bu hücre dışı tuzakları ekstraselüler Kromatin varlığı granül proteaz, citrullinated Histon ve peptit arginase deiminase (PAD) gibi diğer bileşenlerinin ortak ifade ile tanımlanır. METs ifade genellikle bir uyarana maruz kaldıktan sonra ölçülen ve un uyarılmış örnekleri karşılaştırıldığında. Örnekleri de arka plan ve izotip kontrol için yer almaktadır. Hücreleri iyi tanımlanmış görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir. Confocal mikroskobu METs varlığı tanımlamak için kullanılan vitro ve in vivo akciğer dokusunda.

METs BAL örneklerinden, akciğer dokusu ve 3-b görüntülerle daha kalın akciğer bölümlerde görüntülenmeyecektir. Bir BAL örnek görüntülenir METs örneği şekil 1' de gösterilen. METs morfolojisi olgunlaşma onların sahne göre değişir. Mikroskobu ilk tespit özelliğini hücrenin kenarını çekirdeğine harekettir. Bu H3Cit ve granül proteaz gibi diğer ortak ifade arabulucu ile hücre dışı Kromatin tarafından takip ediyor. Önceki aşamada hücre hala ifade ekstraselüler tuzak ile kabaca küresel bir şekli vardır. Daha sonraki aşamalarında, MET oluşumu hücre gövdesi uzama ile karakterizedir.
Akciğer dokusu METs Şekil 2' de gösterilmiştir. Akciğerleri sıvı ile akciğer mimarisi tanımlamak için şişirilmiş gibi METs genellikle alveoler duvarlara karşı itti. METs morfolojisi da bağlı olarak uçak doku kesildi değişecektir. Akciğer doku örnekleri için kullanılan standart bölümler 4-5 µm kalınlığında olan. Alınması gereken birden fazla resim daha kalın doku bölümleri etkinleştirmek ve METs daha sonra 3 boyutlu görülebilir. Antikor sadece defa akciğer dokusu içine nüfuz ve 25-50 µm bölüm kalınlığı en uygunudur. 3 boyutlu bir görüntü örneği şekil 3 ve Video 1gösterilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig1.jpg"> 
Şekil 1: BAL METs. İnsan BAL METs geliştirme farklı aşamalarında stimülasyon sonra kurdu. METs ekstraselüler Kromatin H3Cit ve MMP9 ortak ifadesi ile karakterize. (A)Kromatin, (B) H3Cit, (C) MMP9 ve (D) için Birleştirilen görüntüyü boyama. Paneli ekler izotip denetimleridir. Ölçek çubukları 10 µm (izotip için 15 µm) =. Bir İngiliz kontu sahne MET sağ üst köşede gösterilir ve kabaca küresel bir şekli vardır. Daha olgun bir MET tarlanın ortasında gösterilir. Görüntüleri tarama confocal mikroskop ve 40 x 1.0 NA petrol objektif bir lazer kullanarak alındı. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56459/56459fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig2.jpg"> 
Şekil 2: Akciğer doku METs. Fare METs Akciğer doku stimülasyon sonra. METs ortak ifade H3Cit, MMP9 ve F4/80 ile hücre dışı Kromatin (makrofaj marker olarak) ile karakterize. Paneli(a)bir tipik yüksek güçlü Metler sayısını ölçmek için kullanılan görüş alanı gösterir; Paneller (B-F) kesik kare alanı daha yüksek büyütme altında göster. (B) Kromatin, (C) H3Cit, (D) MMP9, (E) F4/80 ve (F) için Birleştirilen görüntüyü boyama. INSERT izotip kontrol paneldir. Ölçek çubukları 20 µm (izotip için 20 µm) =. METs genellikle alveoler duvarlara karşı itilir. Görüntüleri tarama confocal mikroskop ve 40 x 1.3 NA petrol objektif bir lazer kullanarak alındı. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56459/56459fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig3.jpg"> 
Şekil 3: üç boyutlu görünümü akciğer bölümünün. Fare Akciğer doku sabit ve 25-35 µm kalınlığında bölümlere kesti. Doku işaretleri ile METs için etiketli ve 1 µm kalınlık bölümleri ile görüntüsü. Görüntüleri bir z-bir MET 3 boyutlu bir resmini oluşturmak için yığın ile kombine edilmiştir. Görüntüleri tarama confocal mikroskop ve 40 x 1.3 NA petrol objektif bir lazer kullanarak alındı. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56459/56459fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/56459/56459video1.jpg"> 
Video 1: üç boyutlu görünümü akciğer bölümünün. Video örnekleri şekil 3' te sunulan karşılık gelir. Eksen keneler 5 µm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56459/Mets_1.avi" target="_blank">lütfen buraya tıklayın bu videoyu izlemek için =. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Makrofaj hücre dışı tuzakları yeni açıklanan bir varlık vardır. Bu makale confocal mikroskobu yöntemleri üzerinde konsantre ve nasıl olduklarını vitro ve in vivo akciğer örneklerinden görüntülenir.

Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

visualizing-macrophage-extracellular-traps-using-confocal-microscopy

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Görüntüleme.  Monash Medical Centre. Makrofaj hücre dışı tuzakları yeni açıklanan bir varlık vardır. Bu makale confocal mikroskobu yöntemleri üzerinde konsantre ve nasıl olduklarını vitro ve in vivo akciğer örneklerinden görüntülenir.

Video: Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic inflammation. Neutrophil ETs (NETs) consist of a mesh of DNA, histone proteins, and various granule proteins (i.e., myeloperoxidase, elastase, and cathepsin G). Other immune cells, including macrophages, can also produce ETs; however, to what extent this occurs in vivo and whether macrophage extracellular traps (METs) play a role in pathological mechanisms has not been examined in detail. To better understand the role of METs in inflammatory pathologies, a protocol was developed for visualizing MET release from primary human macrophages in vitro, which can also be exploited in immunofluorescence experiments. This allows further characterization of these structures and their comparison to ETs released from neutrophils. Human monocyte-derived macrophages (HMDM) produce METs upon exposure to different inflammatory stimuli following differentiation to the M1 pro-inflammatory phenotype. The release of METs can be visualized by microscopy using a green fluorescent nucleic acid stain that is impermeant to live cells (e.g., SYTOX green). Use of freshly isolated primary macrophages, such as HMDM, is advantageous in modeling in vivo inflammatory events that are relevant to potential clinical applications. This protocol can also be used to study MET release from human monocyte cell lines (e.g., THP-1) following differentiation into macrophages with phorbol myristate acetate or other macrophage cell lines (e.g., the murine macrophage-like J774A.1 cells).

Presented here is a protocol to detect macrophage extracellular trap (MET) production in live cell culture using microscopy and fluorescence staining. This protocol can be further extended to examine specific MET protein markers by immunofluorescence staining.

Diferansiye İnsan Monosit türevi Makrofajlarda Hücre Dışı Tuzak Salınımının İn Vitro Stimülasyon ve Görselleştirilmesi

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). This study analyzes the morphological and compositional changes in NETs induced by microbial and chemical stimuli using standardized in vitro methodologies for NET induction and characterization with human cells. The procedures described here allow the analysis of NET morphology (lytic or non-lytic) and composition (DNA-protein structures and enzymatic activity), and the effect of soluble factors or cellular contact on such characteristics. Additionally, the techniques described here could be modified to evaluate the effect of exogenous soluble factors or cellular contact on NET composition.
The applied techniques include the purification of polymorphonuclear cells from human peripheral blood using a double density gradient (1.079-1.098 g/mL), guaranteeing optimal purity and viability (&#8805; 95%) as demonstrated by Wright's staining, trypan blue exclusion, and flow cytometry, including FSC versus SSC analysis and 7AAD staining. NET formation is induced with microbial (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida albicans) and chemical (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, and the NETs are characterized by DNA-DAPI staining, immunostaining for the antimicrobial peptide cathelicidin (LL37), and quantification of enzymatic activity (neutrophil elastase, cathepsin G, and myeloperoxidase). The images are acquired through fluorescence microscopy and analyzed with ImageJ.

Presented here is a protocol for the induction and analysis of in vitro neutrophil extracellular traps (NETs). Quantification of DNA, cathelicidin (LL37), and enzyme activity yielded data that show the variability in the composition and morphology of NETs induced by microbial and chemical stimuli under similar controlled conditions.

Mikrobiyal ve Kimyasal Uyaranlar Tarafından İndüklenen Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Morfolojik ve Bileşimsel Analizi

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Parafin-Gömülü Dokuda İnsan ve Mürin Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklarının İmmünofloresan Etiketlemesi

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Tıp

Nötrofil hücre dışı tuzakları görselleştirmek için boyama ve görüntüleme

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

Yazar Spotlight: İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklar Görüntüleme 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Macrophage Extracellular Traps

Source: Zhang, Y., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/60541">In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates in vitro stimulation of macrophage extracellular traps (METs) in human monocyte-derive macrophages using different inflammatory stimuli such as TNF-alpha, PMA, and HOCL. The video also demonstrates the method of SYTOX dye staining of METs for visualization.

Makrofaj hücre dışı tuzakların in vitro stimülasyonu ve görselleştirilmesi

1. Polarization of HMDM

	Under sterile conditions, prepare the M1 priming media by adding interferon &#947; (IFN&#947;; 20 ng/mL) and lipopolysaccharide ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

İmmünodiyagnostik

Görüntüleme ve Görselleştirme Teknikleri

Characterization of Macrophage Extracellular Traps in Mouse Lung Tissue Samples

Source: Sharma, R., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56459">Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we describe a protocol for the immunostaining and confocal microscopy-based visualization of macrophage extracellular traps (METs) in murine lung tissue. Tissue-resident macrophages are characterized by the expression of the macrophage-specific F4/80 surface glycoprotein marker, while METs are visualized by labeling the MET markers matrix metalloproteinase 9, citrullinated histone H3, and extracellular chromatin.

Fare Akciğer Dokusu Örneklerinde Makrofaj Hücre Dışı Tuzakların Karakterizasyonu

Source: Sharma, R., et al. Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we describe a protocol ...

Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Diferansiye İnsan Monosit türevi Makrofajlarda Hücre Dışı Tuzak Salınımının İn Vitro Stimülasyon ve Görselleştirilmesi

Mikrobiyal ve Kimyasal Uyaranlar Tarafından İndüklenen Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Morfolojik ve Bileşimsel Analizi

Parafin-Gömülü Dokuda İnsan ve Mürin Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklarının İmmünofloresan Etiketlemesi

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

Makrofaj hücre dışı tuzakların in vitro stimülasyonu ve görselleştirilmesi

Fare Akciğer Dokusu Örneklerinde Makrofaj Hücre Dışı Tuzakların Karakterizasyonu