تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من جامعة موناش والصحة الوطنية، ومجلس البحوث الطبية، والرئة موناش ومعهد النوم. الكتاب أود أن أشكر موظفي "المناعة السريرية" في الصحة موناش، جودي كالاهان وأليكس فوشيه، كيرستين الجاس وكامدن لو من موناش الصغرى التصوير (MMI) للحصول على تعليمات مع المجهرية [كنفوكل] التصوير، وتقر الكتاب المرافق MMI جامعة موناش. يعترف الكتاب المرافق، وتقديم المساعدة العلمية والتقنية من "منهاج علم الأنسجة موناش".

هذا البروتوكول يتبع التجارب التي تمت الموافقة عليها في: (1) البشر "أخلاقيات اللجنة من موناش الطبي المركز"، والحيوانات (2) لجنة الأخلاقيات التابعة لجامعة ملبورن.
 1-الضامة للفيسيولوجيا الغسل (BAL) <ol><li>"باستخدام ال" الحصول على الضامة الرئة في: الإنسان (1) مواضيع بالقصبات 6، و (2) الفئران باستخدام الشفط داخل الرغامى 13 . 
	ملاحظة: يؤدي الحصول الضامة عموما بعض التنشيط لهذه الخلايا. يتم الحصول على الضامة من المرضى الذين يحتاجون القصبات للتحقيق في مشكلة طبية محتملة وليست جميع المواضيع قد تكون مناسبة لتحليل ميتس (هذا سوف تحتاج إلى تحديد لكل مشروع على حدة).
	<ol><li>تأخذ الحل بال وتدور إلى أسفل (ز 500 x لمدة 10 دقائق) للنموذج بيليه ويغسل مرتين مع الثقافة المتوسطة (روزويل بارك التذكاري المعهد المتوسط (ربمي) مع مصل العجل الجنين 5% و 1% ل الجلوتامين) في درجة حرارة الغرفة، وثم تضعف الخلايا في 4 مل من الثقافة ميدي أم-</li>
		<li>إذا لزم الأمر، طلب رسميا العد التفاضلية؛ ومعظم الخلايا (عموما &#62; 80%) سوف تكون الضامة 6. 
		ملاحظة: هذا سوف عموما أن يؤديها خدمة علم الأنسجة سريرية استخدام مظهر مورفولوجك ل أنواع خلايا مختلفة 6-</li>
		<li>تنفيذ خلية سنخية قابلة للحياة الاعتماد على الحل بال باستخدام الاستبعاد تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير- 
		ملاحظة: الحل بال يتم الحصول عليها من البشر والفئران كما هو مذكور في الخطوة 1، 1-</li>
		<li>إضافة 1-4 × 10 5 الضامة إلى لوحات 24-جيدا في كوفيرسليبس في 500 ميليلتر للثقافة المتوسطة كل بئر وإجازة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية؛ وسوف تلتزم الخلايا كوفيرسليبس. بالنسبة للعينات البشرية، إضافة المضادات الحيوية (مثل البنسلين وستربتوميسين، 10 4 U/mL) لمنع التلوث البكتيري.</li>
	</ol></li></ol> 2. الفلورة التالي/مجهرية من "الضامة بال" ملاحظة: يتم التقيد بها الخلايا على كوفيرسليبس كما هو مذكور أعلاه.
إزالة متوسط الثقافة <ol><li>وغسل الخلايا مرة واحدة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إصلاح الخلايا في مثبت بارافورمالدهيد/فوق يودات/يسين (حزب العمال التقدمي) 2% للحد الأدنى 10</li>
	<li>يغسل خلايا بإيجاز في برنامج تلفزيوني، وثم بيرميبيليزي في 0.2% 20 توين في برنامج تلفزيوني عن 20 دقيقة</li>
	<li>كتلة الخلايا مع سيرا دجاج 10% في 5% البقري ألبومين المصل (BSA) المخفف في برنامج تلفزيوني عن 30 دقيقة</li>
	<li>إينكوباتي مع مراقبة الابتدائي وايستب الأجسام المضادة ح 1 في درجة حرارة الغرفة بتركيزات 1: 100 (يتم سرد تفاصيل أكثر تحديداً في الجدول للمواد) على 37 درجة مئوية. 
	ملاحظة: للعينات BAL، علامة محددة من الضامة عادة غير مطلوب.</li>
	<li>بعد إضافة الأجسام المضادة الأولية، تغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني، وكذلك احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-</li>
	<li>يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني وجبل مع المتوسطة المستندة إلى DAPI المتصاعدة للتصور استخدام مجهر [كنفوكل] (كما ذكر أعلاه) في الليزر الجسيمات 405، 488، 561 و 647 نانومتر و 40 س، غ 1.0 النفط الهدف.</li>
</ol> 3. عينات أنسجة الرئة ملاحظة: في فيفو الدراسات أنسجة الرئة، دراسة العينات بعد التعرض ذات الصلة (مثلاً، كما هو مبين في س &#39; سوليفان et al. 7)-التعرض الأكثر ملاءمة لهذه التجربة هي الكائنات الدقيقة المعدية، خاصة البكتيريا. سلالات الماوس التي يمكن أن تستخدم لهذا الأسلوب من C57BL/6 أو بالب/ج الفئران، 10-12 أسابيع من العمر، والوزن ز 25-30، وذكر-
<ol><li>يوثانيزي الفئران، عن طريق حقنه داخل الكيتامين (400 مغ/كغ) وإكسيلازيني (40 مغ/كغ). فتح تجويف الصدر وفضح الرئتين والقلب باستخدام الملقط الجراحي والمقص.
	<ol><li>بث برنامج تلفزيوني الحار باستخدام إبرة عيار 21 في البطين الأيمن لتغسل الدم من هذه السفن لمدة 30 ثانية، ثم ضخ 10 مل من 2% حزب العمال التقدمي مثبت لمدة 30 s (في البطين الأيمن).</li>
		<li>استخدام برنامج تلفزيوني الحارة (42 درجة مئوية) للغسل تجويف الصدر مفتوحة. التنبيب القصبة الهوائية بإبرة عيار 21 وقطعة من أنابيب 0.8 ملم قطع بحجم، وحقن 800 ميليلتر من المعالجون مسبقاً (إلى 42 درجة مئوية)، ذوبان منخفضة نقطة 3% [اغروس] الحل.</li>
		<li>التعادل قبالة القصبة الهوائية مع الحرير مجدول (4.0 جامعة جنوب المحيط الهادئ). ضع مؤشر ترابط حول القصبة الهوائية، أسفل نقطة الإدراج من القنية، وضمان الحصول عليها عن طريق تراكم عقده بسيطة. أن يصلب [اغروس]، إدارة برنامج تلفزيوني المثلج حول الرئتين. إزالة الرئتين والقلب ككتلة من تجويف الصدر باستخدام مقص وتشريح كليلة. إزالة الرئة كل على حدة ومن ثم إصلاحها لهم ح 16 في 2% حزب العمال التقدمي أو الفورمالين في 4 ° C.</li>
		<li>تخزين العينات في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية حتى تقطيع الأنسجة. وكانت هذه الأساليب للحصول على أنسجة الرئة هو موضح سابقا 13-</li>
	</ol></li> <li>لتحضير أنسجة الرئة نماذج استخدام الخطوات التالية.
	<ol><li>فيكس الرئة الأنسجة (مستأصل في الخطوة 3، 1) الأنسجة في 10% فورمالين الطبيعية معزولة عن 24 ساعة عند درجة حرارة الغرفة. نقل إلى الإيثانول 75% ووضع في معالج أنسجة على دورة ح 12، (2.5 ح في 75% EtOH، ح 3 في EtOH المطلق، ح 3.5 في 3B المذيبات، وعن ح 3 في البارافين).</li>
		<li>Embed في البارافين القياسية لإنشاء ثابت من الفورمالين، وجزءاً لا يتجزأ من البارافين كتل (FFPE) التي يتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة- 
		ملاحظة: في هذه المرحلة، عموما مريحة لقطع المقاطع الرئة للشرائح القياسية.</li>
		<li>قطع المقاطع الرئة FFPE في 4-5 ميكرون سمك باستخدام مبضع وجبل على المتهمين، المغلفة الشرائح كما تم وصفه سابقا قبل س &#39; سوليفان et al. 7</li> <li>لتحميل الشرائح ووضع 3 قطرات متوسطة المتصاعدة على 60 مم × 24 مم كوفيرسليبس (الحجم 1.5)، وعكس الشريحة ساترة وطرد المتوسطة الزائدة. مغلقة بأحكام ختم مع طلاء الأظافر وتخزينها في درجة حرارة الغرفة-</li>
	</ol></li></ol> 4. إعداد/الفحص المجهري "عينات أنسجة الرئة" <ol><li>لإزالة الشمع وترطيب بريتريت عينة أنسجة الرئة FFPE مع مستضد استرجاع الحل.
	الشرائح فب <ol><li>الفرن الجاف لمدة 60 دقيقة عند 60 درجة مئوية. ثم وضع الشرائح في الحل زيلين نفط 30 دقيقة ونقل إلى الحل الإيثانول 70% لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الشطف بماء الصنبور.</li>
		<li>مكان في غلاف بلاستيكي مقاوم للحرارة، ورهنا باسترجاع مستضد هير في طنجرة الضغط لمدة 10 دقائق في 10 m/mol/L تريس، 1 ملمول/يدتا pH 9.0. باردة ل 20 دقيقة أغسل مرتين في مياه الحنفية لمدة 5 دقائق في الروك، ثم مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني في الروك.</li>
		<li>كتلة مع المصل الدجاج 10% في 5% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-</li>
	</ol></li> <li>وصمة عار في الأنسجة.
	<ol><li>لتحديد ميتس في الضامة، إضافة الأجسام المضادة الأولية (MMP-9 و H3Cit و F4/80) في 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني عن ح 16 عند 4 درجة مئوية في تمييع 1/100 (يتم سرد تفاصيل محددة عن كميات الضد في الجدول للمواد). أغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في الروك.</li>
		أضداد <li>تحقيق كشف فلوري بالحضانة مع الثانوية المقابلة في 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الأضداد:: (1) الدجاج المضادة الماوس 488 (الأخضر) والماعز (2) الدجاج لمكافحة 594 (أحمر) والماوس المضادة (3) حمار 647 (الأحمر الآن)-</li>
		<li>يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني وجبل مع تصاعد المحتوية على DAPI المتوسطة لتلطيخ الكروماتين.</li>
	</ol></li> <li>الحصول على الصور الفلورية باستخدام ليزر [كنفوكل] المسح رئيس تعلق مجهر مقلوب.
	<ol><li>تثير الإعداد مع 405، 488، 561، و 647 نانومتر الليزر. التقاط صور بكسل-512 × 512 طائرة واحدة بالنقر فوق خط تسلسلي، والاستواء زر (في المتوسط سطر 2) استخدام 20 X 0.1 الهواء NA و NA 40 × 1.0 النفط الأهداف.</li>
		<li>الحصول على مالا يقل عن عشرة حقول لعرض كل قسم للتحليل والبيانات لكل نتيجة (أي، 10 عالية الطاقة الحقول لعرض (هفوف) لعنصر التحكم، 10 لحفز عينة، إلخ، لكل الماوس)- 
		ملاحظة: للحصول على عينة تمثيلية من الميدان كله، نظام مصفوفة يمكن استخدامها في الحقل الذي يتم تقسيم إلى أقسام مختلفة و لكل عينة مختلفة تستخدم نفس مصفوفة لتحديد الحقول من طريقة العرض (مثلاً، يمكن تقسيم الحقل إلى 9 أقسام، وتتخذ من المركز وزوايا 4، هفوف اثنين)-</li>
	</ol></li></ol> 5. التصوير ميتس ثلاثية الأبعاد (3-D) ملاحظة: كما ميتس هياكل ثلاثية الأبعاد، بأخذ z-المكدس متعددة الصور، والتي يتم تشكيلها، قد تعطي معلومات قيمة-
<ol><li>المقطع العينات الرئة من كتل البارافين، في 200 ميكرومتر استخدام فيبرتوم في سعة تعيين 1.8 ملم والسرعة من 0.1-0.5 ملم/س.</li>
	<li>كتلة أنسجة الرئة مع 20 ٪ مصل كل منهما (10% مصل العجل الجنين والمصل الدجاج 10 ٪)، وثم بيرميبيليزي في تكملة برنامج تلفزيوني و 3.75% 100 تريتون العاشر ح 7 في درجة حرارة الغرفة تحت الانفعالات لطيف.</li>
	<li>وصمة عار المقاطع ح 16 عند 4 درجة مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ذات الصلة (MMP-9 و H3Cit و F4/80) في مجلدات ميليلتر 200 في أنابيب ميكروسينتريفوجي (جسم التركيزات المذكورة في الجدول للمواد)-</li>
	<li>أغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني، 3 مرات لمدة 10 دقيقة قبل تفرخ مع الأجسام المضادة الثانوية ذات الصلة في درجة حرارة الغرفة حاء – 1</li>
	<li>وصمة عار أقسام الرئة ل DAPI (1:5، 000) في الحل لمدة 20 دقيقة، قبل إضافة كشوف غطاء للمجهر الشرائح في برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>الحصول على الصور الفلورية استخدام مجهر [كنفوكل] مقلوب ال (40 × 1.3 غ) مجهزة 405 نانومتر، 440 نانومتر، 473 نانومتر، 543 نانومتر، و 635 نانومتر الليزر.</li>
	<li>سجل ثلاثية الأبعاد z-رزمة من 0.54 ميكرون سمك مع تقطيع ض الأمثل لهدف النفط غ 40 × 1.3. 
	ملاحظة: تتنوع البرمجيات المستخدمة تبعاً للمجهر الفردية. مثال عن كيف يمكن استخدام البرنامج مجهر واحد يرد في التكميلية الملف 1-</li>
</ol> 6. صورة التحليل ملاحظة: تحليل العينات يتطلب استخدام برمجيات تحليل التصوير محددة وأمثلة مذكورة في الجدول للمواد. في حين يعتمد على برنامج معين يستخدم تحليل النتائج، النقاط المدرجة أدناه هامة-
<ol><li>عينات "التحليل بال" <ol><li>تعريف عدد الضامة باختيار قناة الأزرق ل DAPI وتعيين حجم الحد أدنى للخلايا (مثلاً، &#62; 18 ميكرومتر في القطر). باستخدام البرمجيات ذات الصلة، وقياس مجموع الضامة كل حقل-</li>
		<li>حساب عدد الخلايا التي تحتوي على ميزات يلتقي بوجود خارج الخلية الكروماتين الكشف عنها بواسطة DAPI مع التعبير المشترك عن علامات أخرى (مثلاً، MMP12، PAD2 و H3Cit)- 
		ملاحظة: يعتمد عدد العلامات التي يمكن تحليلها على العدد من أجهزة الليزر المتوفرة، ولكن من الناحية المثالية بالإضافة إلى DAPI، اثنين على الأقل من علامات أخرى ينبغي إدراجها. أخرى أقل معلمات محددة للتعبير MET (مثلاً، عدد الخلايا التي تحتوي على الكروماتين خارج الخلية، ونواة موسع) يمكن استخدامها-</li>
		<li>لمقارنة التعبير MET في بال تحليل عينات (بين التحكم والدخان، والدخان/الدناز معاملة مجموعات)، الحد ني الضامة ال 100 كل عينة.</li>
		<li>لقياس الأجسام المضادة الثانوية وايستب التحكم في مستويات الأسفار؛ وقياس الحد ني خلايا 100 في كل عينة لهذه الأسفار. قياس مستوى متوسط من الأسفار الخلفية لكل علامة (مثلاً، H3Cit) باستخدام البرامج القياسية.</li>
		<li>إلى تعريف تعبير MET، عد الخلايا مع النمط الظاهري نموذجي (مثلاً، الكروماتين خارج الخلية مع التعبير المشترك H3Cit و MMP9) وكل MET، لقياس مستوى الأسفار علامات (مثلاً، H3Cit و MMP9). استبعاد الخلايا المنتجة ميتس إذا لم يكن على تلطيخ فوق عنصر التحكم في الخلفية وايستب.</li>
		<li>تحليل للعينات بال البشرية، كحد أدنى من 100 خلية لكل عينة للنسبة مئوية الضامة التي تجعل ميتس. للحصول على نماذج مورين، تحليل الخلايا أصغر وصعوبة تحديد ميتس، عدد أكبر من الخلايا لكل عينة (مثلاً، الضامة 200)-</li>
	</ol></li> <li>تحليل عينات أنسجة الرئة <ol><li>لتحديد وجود ميتس في أنسجة الرئة، استخدم علامة بلعم محددة مثل F4/80-</li>
		<li>تحديد وجود ميتس في أنسجة الرئة باستخدام التعريب المشارك F4/80 في الخلايا التي تعبر عن الكروماتين خارج الخلية مع معلمات أخرى كما هو موضح في القسم 6.1.</li>
		<li>تحديد مستويات الخلفية الفلورية في عينات مع الأجسام المضادة الثانوية وعناصر التحكم ايستب. استبعاد ميتس من التحليل أن لا تتجاوز الخلفية.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin?.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?.</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).</li><li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+balancing:+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases.">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers immunol. 4, 1 (2013).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression.">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).</li><li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).</li><li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).</li><li>Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PAD4+in+NET+formation.">Activation of PAD4 in NET formation.</a> Front Immunol. 3, 360 (2012).</li><li>Lewis, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PAD4+activity+is+sufficient+to+disrupt+mouse+and+human+NET+formation.">Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation.</a> Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).</li><li>Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+the+IL-6+Trans-Signaling/Mechanistic+Target+of+Rapamycin+Complex+1+Axis+in+Pulmonary+Emphysema.">Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema.</a> Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).</li><li>Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps.">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell host &amp; microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li><li>Wong, K. W., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+exploits+human+interferon+gamma+to+stimulate+macrophage+extracellular+trap+formation+and+necrosis.">Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis.</a> J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).</li></ol>

الكتاب قد لا الكشف جعل فيما يتصل بهذا العمل.

ويستند الأسلوب الموصوفة في هذا الاستعراض على أن تستخدم لتحديد وجود شبكات14. الضامة تعتبر إلى حد بعيد نوع الخلية المهيمنة في عينات بال وهذا الأسلوب من جمع خاصة مناسبة لدراسة ميتس. إذا كانت خلايا الدم الحمراء موجودة في ال، ينبغي تفكيك هذه الخلايا باستخدام كلوريد الأمونيوم. سيتم تنشيط الإجراء BAL عموما الضامة و ولذلك فمن المتوقع أنه سيكون هناك ميتس موجودة في العينات تنشيط الأمم المتحدة. الضامة BAL عادة ملتصقة جداً. عموما لا الضامة BAL ستحتاج إلى علامة معينة كما هذه الخلايا هي نوع الخلية المهيمنة ويمكن تمييزها بالتشكل بهم أيضا. عادة في البال، أكبر من 80% الخلايا الضامة (والعدلات هي أقل من 5%)، وبعد يغسل متعددة، عموما يبقى فقط الكريات البيضاء ملتصقة (أي، الضامة)6. إذا كان هناك شك حول القدرة على تمييز الضامة من العَدلات في البشر، يمكن استخدام علامة العَدلات مثل elastase العَدلات. في أنسجة الرئة، مطلوب علامة بلعم محددة (مثلاً، F4/80) كما الضامة ويصعب التمييز بين أنواع الخلايا الأخرى. الضامة قد السيارات-الأسفار حتى المهم باستخدام عناصر تحكم خلفية وايستب؛ وهذا هو الحال بصفة خاصة مع عينات حفز.
ما زال يتعين تحديد أفضل طريقة لتحديد وجود ميتس. مسارات محددة/العمليات، التي مشتركة بين كل من العَدلات والضامة: البروتياز (1) الحبيبية، (2) سيترولينيشن هيستونيس، ولوحة (3). PAD4 أكثر تحديداً العَدلات، بينما PAD2 أكثر بروزا في حيدات/الضامة. استخدام F4/80 علامة مقبولة تماما الضامة مورين، لكن الضامة البشرية لا تملك مثل هذه علامات محددة تحديداً جيدا وقد يشكل ذلك القضايا عند تقييم أنسجة الرئة البشرية للتعبير MET. تحليل التعبير MET في أنسجة الرئة قد يكون من الأصعب أن هناك العديد من أنواع الخلايا الأخرى وميتس تميل إلى أن تكون دفعت على الجدران السنخية. عند تحليل المقاطع الأنسجة، ميتس هي تصور أفضل عندما تكون شقة في المقطع العرضي؛ إذا ميتس في طائرة مختلفة قد يكون من الصعب تحديد ما إذا كان MET موجود. ويمكن معالجة هذه المسألة إلى حد ما بجعل z-مداخن لتمكين أعمق أنسجة طائرات (ثلاثي الأبعاد) لدراسة ميتس، والقدرة على تصور ميتس في جوانب مختلفة.
لا توجد طريقة مقبولة جيدا لتحديد وجود ميتس في عينات الرئة. الأساليب المذكورة تستند إلى تلك المستخدمة لتصور الشباك. تشو وآخرون ووصف أن mitogen سلطة النقد الفلسطينية التي يسببها ميتس في خط خلية بلعم، حسب تقييم وجود الكروماتين خارج الخلية15. أظهرت دراسة لاحقة أن بكتريا السل التي يسببها ميتس في المختبر، حسب تعريف وجود الكروماتين خارج الخلية و H3Cit16. أننا أظهرنا في فيفو في نموذج لالتهاب الكلية، أن ميتس موجودة في الكلي كما حددتها الكروماتين وهيستون myeloperoxidase مترجمة شارك7. وأخيراً، قد أثبتنا وجود ميتس في المختبر في بلعم الرئة البشرية بالمزيج من الكروماتين خارج الخلية و MMP126. يمكن استخدام أسلوب لدينا محققون آخرون لبحث هذا الجانب الهام من الاستجابة الالتهابية.
ومن المرجح أن يتم التعرف ميتس يكون لها دور رئيسي في مرض التهاب مزمن. العمليات التي تؤدي إلى نيتسيس لا تزال غير واضحة المعالم. دراسة ميتس قد تقدم أفكاراً هامة في آليات تشكيل فخ. وضع بروتوكولات مع علامات أكثر والدراسات الفنية من ميتس بمواصلة تحديد دور ميتس في المرض.
وهناك الخطوات الحاسمة التي حددناها في هذا البروتوكول. العينات بال البشرية عرضه للتلوث الجرثومي الثانوي واستخدام المضادات الحيوية في الثقافة المتوسطة مهم للحد من التلوث. يمكن أن تختلف الأجسام المضادة الابتدائي والثانوي في هذه الأسفار، حتى مع نفس الشركة المصنعة. وأخيراً، تحليل عينات أنسجة الرئة أكثر تعقيداً من عينات BAL ويتطلب وقتاً لوضع نهج موحدة.

ووصفت الفخاخ خارج الخلية العَدلات (شبكات)، أولاً برينكمان et al. 1 يتم إنتاجها في الغالب استجابة للعدوى (خاصة للبكتيريا) ولها دور هام في الدفاع المضيف1،2. قد وصفت أيضا تحدث استجابة للأمراض غير المعدية، بما في ذلك التهاب الأوعية الدموية والذئبه الحمامية الجهازية (SLE)؛ وإلى mitogen phorbol 12-ميريساتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية)2،3. وقد اعترف مؤخرا أن أنواع الخلايا الأخرى قد تنتج أيضا الفخاخ خارج الخلية، بما في ذلك الضامة. بلعم الفخاخ خارج الخلية (ميتس) ليست بعد كيان محدد جيدا في الأدب4،5. وقد أنشأنا مؤخرا أساليب الكشف عن وجود ميتس في المختبر و في فيفو6،7. في هذه المقالة، سيتم وصف قياس ميتس استخدام الفحص المجهري [كنفوكل].
السمات الرئيسية نيتوسيس التي تميزها عن سائر المسارات الخلوية (مثل المبرمج8) هي النتوء الكروماتين بالاقتران مع: (1) سيترولينيشن هيستونيس (H3Cit)9، (2) التعبير المشارك من البروتياز الحبيبية10 ، ومشاركة بيبتيديل ارجينين ديميناسي (PAD) 4 (3)11،12. الضامة أيضا أن أعرب عن H3Cit، البروتياز الحبيبية، ومنصة، ويمكن استخدام هذه الميزات لتحديد وجود ميتس.
قد يكون ميتس دوراً بالغ أهمية في الرئة، كما بلعم هو المهيمن الخلية الحالية في الحويصلات الهوائية والخطوط الجوية في الرئة والدور الأولى في توجيه الاستجابة المناعية الخلوية للعدوى/التهاب. وباﻹضافة إلى ذلك، بينما الكثير من الرئة مساحة فارغة (مثلاً، داخل الحويصلات الهوائية)، ميتس، يحتمل أن تكون قادرة على التوسع في المساحة المتوفرة، على النقيض من الأجهزة الصلبة.
الأسلوب الأكثر استخداماً لتحديد وجود شبكات بالفحص المجهري [كنفوكل]. لا توجد حتى الآن طريقة محددة بوضوح لقياس ميتس. هذه التقنية لقياس شبكات تم تكييف لقياس وجود ميتس في هذا البروتوكول. المتطلبات الرئيسية لهذا الأسلوب هي الوصول إلى الفحص المجهري [كنفوكل] وبرامج التصوير المناسبة للتحليل.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human samples: Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB5103</td>
			<td>10 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human MMP12</td>
			<td>Novus Biological</td>
			<td>NB110-57214</td>
			<td>1:100 concentration not quantifiable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human MMP9</td>
			<td>Novus Biological</td>
			<td>AB119906</td>
			<td>1:200 ascites, no concentration given</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human PADI2/PAD2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB16478</td>
			<td>7 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human PADI4/PAD4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB128086</td>
			<td>10.1 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NE</td>
			<td>LifeSpan Bioscience</td>
			<td>LS-B4244</td>
			<td>25 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse samples: Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse MMP9</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AF909</td>
			<td>10 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB5103</td>
			<td>10 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse F4/80</td>
			<td>In-house (hybridoma)</td>
			<td>In house</td>
			<td>20 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human Anti-HNE /NE</td>
			<td>Sapphire Bioscience</td>
			<td>LS-B4244</td>
			<td>25 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human &#173;&#173;&#173;&#173;PADI4/PAD4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB128086</td>
			<td>10.1 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super-frost plus slides</td>
			<td>Menzel</td>
			<td>S41104A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi-prolong gold</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-rabbit AF 488/</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-rabbit AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-goat AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>a-21468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-mouse AF488</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-mouse AF 647</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>550878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Programs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1 Confocal scanning microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV1200 Confocal scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue sources</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>r8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan black</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K2753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>42904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>327204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent 3B</td>
			<td>Hi-Chem</td>
			<td>2026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 12 ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 x 24 ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c57 black 6</td>
			<td>Monash animal research platform (MARP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c</td>
			<td>MARP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy

وسيلة الرئيسية المستخدمة لتحديد وجود العَدلات الفخاخ خارج الخلية (شبكات) [كنفوكل] مجهرية. وقد قمنا بتعديل أساليب الفحص المجهري [كنفوكل] ثابتة لتصور بلعم الفخاخ خارج الخلية (ميتس). يتم تعريف هذه الفخاخ خارج الخلية بوجود الكروماتين خارج الخلية مع التعبير المشترك لمكونات أخرى مثل البروتياز الحبيبية وهيستونيس سيتروليناتيد بيبتيديل أرجيناسي ديميناسي (PAD). التعبير عن ميتس عموما يقاس بعد التعرض لحافز ومقارنة عينات تنشيط الأمم المتحدة. عينات مدرجة أيضا للتحكم بالخلفية وايستب. ويتم تحليل الخلايا باستخدام برمجيات التحليل صورة واضحة المعالم. يمكن استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] لتحديد وجود ميتس على حد سواء في المختبر و في فيفو في أنسجة الرئة.

وقد تصور ميتس من عينات BAL، في أنسجة الرئة وفي أقسام الرئة أكثر سمكا مع صور ثلاثية الأبعاد. ويرد مثال ميتس تصور في عينة بال في الشكل 1. مورفولوجية ميتس ستختلف وفقا لمرحلة النضج. أول ميزة يمكن كشفها في الفحص المجهري هو حركة نواة إلى الحافة من الخلية. ويعقب هذا الكروماتين خارج الخلية مع الوسطاء أعرب المشترك الأخرى، مثل البروتياز H3Cit والحبيبة. الخلية في المراحل السابقة، لا يزال لديه شكل كروي تقريبا مع فخ خارج الخلية وأعرب عن. في مراحل لاحقة، وتشكيل MET تتميز باستطالة جسم الخلية.
أنسجة الرئة ميتس مبينة في الشكل 2. كما يتم نفخ الرئتين بالسوائل لتعريف بنية الرئة، سيتم دفع ميتس عموما ضد الجدران السنخية. كما ستختلف مورفولوجية ميتس استناداً إلى أي قطع الطائرة الأنسجة في. المقاطع القياسية المستخدمة لعينات أنسجة الرئة هي 4-5 ميكرومتر في السمك. تمكين أكثر ثخانة الأنسجة أقسام صور متعددة اتخاذها وميتس يمكن ثم عرض ثلاثي الأبعاد. فقط سوف تخترق الأجسام المضادة حتى الآن في أنسجة الرئة وسمك المادة 25-50 ميكرون الأمثل. مثال لصورة ثلاثية الأبعاد ويرد في الشكل 3 ، وفي الفيديو 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig1.jpg"> 
رقم 1: ميتس BAL- ميتس بال البشرية تشكلت بعد التحفيز في مراحل مختلفة من التنمية. تميزت ميتس الكروماتين خارج الخلية مع التعبير المشترك H3Cit و MMP9. تلوين الكروماتين (أ) H3Cit (ب)، MMP9 (ج) و (د) الصورة المدمجة. يتم إدراج لوحة ايستب عناصر التحكم. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون (15 ميكرون ايستب). مرحلة سابقة MET يظهر في الركن الأيمن العلوي، وقد شكل كروي تقريبا. ويرد MET أكثر نضجاً في وسط الميدان. أخذت الصور باستخدام ليزر المسح مجهر [كنفوكل] وهدف نفط غ 40 × 1.0. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56459/56459fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig2.jpg"> 
رقم 2: أنسجة الرئة ميتس. مورين ميتس في أنسجة الرئة بعد التحفيز. لقد اتسمت ميتس الكروماتين خارج الخلية مع التعبير المشترك H3Cit و MMP9 F4/80 (كعلامة بلعم). تظهر لوحة (أ) عرض من حقل نموذجي عالية الطاقة المستخدمة لقياس عدد ميتس؛ تظهر لوحات (ب–و) منطقة مربع منقط تحت تكبير أعلى. تلوين الكروماتين (ب) H3Cit (ج)، MMP9 (د)، (ه) F4/80 و (F) الصورة المدمجة. يتم إدراج لوحة التحكم ايستب. تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر (20 ميكرومتر ايستب). عموما يتم الضغط ميتس ضد الجدران السنخية. أخذت الصور باستخدام ليزر المسح مجهر [كنفوكل] وهدف نفط غ 40 × 1.3. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56459/56459fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56459/56459fig3.jpg"> 
رقم 3: عرض ثلاثي الأبعاد من قسم الرئة. أنسجة الرئة الماوس ثابتة ويقتطع 25-35 ميكرون سميكة المقاطع. كان يحمل علامات ميتس الأنسجة وتصويرها مع الأقسام في 1 ميكرون سمك. الصور كانت جنبا إلى جنب مع z كدسة لخلق صورة ثلاثية الأبعاد 3-تابعين. أخذت الصور باستخدام ليزر المسح مجهر [كنفوكل] وهدف نفط غ 40 × 1.3. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56459/56459fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/56459/56459video1.jpg"> 
الفيديو 1: عرض ثلاثي الأبعاد من قسم الرئة. فيديو يناظر العينات المعروضة في الشكل 3. محور القراد = 5 ميكرومتر. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56459/Mets_1.avi" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

بلعم الفخاخ خارج الخلية كيان وصف حديثا. هذه المادة سوف تركز على أساليب الفحص المجهري [كنفوكل] وكيف أنها تصور في المختبر و في فيفو من عينات الرئة.

تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر [كنفوكل]

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

visualizing-macrophage-extracellular-traps-using-confocal-microscopy

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Views.  Monash Medical Centre. بلعم الفخاخ خارج الخلية كيان وصف حديثا. هذه المادة سوف تركز على أساليب الفحص المجهري [كنفوكل] وكيف أنها تصور في المختبر و في فيفو من عينات الرئة.

Video: Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

الفخاخ خارج الخلية العدلات : كيفية إنشاء وتصور لهم

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

تصور الخلية إلى خلية نقل فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام النسخ نيون فيروس نقص المناعة البشرية ومتحد البؤر المجهري لايف

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Intravital الميكروسكوب في الطحال : التحليل الكمي للتنقل الطفيلي وتدفق الدم

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

تصور الإيماس غير التحللي من<em&gt; الأدعومية المستخفية</em&gt; من الضامة الرقمية الخفيفة عن طريق الميكروسكوب

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role in fighting infections, recent research has demonstrated that they may be involved in many other disease processes, including cancer progression. Isolating purified NETs is a crucial element to allow the study of these functions.
In this video, we demonstrate a simplified method of cell free NET isolation from human whole blood using readily available reagents. Isolated NETs can then be used for immunofluorescence staining, blotting or various functional assays. This enables an assessment of their biologic properties in the absence of the potential confounding effects of neutrophils themselves.
A density gradient separation technique is employed to isolate neutrophils from healthy donor whole blood. Isolated neutrophils are then stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce NETosis. Activated neutrophils are then discarded, and a cell-free NET stock is obtained.
We then demonstrate how isolated NETs can be used in an adhesion assay with A549 human lung cancer cells. The NET stock is used to coat the wells of a 96 well cell culture plate O/N, and after ensuring an adequate NET monolayer formation on the bottom of the wells, CFSE labeled A549 cells are added. Adherent cells are quantified using a Nikon TE300 fluorescent microscope. In some wells, 1000U DNAse1 is added 10 min before counting to degrade NETs

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

In the following protocol, we describe a very simple way to isolate Neutrophil Extracellular traps (NETs) from human whole blood using readily available reagents. We then demonstrate how the isolated NETs can be used in an in vitro adhesion assay with cancer cells.

المبسطة الإنسان الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) عزل والمناولة

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

تصور داخل الخلايا المطوقة الاتجار بواسطة عمر Fluorescence التصوير المجهري

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

التلقائي القائم علي الصورة الكمية من الفخاخ العدلات خارج الخلية باستخدام NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, periodontitis, mucosal infections and, most notably, early childhood caries. In all of these conditions, the pH in the biofilm matrix impacts microbe-host interactions and thus the disease progression. The present protocol describes a confocal microscopy-based method to monitor pH dynamics inside cross-kingdom biofilms comprising Candida albicans and Streptococcus mutans. The pH-dependent dual-emission spectrum and the staining properties of the ratiometric probe C-SNARF-4 are exploited to determine drops in pH in extracellular areas of the biofilms. Use of pH ratiometry with the probe requires a meticulous choice of imaging parameters, a thorough calibration of the dye, and careful, threshold-based post-processing of the image data. When used correctly, the technique allows for the rapid assessment of extracellular pH in different areas of a biofilm and thus the monitoring of both horizontal and vertical pH gradients over time. While the use of confocal microscopy limits Z-profiling to thin biofilms of 75 &#181;m or less, the use of pH ratiometry is ideally suited for the noninvasive study of an important virulence factor in cross-kingdom biofilms.

The protocol describes the cultivation of cross-kingdom biofilms consisting of Candida albicans and Streptococcus mutans and presents a confocal microscopy-based method for the monitoring of extracellular pH inside these biofilms.

رصد درجة الحموضة خارج الخلية في الأغشية الحيوية عبر المملكة باستخدام المجهر كونكوالبؤر

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by neutrophils in response to systemic inflammation or pathogens. Although NETs have previously been shown to augment clot formation and inhibit fibrinolysis in humans and dogs, the role of NETs in cats with cardiogenic arterial thromboembolism (CATE), a life-threatening complication secondary to hypertrophic cardiomyopathy, is unknown. A standardized method to identify and quantify NETs in cardiogenic arterial thrombi in cats will advance our understanding of their pathological role in CATE. Here, we describe a technique to identify NETs in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded thrombi within the aortic bifurcation, extracted during necropsy. Following deparaffinization with xylene, aortic sections underwent indirect heat-induced antigen retrieval. Sections were then blocked, permeabilized, and ex vivo NETs were identified by colocalization of cell-free DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), and neutrophil elastase (NE) using immunofluorescence microscopy. To optimize the immunodetection of NETs in thrombi, autofluorescence of tissue elements was limited by using an autofluorescence quenching process prior to microscopy. This technique could be a useful tool to study NETs and thrombosis in other species and offers new insights into the pathophysiology of this complex condition.

We describe a method to identify neutrophil extracellular traps (NETs) in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded feline cardiogenic arterial thrombi using heat-induced antigen retrieval and a double immunolabeling protocol.