この研究の彼らのサポートのベッチャー財団と筋萎縮性側索硬化症協会 (#17-II-344) に感謝しております。

マウスを含むすべてのプロシージャは、コロラド大学アンシュッツ医療キャンパス機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された (91813(05)1D)。
 1 です一日 1: プライマリ (1 °) ウシ血清アルブミン (BSA) ブロック染色 <ol><li>マウスの後肢筋 (例えば、前脛骨筋、ヒラメ筋) の空気乾燥凍結切片の荷電のスライドに取付けた ~ 30 分。 11. 疎水性障壁 PAP のペンを使用してセクションに境界線を描画します</li>。
	<li>場所 ~ 5 %bsa/リン酸緩衝生理食塩水 (BSA/PBS) 非特異抗体の結合をブロックする各スライド上を 250 μ l 添加します。スライド 1 のため室温で孵化させなさい</li>
	<li>ブロック中準備 1:50 5% 培養上清 1 ° 抗体の希釈 BSA/PBS (すべてはマウス モノクローナル抗体; 表 1 6 , 12 を参照してください); の 250 μ L を準備スライドごとのソリューションです。氷に 1 ° 抗体株式および希薄を維持</li>
</ol> <img alt="Table 1"src="/files/ftp_upload/56024/56024table1.jpg"/> テーブル 1: 一次抗体 MyHCs を区別するために使用します。
<ol start="4"> <li>5 %bsa/PBS ブロッキング液の吸引は、次の適切なスライドに 1 ° 抗体希釈の 250 μ L を追加。追加 250 μ L の 5 %bsa/PBS (2 °) 二次抗体だけネガティブ コントロールをスライドです</li>。
	4 ° C、湿度の高い環境で 24-48 h で <li>加温します 。
	注: 湿らせたろ紙をアルミ箔で覆われてペトリ皿は適切なインキュベーション室として役立つかもしれないです</li>。
</ol> 2。日 2:2 ° 蛍光抗体染色 <ol><li>1 ° 抗体溶液を吸引または 5 %bsa/PBS 溶液を制御します。洗ってすべてスライド 3 回、10 分の 5 %bsa</li>。
	<li>洗濯中準備 5% の精製、fluorophore 共役 2 ° 抗体の希薄を 1: 200 BSA/PBS (表 2 を参照してくださいすべてがヤギ抗マウス)。スライドごとに解決策の 250 μ L を準備します。氷で暗闇の中 2 ° 蛍光標識抗体を保持</li>
</ol> <img alt="Table 2"src="/files/ftp_upload/56024/56024table2.jpg"/> テーブル 2: 蛍光標識二次抗体を視覚化する一次抗体認識の MyHCs するために使用します。
<ol start="3"> <li>5 %bsa/PBS ブロック ソリューションの 3 番目のアプリケーションの吸引は、次のすべてのスライドに 2 ° 抗体希釈の 250 μ L を追加。暗く、湿気の多い環境で室温で 90 分間インキュベートします</li>。
	<li>吸引 2 ° 抗体溶液。洗ってすべてスライド 3 回 10 分 5% の BSA/PBS</li>。
	PBS の <li>リンス。10 分間乾燥</li>
	<li>マウント非常任理事、低粘度の水性取付中 coverglass</li>。
	<li>、乾燥時は、マニキュアとスライド エッジをシールします。乾燥し、暗い slidebox に格納します</li>。
</ol> 3。落射蛍光顕微鏡でスライドをイメージング <ol><li>きれいに拭きます小、70% エタノールに浸したラボ - スライドです</li>。
	<li>写真装置 (材料の表 を参照) を搭載した落射蛍光顕微鏡を使って immunostained 筋セクションのデジタル画像を取得します。
	<ol><li>約 1 mm 2 (10 × 対物、1.4 NA) の領域を選択します</li>。
		<li>ビューを介して、505 アレクサ 488 共役 2 ° 抗体蛍光 nm ロングパス ・ フィルター。595 nm ロングパス ・ フィルターを介して Alexa 594 共役 2 ° 抗体の励起による蛍光を表示します。互換性のあるイメージング ソフトウェアを搭載した PC のコンピューターで画像をデジタル化します。イメージング ソフトウェアを後で分析からスケール バーが含まれます</li>。
	</ol></li></ol> 4。フィジー画像の解析 注: 解析に進む、前にフィジー (健康の国民の協会、ベセスダ、MD から自由に利用可能) は、https://imagej.net/Fiji/Downloads 経由でインストールする必要があります。また、このプロセスで使用するマクロは、補足のファイル で提供されます。マクロ ファイルを簡単にアクセスできるディレクトリに配置します。
フィジーで選択したセクションの <ol><li>ロード、明視野イメージ。プラグインに移動 &#8594; 分割 &#8594; Trainable ウェカ ・ セグメンテーション</li>。
	、光ファイバーの線を描画し、セクションの細胞領域を規定するために <li>&#34; クラス 1 に追加 &#34;。繊維間空間に線を描画し、その後、&#34; クラス 2 に追加 &#34; 細胞外ドメインをマークします。各クラスで 5-10 ラベルがあるまでを繰り返します。
	<ol><li>クリック鉄道分類子。結果の赤と緑のオーバーレイで手動で複数のラベルを追加 (手順 4.2 参照)、必要な場合は、イメージの正しく分割部分に。繊維 (赤) は、繊維 (グリーン) 間のスペースから適切に分離されてまで繰り返します</li>。
	</ol></li> <li>クリックして &#34; 取得確率 &#34; と新しくラベル付けされたフォルダーに画像を保存します</li>。
	<li>は、同じフィールドから撮影した蛍光画像と (手順 4.2 4.3) の上記の手順を繰り返します。ラベルの immunostained 繊維として &#34; クラス 1 &#34; とすべての非蛍光性領域として &#34; クラス 2 &#34;。結果の確率マップを加工し、明視野イメージが格納されている同じフォルダーに保存します</li>。
	<li>はフィジーで以前に保存した確率マップの 1 つを開きます。イメージング ソフトウェアによって提供されるスケール バーの直線を描画します。分析に行く &#8594; スケールを設定します。スケール バーで指定された適切な値 (すなわち、既知の距離、長さの単位) パラメーターを変更し、チェック、&#34; グローバル &#34; 各イメージの尺度を標準化します</li>。
	<li>のプラグインに移動 &#8594; マクロ &#8594; を実行 &#8594; Tyagi ら 繊維定量 macro.ijm (補足ファイル を参照してください)。すぐに、ナビゲーション ウィンドウが表示されます。画像を開く &#39; s ホスト フォルダー;ダイアログ ボックスが表示されます。各ダイアログ ボックスの変更、&#34; 背景 &#34; ドロップ ダウン値 &#34; 光 &#34; 注: フォルダーが繊維アウトラインの画像と (CSA ・ フェレー径に最も関連する結果のスプレッドシート ソフトウェア ファイルが表示されます繊維形態の定量化測定されたパラメーターで調整できます設定測定の分析)。フィジーの細孔解析関数によって生成された繊維形態データをスプレッドシート ソフトウェア両方の蛍光および明るいフィールド画像のファイルに自動的に転送されます</li>。
	<li>蛍光繊維分野で対応する明視野イメージで総繊維数の数を割ることによってフィールドで指定された MyHC を表現する繊維の割合を計算します</li>。
</ol>

<ol>
	<li>Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essentiality+of+histo-+and+cytochemical+studies+of+skeletal+muscle+in+the+investigation+of+neuromuscular+disease.">The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease.</a> Neurol. 12, 778-784 (1962).</li><li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+is+a+primary+target+of+SOD1G93A-mediated+toxicity.">Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.</a> Cell Metab. 8, 425-436 (2008).</li><li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricting+calcium+currents+is+required+for+correct+fiber+type+specification+in+skeletal+muscle.">Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle.</a> Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).</li><li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+the+histochemical+demonstration+of+actomyosin+ATPase.">Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase.</a> Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).</li><li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat,+mouse,+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis.">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li><li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains.">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++permeation+and/or+binding+to+Cav1.1+fine-tunes+skeletal+muscle+Ca2++signaling+to+sustain+muscle+function.">Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function.</a> Skelet Muscle. 5 (4), (2015).</li><li>Sawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-step+immunostaining+method+to+visualize+rodent+muscle+fiber+type+within+a+single+specimen.">A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen.</a> PLoS One. 11 (11), (2016).</li><li>Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+image+analysis+tool+for+the+classification+of+muscle+fibre+type+using+immunohistochemical+staining.">Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining.</a> Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).</li><li>Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+immunohistochemical+classification+of+skeletal+muscle+fibres+in+mouse.">A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse.</a> Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), (2015).</li><li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres.">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).</li><li>Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+fiber+types+in+C57Bl6j+mice.">Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice.</a> Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).</li><li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles.">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li><li>Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+and+skeletal+muscle+adaptations+to+voluntary+wheel+running+in+the+mouse.">Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).</li></ol>

著者は開示する利害の対立があります。

ここでは、骨格筋線維の種類を識別するための有用な方向を提供しております。そうすることで、データの解析のための新たなアルゴリズムについて述べる.
我々 の結果は主前レポート5,8,10のものを確認して、私たち自身の手動測定を反映、アルゴリズムが正確に表示されます。まだ、アーティファクトを断面から生じる不透明繊維境界線を含むいくつかのまれな実験的落とし穴が発生しました。注意区分および分析の前に処理されたセクションの警戒の検討を通じてこれらの人工物の影響を最小化できます。特に、シャープなコントラストを達成するために同じ画像を再分類の複数回のラウンドをより少なくより最適な画像分割を回避する可能性があります。
我々 のプロトコルの最も重要なステップは 4.2 に定めるセクションの細胞および細胞外領域で特定の光ファイバー線を描画することによって「クラス 1」または「クラス 2」の領域をそれにより区別するステップです。明らかに、この手動の区別は重要な筋線維の境界を決定するのでこの手順ではエラーが悪影響をファイバーの寸法の評価。
本研究では、与えられたシリアル セクションに 1 つだけの MyHC のためのセクションがプローブされます。ところが、ハイブリッド繊維など、いくつかの線維は、MyHC、代謝・機能プロファイル (例えばIIX を入力し、入力 IIB) の重複を示すものの 2 種類を表現します。したがって、光ファイバー型値に合計の端数 &#62; ヒラメ筋と脛骨 (図 4A) の両方のための 1。ハイブリッド繊維をダブル、またはもトリプル、李らによって説明されたものなどのプロトコルのラベルで識別できます。7Bloemberg と Quadrilatero5、それぞれ。重要なは、分析の手法は、これらのより複雑なプロトコルを汚すに適用できます。プロトコルの別の制限が完全に自動; です。しかし、このマイナーな譲歩により提案手法が速度のために厳しさを損なわないようになると考えています。
本研究では, ヒラメ筋や前脛骨筋前脛骨筋の MyHC 組成が以前研究5,6,7,10,14の結果を反映しながら、CSA の評価に関する先行研究といくつかのコントラストがあります。たとえば、平均 CSA の測定値は Bloemberg と Quadrilatero5 ・ アレンらによって報告されたものよりもやや小さい。15特に、我々 の CSA の測定 〜 539.86 ± 24.44 μ m2 1319.50 ± 57.47 μ m2繊維のタイプの間で彼らはスパン約 735.7 ± 31.2 μ m2 3073.8 ± 51.3 μ m2にしながら。しかし、私たちの価値観よりとよく似てアウグストらによって観測されました。13ルーカスら6平均 Csa 436 ± 605 μ m2 2404 ± 412.5 μ m2と 815 ± 221 μ m2 ~ 1904年 ± 570 μ m2に至るまでそれぞれを報告しました。したがって、マウスの後肢の繊維の形態計測学的解析のいくつかの変動は、文献の間で存在します。
免疫組織化学では、ラベルし、筋線維の MyHC コンテンツに基づいて分類する効率的な方法を示します。免疫組織化学的実験の正確な定量化データについて有意義な結論を作るには欠かせませんこのため、分析の退屈な部分を自動化するためメソッドは、数百、または数千も、繊維の測定し、分類する必要があるときに特にに役に立つものです。測定手動観測のように加え、我々 のアルゴリズムはバイアスなしこれらのデータの正確な評価を提供します。手動測定この優位は、科学的な厳密さを保証します。この点で、我々 の方法論は筋の整合性に影響を与える遺伝学的および実験的操作の効果の評価に有用かもしれない。具体的には、迅速分析の手法と相まって MyHC 免疫組織化学は筋ジストロフィーなどの疾患モデルにおける筋形態および代謝の変化を評価するために用いることができる ALS は、がん悪液質。また、萎縮を防ぐためや肥大を引き起こす介入の効果も評価可能性があります。

それは、骨格筋は多くのタイプ1の単繊維から成るいくつかの時間のために知られています。当初は、繊維の 2 つのグループがその収縮特性に基づく特徴付けられると名前は、適切に、遅筋 (タイプ I) と速筋 (タイプ II)。これらのカテゴリは、繊維の代謝に基づくさらに区別されていました。以来タイプ I 繊維はミトコンドリアで豊富であり、酸化的代謝に依存して、彼らを力強く肯定的なニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドテトラゾリウム還元酵素 (NADH-TR) のジアホラーゼ2またはコハク酸脱水素酵素 (SDH) の3で解明しました。染色。対照的に、タイプ II 線維展示低い NADH TR ジアホラーゼの SDH 可変度染色と速筋の 2 つのサブグループに分けられた (タイプ IIA、IIB 型) の相対的な酸化能力に基づいてややぞんざい。繊維のこれらの違いは、ミオシン ATPase 染色によるより効果的に可視化されている型、pH 4.0 で前培養後繊維染色暗いとタイプ IIB 線維はタイプ IIA 線維で pH 10.0 に沈殿物次中古インキュベーションを吸収します。4を染色中間。
最近では、ミオシン重鎖 (MyHC) 成分の免疫組織化学的染色繊維タイプ5の細かい識別子として浮上しています。タイプ I、IIA 型し、タイプ IIB 線維がすべて識別する精度の MyHC プロファイルに基づきます。さらに、別の速筋代謝中間体繊維の種類は識別された6されている IIX を入力します。1 つ以上の MyHC を表現するハイブリッド繊維また確認された5,7,8をされています。猫やヒヒなどいくつかの種は、エクスプレス タイプ IIB MyHCs6にない知られています。MyHC 免疫染色は筋組成の最新の評価では現在、この手法で得られたデータの解析は面倒で時間のかかる自動支援なし。このため、半自動化された方法でこれらのデータを分析する一握りは先進5,9,10をされています。ここでは、半自動化された小説と一緒に筋線維タイプ5,7,8,10,の免疫組織化学的同定のため比較的標準的なプロトコルを提案します。アルゴリズムの精度で光ファイバー型および繊維の形態の分析を加速します。

<table width="974">
	<colgroup>
		<col style="width:226pt" width="301" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:172pt" width="229" />
		<col style="width:193pt" width="257" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Bovine Serum Albumin</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A9418-100G</td>
			<td class="xl66" style="width:193pt" width="257">5% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="41" style="height:30.75pt">
			<td class="xl65" height="41" style="width:226pt;height:30.75pt" width="301">Hydrophobic Barrier Pap Pen</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Scientific Device Laboratory</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">9804-02</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Microscope Slides</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Globe Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">1358W</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Coverglass</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">12-544-E</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Immumount</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl68" style="width:172pt" width="229">9990402</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Nail Polish</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">L&#39;Oreal</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="41" style="height:30.75pt">
			<td class="xl65" height="41" style="width:226pt;height:30.75pt" width="301">Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">Discontinued</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">SPOT RT/KE</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">SPOT Imaging Solutions</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">RT940</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Dell Optiplex</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">BA-F8 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgG2b; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">SC-71 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monclonal mouse IgG1; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">BF-F3 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgGM; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">6H1 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgGM; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 594 anti-IgG2b</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21145</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse; 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 488 anti-IgG1</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21121</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse;1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 594 anti-IgGM</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21044</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse;1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">OCT</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Sakura Finetek</td>
			<td class="xl68" style="width:172pt" width="229">4583</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">isopentane</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">O3551-4</td>
			<td class="xl66">cool with liguid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">PBS</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Bioreagents</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">BP665-1</td>
			<td class="xl66">10X, dilute to 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Kim wipes</td>
			<td class="xl66">Kimberly-Clark</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">06-666A</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated analysis of mouse skeletal muscle morphology and fiber-type composition

長年、骨格筋線維のタイプ間の区別されたミオシン ATPase 染色による視覚化に最適。最近では、ミオシン重鎖 (MyHC) 成分の免疫組織化学的染色繊維型の細かい識別子として浮上しています。タイプ I、IIA、IIX を入力を入力し、タイプ IIB 線維は、MyHC プロファイルに基づく精度で今識別できます。ただし、これらのデータの手動解析が遅いと右下をすることができます退屈。この点では、繊維の種類組成と形態の迅速で正確な評価は非常に望ましいツールです。ここでは、最新の免疫組織化学染色繊維の種類や繊維の形態の分析を加速する新たな半自動アルゴリズムとのコンサートでマウスの後肢筋から得られた凍結切片における MyHCs のためのプロトコルを提案する.ヒラメ筋が表示されます染色タイプ I およびタイプ IIA 線維、予想通り、ではなく、IIX またはタイプ IIB 線維。その一方で、前脛骨筋 IIX とタイプ IIB 線維、タイプ IIA 線維のごく一部の主にで構成されていた、またはほとんどないタイプ I 線維。いくつかのイメージの変換は、繊維形態を (すなわち、断面積 (CSA)、極大値と極小のフェレー径) のさまざまな側面を測定する目的について確率マップを生成する使用されました。これらのパラメーターが手動で得られた値と比較し、得られた値。CSA、最大または最小のフェレー径に関して解析のいずれかのモード間に有意差は認められなかった (すべてp &#62; 0.05)、提案手法の精度を示します。したがって、私たちの免疫染色解析プロトコルは高齢化とミオパチーの多くのモデルで筋肉の組成に及ぼす影響の調査に適用できます。

後肢筋 (すなわち、前脛骨筋、ヒラメ筋) 年齢不詳の男性 c57bl/6 マウスから解剖されたフラッシュ 10 月に筋肉を含むプラスチック金型の沈没によって固定されている液体窒素冷却イソペンタン化合物。8-10 μ m の切片が、cryotome を使用して、-20 ° C でカットし、異なる荷電ガラス スライド12に転送します。
これらの筋肉が高速と低速筋線維、それぞれ13,14主にで構成されるので、我々 は前脛骨筋とヒラメ筋を選んだ。次の免疫組織化学的染色個々 のタイプ I、IIA、IIX および IIB MyHCs、明視野と蛍光イメージは捕獲されました。図 1の左のパネル表示型とヒラメ筋の immunostained のセクション I、IIA、IIX と IIB MyHC 固有の抗体は、表 1に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56024/56024fig1.jpg"> 
図 1: MyHC の免疫組織化学的染色タイプ I、IIA、IIX、マウスの筋に IIB 。左パネルの表示 (BA F8; I 型一次抗体をプローブ マウス ラットヒラメ筋のセクションから得られた蛍光画像A)、タイプ IIA (SC-71;B) 入力 IIX (6 H 1;C) IIB (BF F3; を入力D) MyHCs。右側のパネルでは、対応する左側のパネルに描かれている実験で使用される一次抗体が省略されたセクションを表示します。バー = 100 μ m.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/56024fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
具体的には、見ました繊維の種類を表現することの実質的な分数 (図 1A、左)、タイプ IIA MyHCs (図 1B、左) 型の陽性を表示する残りの繊維の公正な量IIX の MyHCs (図 1C、左)。対照的に、事実上 IIB 線維はありませんでした明らか (図 1D、左)。これらの観察はヒラメ筋は以前の報告書と一致している型から大抵成り、IIA を入力し、IIX 繊維のほとんどないタイプ IIB 線維5,10,12型 (ほど)。重要なは、染色が認められなかった、一次抗体のプロトコル、抗体 (図 1A ~ D、右パネル) の特異性を示すから省略されていたセクションで。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56024/56024fig2.jpg"> 
図 2: MyHC の免疫組織化学的染色タイプ IIB、IIX、iia 期と私マウス前脛骨筋で。左パネルを表示、マウスの前脛骨筋の IIB (A) を入力、IIX (B) を入力、タイプ IIA (C) および (D) MyHCs 型に一次抗体をプローブのセクションから得られた蛍光画像。右側のパネルは、隣接する左側のパネルに描かれている実験で使用される一次抗体が省略されたセクションを表示します。バー = 100 μ m.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/56024fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
我々 はまた前述の抗体と前脛骨筋前脛骨筋を染色しました。前脛骨筋前脛骨筋はタイプ IIA MyHCs (図 2C、左) を表現する繊維からより小さい貢献とタイプ IIB と種類 IIX MyHC 陽性の線維 (図 2A B、左パネル) の主構成されました。事実上ないの線維は型を表現する私 MyHC は (図 2D、左) を認めた。我々 のデータはマウス脛骨は主に速筋線維タイプ IIA、IIB 型、型 IIX 繊維が以前研究5,10,13と一致していることを示します。もう一度、染色が認められなかった、一次抗体のプロトコル (図 2A ~ D、右パネル) から省略されていたセクションで。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56024/56024fig3.jpg"> 
図 3: 反復のコンピューター化された繊維セグメンテーション。マウス脛骨前方セクション (A) の明視野イメージ。(B) 半自動アルゴリズムを使用して同じイメージに変換します。タイプ IIA MyHC (C) の染色を示す同じセクションの蛍光イメージ。変換イメージだけタイプ IIA MyHC 表現する繊維 (D) を示しています。バー = 100 μ m.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/56024fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
形態計測学的解析を目的として immunostained フィールドの明視野画像も得られました。図 3Aに示す例は、IIA MyHCs13を入力する SC 71 抗体を用いて探る前脛骨筋セクションからです。元半自動化されたアルゴリズムを使用して、いくつかのイメージの変換は、明視野画像から確率マップを生成に使用されました。図 3Aに示すように明視野イメージから派生した典型的な画像変換は図 3Bに提示されます。変換とフィジーの細孔解析関数を使用して、最大値 (46.9 ± 1.3 μ m) とフィールドにおける個々 の繊維の最小 (26.0 ± 0.8 μ m) 平均フェレー径平均 CSA (891.4 ± 45.0 μ m2) を測定した.我々 の測定の再現性をテストするには、我々 はまた手動で明視野イメージでこれらのパラメーターを評価しました。平均 CSA (867.0 ± 52.0 μ2)、最大 (45.7 ± 3.5 μ m) と最小 (25.6 ± 1.9 μ m) 意味フェレー径より面倒な手動取得メソッドを使用して取得は半自動方式と大きく異なるでした (すべてのp &#62;0.05、対になっていないt-テスト;表 3)。
<img alt="Table 3" src alt="Table 3"></img alt="Table 3" src>="/files/ftp_upload/56024/56024table3.jpg"/> 
テーブル 3: タイプの前脛骨筋の immunostained の繊維形態と組成 I、IIA、IIB および IIX MyHCs 手動・半自動分析法によって決定される。繊維 CSA、フェレー径と提案手法と従来のマニュアル評価による定量化マウス脛骨の MyHC 型を意味します。合計分数が 1 つ以上の MyHC 型を表現する線維の存在のために 1 の値を超えることに注意してください。
図 3Cは、IIA MyHCs を入力する抗体と同じフィールド immunostained の蛍光イメージを示しています。フィールドで積極的に染色繊維番号 (図 3D) とした明視野変換フィールド (テーブル 3 の繊維の合計数で除して IIA MyHC 表現型繊維の割合を決定するには).当時はタイプ IIA 線維のフェレー径平均 CSA、最大値と最小評価 (表 3)。割合私 IIX とタイプ IIB 線維と同様、その寸法を入力し、このプロトコルを連続切片 immunostained BA f8 キー、6 H 1 BF F3 抗体とそれぞれ6,12(表 4 を繰り返すことによって決定されました。;図 4A ~ D)。
<img alt="Table 4" src="/files/ftp_upload/56024/56024table4.jpg"> 
表 4: MyHC コンテンツとマウスのヒラメ筋と前脛骨筋の形態。ヒラメ筋と前脛骨筋の代表的なセクションの繊維の種類組成。平均 CSA の定量化の最小と最大のフェレー径は IIX を入力タイプ I、IIA を入力し、タイプ IIB のヒラメ筋と前脛骨筋の両方が表示されます。データは、平均 ±SEM で指定されます。
ヒラメ筋 (表 4から得られるフィールドでこれらのパラメーターを検討しました。図 4A ~ D)。3,052 と 2,876 個々 の繊維は前脛骨筋とヒラメ筋のそれぞれ数えられました。一緒に取られて、これらのデータは、ファイバー型と形態計測学的解析における提案方式の実現可能性を実証します。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56024/56024fig4.jpg"> 
図 4: 形態計測学的解析データ概要。前脛骨筋とヒラメ筋 (A) 代表的なセクションのファイバー型組成。平均 CSA の定量化、minimimal、最大フェレー径タイプ I、IIA、入力 IIX と anteriort 前脛骨筋とヒラメ筋タイプ IIB 繊維 (B D) で表示されます。±SEM。 脛骨間に有意差を意味データを与えられ、ヒラメが示されます (* pを示します &#60; 0.05: * * pを示します &#60; 0.01; * * * pを示します &#60; 0.005; t 検定)。3,052 と 2,876 個々 の繊維は前脛骨筋とヒラメ筋のそれぞれ数えられました。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/56024fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Supplemental File" src="/files/ftp_upload/56024/56024supfile.jpg"> 
補足ファイル: 繊維定量マクロ。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/Tyagi_etal_fiber_quantification_macro" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

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Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

骨格筋線維タイプの新式の識別子として浮上している免疫組織化学的染色ミオシン重鎖アイソ フォームの (すなわち、タイプ I、IIA を入力、IIX を入力、IIB を入力)。ここでは、繊維の種類や繊維の形態の迅速な評価を容易にする新しい半自動アルゴリズムとともに汚損のプロトコルを提案する.

マウス骨格筋形態と繊維の種類組成の半自動解析

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

semi-automated-analysis-mouse-skeletal-muscle-morphology-fiber-type

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.3K ビュー.  University of Colorado School of Medicine. 骨格筋線維タイプの新式の識別子として浮上している免疫組織化学的染色ミオシン重鎖アイソ フォームの (すなわち、タイプ I、IIA を入力、IIX を入力、IIB を入力)。ここでは、繊維の種類や繊維の形態の迅速な評価を容易にする新しい半自動アルゴリズムとともに汚損のプロトコルを提案する.

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Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

単離骨格筋のミオ - 機械的分析

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

医学

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably adaptable to environmental factors1 such as hypertrophy by resistance exercise and atrophy by disuse. It thereby exhibits remodeling and adaptations to stressors (heat, ischemia, heavy metals, etc.)2,3. Damage can occur to muscle by a muscle exerting force while lengthening, the so-called eccentric contraction4. The contractile proteins can be damaged in such exertions and need to be repaired, degraded and/or resynthesized; these functions are not part of the contractile proteins, but of other much less abundant proteins in the cell. To determine what subset of proteins is involved in the amelioration of this type of damage, a global proteome must be established prior to exercise5 and then followed subsequent to the exercise to determine the differential protein expression and thereby highlight candidate proteins in the adaptations to damage and its repair. Furthermore, most studies of skeletal muscle have been conducted on the male of the species and hence may not be representative of female muscle. 
In this article we present a method for extracting proteins reproducibly from male and female muscles, and separating them by two-dimensional gel electrophoresis followed by high resolution digital imaging6. This provides a protocol for spots (and subsequently identified proteins) that show a statistically significant (p &lt; 0.05) two-fold increase or decrease, appear or disappear from the control state. These are then excised, digested with trypsin and separated by high-pressure liquid chromatography coupled to a mass spectrometer (LC/MS) for protein identification (LC/MS/MS)5. This methodology (Figure 1) can be used on many tissues with little to no modification (liver, brain, heart etc.).

A straight-forward set of methods to isolate and determine the identity of the most abundant proteins expressed in skeletal muscle. About 800 spots are discerned on a two-dimensional gel from 10 mg muscle; this allows for the determination of gender-specific protein expression. These methods will give equivalent results in most tissues.

プロテオミクスから骨格筋の性別二型

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

経胸壁心エコー検査による肺動脈狭窄のマウスモデルにおける右室の構造と機能の評価

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

変更されたベルイストローム法を用いたヒト骨格筋生検手順

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Quantitative Magnetic Resonance Imaging of Skeletal Muscle Disease

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of living systems. Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using qMRI methods. The MRI acquisition protocol begins with localizer images (used to locate the position of the body and tissue of interest within the MRI system), quality control measurements of relevant magnetic field distributions, and structural imaging for general anatomical characterization. The qMRI portion of the protocol includes measurements of the longitudinal and transverse relaxation time constants (T1 and T2, respectively). Also acquired are diffusion-tensor MRI data, in which water diffusivity is measured and used to infer pathological processes such as edema. Quantitative magnetization transfer imaging is used to characterize the relative tissue content of macromolecular and free water protons. Lastly, fat-water MRI methods are used to characterize fibro-adipose tissue replacement of muscle. In addition to describing the data acquisition and analysis procedures, this paper also discusses the potential problems associated with these methods, the analysis and interpretation of the data, MRI safety, and strategies for artifact reduction and protocol optimization.

Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using non-invasive magnetic resonance imaging methods.

骨格筋疾患の定量的磁気共鳴イメージング

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

人間<em&gt;外側広筋</emワイル・ブレークスリーConchotomeを使用&gt;骨格筋生検

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Induction and Assessment of Exertional Skeletal Muscle Damage in Humans

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery in humans. Herein we discuss the design of an eccentric exercise protocol to induce damage in the quadriceps muscles, marked by changes in strength, soreness, and plasma creatine kinase levels. This method is simple, ethical, and widely applicable since it is performed in human participants and eliminates the interspecies translation of the results. Subjects perform 300 maximal eccentric contractions of the knee extensor muscles at a speed of 120&#176;/sec on an isokinetic dynamometer. The extent of the damage is measurable using relatively non-invasive isokinetic and isometric measures of strength loss, soreness, and plasma creatine kinase levels over several days following the exercise. Therefore, its application can be directed to specific populations in an attempt to identify mechanisms for muscle adaptation and regeneration.

This article describes a safe and reliable method to induce and quantify exertional skeletal muscle damage in human subjects.

ヒトにおける労作骨格筋損傷の誘導および評価

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery ...

Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed in mice is high. Phenotypic characterization of these mouse models also requires the examination of cardiac function and morphology. Echocardiography and magnetic resonance imaging (MRI) are commonly used approaches to characterize cardiac function and morphology in mice. Echocardiographic and MRI equipment specialized for use in small rodents is&#160;expensive and requires a dedicated space. This protocol describes cardiac measurements in mice using a clinical echocardiographic system with a 15 MHz human vascular probe. Measurements are performed on anesthetized adult mice. At least three image sequences are recorded and analyzed for each animal in M-mode in the parasternal short-axis view. Afterwards, cardiac histological examination is performed, and cardiomyocyte diameters are determined on hematoxylin-eosin- or wheat germ agglutinin (WGA)-stained paraffin sections. Vessel density is determined morphometrically after Pecam-1 immunostaining. The protocol has been applied successfully to pharmacological studies and different genetic animal models under baseline conditions, as well as after experimental myocardial infarction by the permanent ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD). In our experience, echocardiographic investigation is limited to anesthetized animals and is feasible in adult mice weighing at least 25 g.

Echocardiographic examination is frequently used in mice. Expensive high-resolution ultrasound devices have been developed for this purpose. This protocol describes an affordable echocardiographic procedure combined with histological morphometric analyses to determine cardiac morphology.

マウスの心臓形態の心エコー検査・組織学的検討

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed ...

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

身体組成と高脂肪給電マウスにおける代謝ケージ分析

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel interventions have remained elusive. This is likely due, in part, to a reliance on preclinical prevention models investigating the effects of genetic manipulations or pharmacological treatments on atherosclerosis development rather than the established disease. Also, results of these studies are often confounding because of the use of superficial lesion analyses and a lack of characterization of lesion cell populations. To help overcome these translational hurdles, we propose an increased reliance on intervention models that employ investigation of changes in cellular composition at a single cell level by immunofluorescent staining and confocal microscopy. To this end, we describe a protocol for testing a putative therapeutic agent in a murine intervention model including a systematic approach for animal dissection, embedding, sectioning, staining, and quantification of brachiocephalic artery lesions. In addition, due to the phenotypic diversity of cells within late-stage atherosclerotic lesions, we describe the importance of using cell-specific, inducible lineage tracing mouse systems and how this can be leveraged for unbiased characterization of atherosclerotic lesion cell populations. Together, these strategies may assist vascular biologists to more accurately model therapeutic interventions and analyze atherosclerotic disease and will hopefully translate into a higher rate of success in clinical trials.

We propose a standardized protocol to characterize the cellular composition of late-stage murine atherosclerotic lesions including systematic methods of animal dissection, tissue embedding, sectioning, staining, and analysis of brachiocephalic arteries from atheroprone smooth muscle cell lineage tracing mice.

平滑筋細胞系譜トレース マウスの高度な動脈硬化病変における細胞構成の定量的解析

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...