Boettcher Vakfı ve amyotrofik Lateral skleroz Derneği (#17-II-344) bu araştırma verdikleri destek için minnettarız.

fareler içeren tüm yordamları Colorado Üniversitesi-Anschutz tıbbi kampüs kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi (91813(05)1D).
 1. gün 1: İlköğretim (1°) sığır Serum Albumin (BSA) engelleme ile Immunostaining fare hindlimb kas (örneğin, tibialis anterior, soleus) <ol><li>Air-dry donmuş bölümlerini monte için şarj edilmiş slaytlarda ~ 30 dk 11. bir hidrofobik bariyer PAP kalem kullanma bölümlerine bir kenarlık çiz.</li>
	<li>Yer ~ 250 µL % 5 BSA/fosfat tamponlu tuz (BSA/PBS) non-spesifik antikor bağlama engellemek için her bir slayt. Slaytlar, oda sıcaklığında 1 h. için kuluçkaya</li>
	<li>Engelleme iken, 1:50 hazırlamak dilutions 1° antikor süpernatant % 5'in BSA/PBS (tüm fare monoklonal antikorlar; bkz. Tablo 1 6 , 12); in 250 µL hazırlamak çözüm slayt başına. 1 ° antikor stokları ve dilutions buz üzerinde tutmak</li>
</ol> <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56024/56024table1.jpg" /> Tablo 1: birincil MyHCs ayırt etmek için kullanılan antikorlar.
<ol start="4"> <li>% 5 BSA/PBS engelleme çözüm aspirasyon 1 ° antikor seyreltme 250 µL uygun slaytlara ekleyin. 250 eklemek µL % 5'lik BSA/PBS ikincil (2°) salt antikor negatif kontrol için slaytlar.</li>
	<li>Incubate için 24-48 h nemli bir ortamda 4 ° C'de. 
	Not: Alüminyum folyo nemlendirilmiş filtre kağıdı ile kaplı bir petri uygun kuluçka odası hizmet verebilir.</li>
</ol> 2. Gün 2:2 ° floresan antikor ile Immunostaining <ol><li>Aspire 1° antikor çözüm ya da %5 BSA/PBS çözüm kontrol. Yıkama tüm slaytlar üç kez, 10 min %5 BSA ile.</li>
	<li>Yıkama sırasında arıtılmış, fluorophore Birleşik 2 ° antikorlar % 5, 1: 200 dilutions hazırlamak BSA/PBS (bkz. Tablo 2, tüm keçi Anti-fare vardır). Çözüm slayt başına 250 µL hazırlayın. Buz üzerinde 2 ° fluorophore Birleşik antikorlar anlatmamanı</li>
</ol> <img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/56024/56024table2.jpg" /> Tablo 2: Fluorophore Birleşik ikincil görselleştirmek birincil antikor tanıma, MyHCs için kullanılan antikorlar.
<ol start="3"> <li>üçüncü uygulama %5 BSA/PBS engelleme çözümün aspirasyon 2 ° antikor seyreltme 250 µL tüm slaytlara ekleyin. Karanlık, nemli bir ortamda oda sıcaklığında 90 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Aspire edin 2° antikor çözüm. Yıkama tüm slaytlar üç kez, % 5 ile 10 dk BSA/PBS.</li>
	PBS ile <li>durulama. 10 dakika süreyle kuru</li>
	<li>Coverglass bir kalıcı olmayan, düşük viskozite sulu montaj orta ile mount.</li>
	<li>Zaman kuru, slayt kenarları oje ile kapatın. Kuru ve mağaza içinde karanlık bir slidebox.</li>
</ol> 3. Epifluorescence mikroskobu ile slaytlar Imaging <ol><li>temiz bir bezle küçük, % 70 etanol bulanmış laboratuvar-slaytlar.</li>
	<li>İmmunostained kas bölümlerin (Tablo reçetesi görmek) bir fotoğraf cihazları ile donatılmış bir epifluorescence mikroskop kullanarak dijital görüntüler elde edilir.
	<ol><li>Yaklaşık 1 mm 2 (10 X amaç, 1.4 NA) alanı seçin.</li>
		<li>View 2° Alexa 488 Birleşik antikor floresan bir 505 üzerinden nm uzun geçiren Filtre. Uyarma 595 nm uzun geçiren Filtre üzerinden 2 ° Alexa 594 Birleşik antikorların tarafından oluşturulan Floresans görüntüleyin. Görüntüleri dijital ortama uyumlu bir görüntüleme yazılımı ile donatılmış bir bilgisayar ile. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı daha sonraki analizler için ölçek çubuğu içerir.</li>
	</ol></li></ol> 4. Fiji görüntülerle analizi Not: analizi ile devam etmeden önce Fiji (serbestçe Ulusal Sağlık enstitüleri, Bethesda, MD kullanılabilir) https://imagej.net/Fiji/Downloads yüklenmesi gerekir. Bu süreç içinde kullanılan makro içinde belgili tanımlık Ek dosya mevcuttur. Makro dosyasını kolayca erişilebilir bir dizine yerleştirin.
Seçilen kısımda Fiji <ol><li>yük bir aydınlık alan görüntüsü. Eklentileri gidin &#8594; segmentasyon &#8594; öğretilebilir Weka segmentasyon.</li>
	Bölüm, hücresel alanlarında şart için <li>bir kumaş üzerinde bir çizgi çizin ve'ı tıklatın &#34; class 1 Ekle &#34;. O zaman, uzay lifler arasında bir çizgi çizin ve'ı tıklatın &#34; class 2 Ekle &#34; ekstrasellüler etki alanları işaretlemek için. Her sınıfta 5-10 etiketleri kadar yineleyin.
	<ol><li>Tıklayın tren Sınıflandırıcısı. Elde edilen kırmızı ve yeşil yerleşim üzerinde daha fazla etiket el ile eklemek (bkz. Adım 4.2) görüntü, gerekirse yanlış kesimli bölümlerine. Lifleri (kırmızı) uygun şekilde lifleri (yeşil) arasındaki boşluğu ayrılır kadar yineleyin.</li>
	</ol></li> <li>'I tıklatın &#34; olasılık almak &#34; ve görüntü yeni etiketli bir klasöre kaydedin.</li>
	<li>İle aynı alandan alınan floresan görüntü (Adım 4.2-4.3) Yukarıdaki yordamı yineleyin. Etiket immunostained lifleri olarak &#34; sınıf 1 &#34; ve tüm sigara floresan bölgeleri olarak &#34; sınıf 2 &#34;. Elde edilen olasılık harita işlenmiş aydınlık alan görüntünün depolandığı klasöre kaydedin.</li>
	<li>Önceden kaydedilmiş olasılık haritalardan biri Fiji'de açın. Düşsel bilgisayar yazılımı tarafından sağlanan ölçek çubuğu üzerinde düz bir çizgi çizin. Analiz gitmek &#8594; ayarla ölçek. Ölçek çubuğu tarafından verilen uygun değerlerine (Yani, bilinen mesafesi, uzunluk birimi) parametreleri değiştirmek sonra kontrol &#34; Global &#34; kutusunu her görüntü için ölçek standartlaştırmak için.</li>
	<li>Eklentileri gidin &#8594; makroları &#8594; çalıştırmak &#8594; Tyagi'yi vd. fiber miktar macro.ijm (Ek dosya bakın). Hemen, bir gezinti bölmesi görünür. Açık belgili tanımlık imge &#39; s ana klasör; bir iletişim kutusu görüntülenir. Her iletişim kutusu için değiştirmek &#34; arka plan &#34; açılan değerine &#34; ışık. &#34; Not: klasörü şimdi görüntüler fiber özetliyor ve elektronik yazılım dosyaları (CSA ve Feret çapı için en uygun sonuçları ile doldurulur lif morfolojisi miktarının; ölçülen parametreler analiz ayarla ölçümlerde ayarlanabilir). Fiji gözenek analiz işlevi kullanılarak oluşturulan lif morfolojisi veri otomatik olarak her iki floresan ve parlak alan görüntüler için elektronik tablo yazılımı dosyalar için transfer.</li>
	<li>Lifleri floresan lifleri alanındaki sayıya karşılık gelen parlak alan resimdeki toplam liflerinin sayısı bölerek bir alanda belirli bir MyHC ifade kısmını hesaplamak.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essentiality+of+histo-+and+cytochemical+studies+of+skeletal+muscle+in+the+investigation+of+neuromuscular+disease.">The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease.</a> Neurol. 12, 778-784 (1962).</li><li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+is+a+primary+target+of+SOD1G93A-mediated+toxicity.">Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.</a> Cell Metab. 8, 425-436 (2008).</li><li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricting+calcium+currents+is+required+for+correct+fiber+type+specification+in+skeletal+muscle.">Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle.</a> Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).</li><li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+the+histochemical+demonstration+of+actomyosin+ATPase.">Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase.</a> Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).</li><li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat,+mouse,+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis.">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li><li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains.">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++permeation+and/or+binding+to+Cav1.1+fine-tunes+skeletal+muscle+Ca2++signaling+to+sustain+muscle+function.">Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function.</a> Skelet Muscle. 5 (4), (2015).</li><li>Sawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-step+immunostaining+method+to+visualize+rodent+muscle+fiber+type+within+a+single+specimen.">A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen.</a> PLoS One. 11 (11), (2016).</li><li>Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+image+analysis+tool+for+the+classification+of+muscle+fibre+type+using+immunohistochemical+staining.">Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining.</a> Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).</li><li>Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+immunohistochemical+classification+of+skeletal+muscle+fibres+in+mouse.">A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse.</a> Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), (2015).</li><li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres.">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).</li><li>Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+fiber+types+in+C57Bl6j+mice.">Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice.</a> Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).</li><li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles.">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li><li>Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+and+skeletal+muscle+adaptations+to+voluntary+wheel+running+in+the+mouse.">Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).</li></ol>

Yazarlar ifşa etmek çakışan hiçbir ilgi alanlarına sahip.

Burada, bizim iskelet kas lif türleri tanımlanması için yararlı yön vermişlerdir. Bunu yaparken, biz veri analizi için yeni bir algoritma tanımlamak.
Bizim sonuçları büyük ölçüde bu önceki raporlar5,8,10 onaylayın ve bizim kendi el ile ölçümleri yansıtmak beri algoritma doğru gibi görünüyor. Yine de, yapı kesit sonucu belirsiz fiber Kenarlıklar dahil olmak üzere bazı nadir deneysel tuzaklar ile karşılaştı. Dikkatli kesit ve analiz önce işlenmiş bölüm uyanık incelenmesi yoluyla bu eserler etkisini en aza indirilebilir. Özellikle, daha az optimum görüntü segmentasyonu sınıflandırma daha keskin kontrast elde etmek için aynı görüntü üzerinde birden fazla mermi ile hile.
Bizim protokolü en önemli adımda hangi biz kısmındaki hücresel ve ekstraselüler alanlarında belirli bir lif üzerinde bir çizgi çizerek böylece "sınıf 1" veya "sınıf 2" alan ayrım şart 4.2 adım. Belli ki, kas lifleri sınırlarını belirler çünkü el ile bu ayrım önemlidir; bir hata bu adımda lif boyutları değerlendirilmesi olumsuz yönde etkiler.
Bu çalışmada, belirli bir seri bölümünde tek bir MyHC için bölümler probed. Ancak, karma lifler gibi bazı lifler MyHC, (örneğin, IIX yazıp IIB) metabolik/fonksiyonel profilleri örtüşen gösterge niteliğindeki iki tür ifade. Böylece, kesirler fiber türü için bir değer özetlenebilir &#62; soleus ve tibialis anterior (şekil 4A) için 1. Karma lifler-ebilmek var olmak identified ile çift-, ya da hatta üçlü Lee ve ark. tarafından açıklanan gibi protokoller etiketleme, 7ve Bloemberg ve Quadrilatero5, anılan sıraya göre. Önemlisi, bizim yöntemi analiz bu daha karmaşık boyama iletişim kuralları için uygulanır. Bizim Protokolü'nün başka bir sınırlama tam otomatik değil mi; Ancak, bu küçük imtiyaz bizim yöntem rigor hız uğruna ödün vermeyen sağlar inanıyoruz.
Bu çalışmada gözlenen soleus ve tibialis anterior kaslar MyHC kompozisyonlar önceki çalışmalar5,6,7,10,14 sonuçlar yansıtacak iken , CSA değerlendirilmesi ile ilgili olarak daha önceki çalışmalar bazı kontrastlı vardır. Örneğin, bizim ölçümleri ortalama CSA biraz bu Bloemberg ve Quadrilatero5 ve Allen ve arktarafından rapor daha küçüktür. 15 iken onların kabaca 735.7 ± 31.2 µm2 ile 3073.8 ± 51.3 µm2yayılmış özellikle bizim CSA ölçümleri 539.86 ± 24.44 µm2 den 1319.50 ± 57.47 µm2 için lif türleri arasında değişiyordu. Ancak, Değerlerimiz daha yakından bu Augusto vd tarafından gözlenen benzer 13 ve Lucas vd. sırasıyla 2404 ± 412.5 µm2 ve 815 ± 221 µm2 ile 1904 ± 570 µm2, 436 ± 605 µm2 arasında değişen ortalama CSAs bildiren 6 . Böylece, fare hindlimb lifleri xarakteristikaları analizi bazı değişkenlik edebiyat arasında bulunmaktadır.
İmmünhistokimya etiket ve kas lifleri MyHC içeriklerini temelinde sınıflandırmak için etkili bir yol sunar. İmmunohistokimyasal deneyler doğru miktar veriler hakkında anlamlı sonuçlar yapmak için önemlidir; Özellikle yüz, ya da hatta bin liflerinin ölçülen ve sınıflandırılmış gerekir bu amaçla, analiz sıkıcı parçalarını otomatikleştirebilirsiniz bir yararlı bir yöntemdir. Ölçümler için elle yapılan gözlemler benzer sağlamanın yanı sıra, bizim algoritma önyargı olmadan bu verilerin doğru bir değerlendirme sağlar; el ile yapılan ölçümler bu avantaj bilimsel rigor sağlar. Bu bağlamda, metodolojimiz kas bütünlük etkisi genetik ve deneysel manipülasyonlar etkileri karakterizasyonu yararlı olabilir. Özellikle, bizim hızlı analiz yöntemi ile birleştiğinde MyHC immünhistokimya kas hastalığı modelleri gibi kas dystrophies, morfolojik ve metabolik değişiklikler değerlendirmek için istihdam edilebilir ALS ve kanser kaşeksi. Ayrıca, hangi Atrofi önlemek veya hipertrofisi neden müdahalelerin etkinliğini de tabi.

Kas iskelet birçok türleri1tek liflerinin oluşan bir süredir bilinmektedir. Başlangıçta, iki grup liflerinin contractile özelliklerine göre karakterize ve adli, uygun şekilde, yavaş seğirme (tip ı) ve hızlı-seğirme (tip II). Bu kategoriler daha fazla lif metabolizma temelinde ayırt edildi. Beri tip ı lifleri mitokondri içinde zengin ve oksidatif metabolizma güvenen, onlar sağlam olumlu Nikotinamid adenin dinükleotit-tetrazolium redüktaz (NADH-TR) diaphorase2 ya da süksinat dehidrogenaz (SDH)3 ile aydınlatılmamıştır boyama. Buna karşılık, tip II lifleri daha az sergilenen ve değişken derece NADH-TR diaphorase veya SDH boyama ve iki fast twitch alt gruplar ayrıldı (IIA ve IIB yazın) biraz kabaca göreli oksidatif kapasite üzerinde dayalı. Bu ayrımlar lifler arasında-var daha etkili bir şekilde görselleştirildiği myosin-ATPaz boyama tarafından nerede tip ı lifleri leke karanlık pH 4.0 öncesi bir kuluçka sonra ve tip IIB lifleri absorbe pH 10.0 tip IIA lifleri ile acele aşağıdaki ön kuluçka ayda4boyama.
Daha yakın zamanlarda, immunohistokimyasal myosin ağır zincir (MyHC) izoformlarının boyama lif tipi5ince bir ayrıştırıcı ortaya çıkmıştır. Tip ı, IIA yazın ve tip IIB lifleri tüm hassasiyetle onların MyHC profiline göre belirlenebilir. Ayrıca, başka bir fast twitch metabolik olarak orta fiber türü, IIX, yazın tanımlanan6oldu. Birden fazla MyHC ifade karma lifler de teyit edilen5,7,8olmuştur. Kedi ve maymun gibi bazı türler değil hızlı Tip IIb MyHCs6için bilinir. MyHC immunostaining Kas kompozisyonu state-of--art değerlendirilmesi şu anda olsa da, bu tekniği ile elde edilen verilerin analizi hantal ve zaman alıcı otomatik yardımı olmadan. Bu amaçla, bu verileri çözümlemek için yarı otomatik yöntemleri bir avuç gelişmiş5,9,10olmuştur. Burada, kas lif tipi5,7,8,10, immunohistokimyasal tanımlanması için nispeten standart bir protokol ile birlikte bir roman yarı otomatik mevcut fiber türü ve lif morfolojisi analizini hassasiyetle hızlandırır algoritması.

<table width="974">
	<colgroup>
		<col style="width:226pt" width="301" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:172pt" width="229" />
		<col style="width:193pt" width="257" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Bovine Serum Albumin</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A9418-100G</td>
			<td class="xl66" style="width:193pt" width="257">5% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="41" style="height:30.75pt">
			<td class="xl65" height="41" style="width:226pt;height:30.75pt" width="301">Hydrophobic Barrier Pap Pen</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Scientific Device Laboratory</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">9804-02</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Microscope Slides</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Globe Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">1358W</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Coverglass</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">12-544-E</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Immumount</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl68" style="width:172pt" width="229">9990402</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Nail Polish</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">L&#39;Oreal</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="41" style="height:30.75pt">
			<td class="xl65" height="41" style="width:226pt;height:30.75pt" width="301">Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">Discontinued</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">SPOT RT/KE</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">SPOT Imaging Solutions</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">RT940</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Dell Optiplex</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">BA-F8 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgG2b; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">SC-71 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monclonal mouse IgG1; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">BF-F3 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgGM; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">6H1 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgGM; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 594 anti-IgG2b</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21145</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse; 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 488 anti-IgG1</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21121</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse;1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 594 anti-IgGM</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21044</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse;1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">OCT</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Sakura Finetek</td>
			<td class="xl68" style="width:172pt" width="229">4583</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">isopentane</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">O3551-4</td>
			<td class="xl66">cool with liguid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">PBS</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Bioreagents</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">BP665-1</td>
			<td class="xl66">10X, dilute to 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Kim wipes</td>
			<td class="xl66">Kimberly-Clark</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">06-666A</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated analysis of mouse skeletal muscle morphology and fiber-type composition

Yıllardır, iskelet kas lif türleri arasında ayrım en iyi myosin-ATPaz boyama tarafından görüntülenmiştir. Daha yakın zamanlarda, immunohistokimyasal myosin ağır zincir (MyHC) izoformlarının boyama fiber türü daha ince bir ayrıştırıcı ortaya çıkmıştır. Tip ı, IIA, IIX yazın yazın ve tip IIB lifleri şimdi onların MyHC profiline dayalı hassasiyetle tespit edilebilir; Ancak, bu verilerin el ile analiz yavaş ve aşağı doğru olabilir sıkıcı. Bu bağlamda, hızlı, doğru değerlendirme fiber türü kompozisyon ve Morfoloji çok arzu edilen bir araçtır. Burada, MyHCs fare hindlimb kas fiber türü ve lif morfolojisi analizini hızlandırır roman yarı otomatik bir algoritma ile uyum içinde elde edilen donmuş bölümlerinde, state-of--art immunohistokimyasal boyama için bir iletişim kuralı mevcut. Beklendiği gibi görüntülenen soleus kas-için boyama tip ı ve tip IIA lifleri, ama türü IIX ya da tip IIB lifleri için değil. Öte yandan, tibialis anterior kas türü IIX ve tip IIB liflerinin, tip IIA lifleri küçük bir kısmını ağırlıklı olarak bestelendi ve az veya hiç tip ı lifleri. Birkaç görüntü dönüşümleri lif morfolojisi (Yani, kesit alanı (CSA), maksimum ve minimum Feret çapı) farklı yönlerini ölçmek amacıyla olasılık haritalar oluşturmak için kullanılan. Bu parametreler sonra el ile elde edilen değerler ile karşılaştırıldı için elde edilen değerler. Hiçbir önemli farklılıklar analiz CSA, maksimum veya minimum Feret çapı açısından her iki mod arasında gözlendi (tüm p &#62; 0,05), bizim yöntem doğruluğunu gösteren. Böylece, bizim immunostaining Çözümleme Protokolü Kas kompozisyonu yaşlanma ve myopathy birçok model üzerinde etkileri incelenmesi için uygulanabilir.

Bilinmeyen yaş bir erkek C57BL/6 fareden kesmiştim Hindlimb kasları (Yani, tibialis anterior, soleus) sıvı azot soğutmalı isopentane bileşik kas Ekim içeren bir plastik kalıp batan tarafından dondurulmuş flaş. Sonra bir cryotome kullanarak, 8-10 µm seri bölümler-20 ° C'de kesmek ve farklı olumlu tahsil cam slayt12' ye transfer.
Bu kaslar ağırlıklı olarak hızlı ve yavaş-seğirme liflerinin, sırasıyla13,14oluşur çünkü tibialis anterior ve soleus seçti. Ben, IIA, IIX ve IIB MyHCs, bireysel türü için boyama immunohistokimyasal aydınlık alan ve floresan görüntüleri ele geçirildi. Şekil 1 sol panelleri soleus kas immunostained türü ile bölümlerini göster ben IIA, IIX ve IIB MyHC özel antikorlar listelenen Tablo 1' de.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56024/56024fig1.jpg"> 
Resim 1 : MyHC immunohistokimyasal boyama tip ı, IIA ve IIB fare soleus kas IIX. Sol kapı aynası yazın ben (BA-F8; yönelik birincil antikorlar ile probed fare soleus kas bölümlerini elde edilen floresan resimleri göster A), IIA (SC-71; yazın B), yazın IIX (6 H 1; C) ve tip IIB (BF-F3; D) MyHCs. Doğru kapı aynası içinde karşılık gelen sol panelde tasvir deneyinde kullanılan birincil antikor ihmal bölümlerde gösterilmiştir. Barlar 100 µm. = <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/56024fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Özellikle, biz gözlenen türü ifade liflerinin önemli kesirler ben (şekil 1A, sol) ve tip IIA MyHCs (şekil 1B, sol) ile adil bir miktar kalan liflerinin olumlu türü için boyama görüntüleme IIX MyHCs (şekil 1C, sol). Buna karşılık, hemen hemen hiçbir türü IIB lifleri belirgin (şekil 1D, sol) vardı. Bu gözlemler soleus kaslar daha önceki raporları ile tutarlı türü çoğunlukla oluşmaktadır, IIA yazıp IIX lifleri (çok az) neredeyse hiçbir türüyle IIB lifleri5,10,12. Da önemlisi, hiçbir boyama hangi antikor (şekil 1A-D, doğru kapı aynası) özgüllük gösteren iletişim kuralından birincil antikor atlanmış bölümlerde gözlendi.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56024/56024fig2.jpg"> 
Resim 2 : MyHC immunohistokimyasal boyama IIB, IIX, IIA ve ben fare tibialis anterior kas yazın. Sol kapı aynası bir fare tibialis anterior kas IIB(a)yazın, IIX (B) yazın, IIA (C) yazın ve yazın (D) MyHCs Yönetmen: birincil antikorlar ile probed bölümlerini elde edilen floresan resimleri göster. Doğru kapı aynası içinde bitişik sol panelde tasvir deneyinde kullanılan birincil antikor ihmal bölümlerde gösterilmiştir. Barlar 100 µm. = <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/56024fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Ayrıca söz konusu antikorlar ile tibialis anterior kaslar lekeli. Tibialis anterior kas liflerinden tip IIA MyHCs (Şekil 2C, sol); ifade daha küçük katkılarıyla çoğunlukla Tip IIb ve türü IIX MyHC pozitif liflerinin (panelleri yaptıŞekil 2A-B) oluşturuldu hemen hemen hiçbir elyaf türü ifade ben MyHC (Resim 2D, sol) gözlendi. Fare tibialis anterior IIB yazın hızlı twitch tip IIA, ağırlıklı olarak oluşur ve türü IIX lifleri daha önceki çalışmaları5,10,13ile tutarlı olduğunu gösteren bizim veri. Yine, hiçbir boyama hangi Protokolü (Şekil 2A-D, doğru kapı aynası) birincil antikor atlanan bölümlerdeki gözlendi.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56024/56024fig3.jpg"> 
Şekil 3 : Tekrarlayan bilgisayarlı fiber segmentasyon. Aydınlık alan görüntü bir fare tibialis anterior bölümün(a). Bizim yarı otomatik algoritması (B) ile aynı görüntü dönüşümü. İmmunostaining tip IIA MyHC (C) gösterilen aynı bölüm floresan görüntü. Tek tip IIA MyHC ifade lifleri (D) gösterilen dönüştürme görüntü. Barlar 100 µm. = <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/56024fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Xarakteristikaları analizi amacıyla, aydınlık alan görüntüleri immunostained alanlarının da elde ettim. Şekil 3'A gösterilen örnek tibialis anterior kas bölümünden IIA MyHCs13yazın yönelik SC-71 antikorlar ile probed olduğunu. Bizim orijinal yarı otomatik algoritması kullanan birkaç görüntü dönüşümleri olasılık haritalar aydınlık alan görüntüleri oluşturmak için kullanılan. Şekil 3' teA gösterilen aydınlık alan görüntüden türetilmiş bir tipik görüntü dönüştürme şekil 3' teBsunulmaktadır. Dönüşümün ve Fiji gözenek analiz işlevini kullanarak, biz ortalama CSA (891.4 ± 45.0 µm2), en fazla (46.9 ± 1.3 µm) ve en az (26.0 ± 0,8 µm) ortalama Feret çapları her lif alanında ölçülen. Bizim ölçümleri kalitesini test etmek için biz de bu parametreler aydınlık alan görüntü el ile değerlendirildi. Feret çapları daha sıkıcı el ile satın alma yöntemi kullanılarak elde edilen yarı otomatik yönteminden farklı değildi demek CSA (867.0 ± 52.0 µm2), (45,7 ± 3.5 µm) maksimum ve minimum (25,6 ± 1.9 µm) demek (tüm p &#62; 0,05, unpaired t-testleri; Tablo 3).
<img alt="Table 3" src alt="Table 3"></img alt="Table 3" src>= "/ files/ftp_upload/56024/56024table3.jpg" / > 
Tablo 3: lif morfolojisi ve tibialis anterior kas immunostained türünün bileşimi ben, IIA ve IIB IIX manuel ve yarı otomatik analitik yöntemleri tarafından belirlenen MyHCs. Fiber CSA demek, Feret çap ve MyHC tipinde geleneksel el ile değerlendirme karşı sunulan algoritma üzerinden sayısal bir fare tibialis anterior. Kombine kesirler 1 birden fazla MyHC türü ifade lifleri varlığı nedeniyle değeri aşan unutmayın.
Şekil 3 C IIA MyHCs yazın yönelik antikorlar ile aynı alan immunostained floresan bir görüntüsünü gösterir. Olumlu lekeli lifleri alanındaki sayı (şekil 3D) tarafından seçilen ve lifleri (Tablo 3 aydınlık alan dönüşüm alanında toplam sayısı bölünerek tip IIA MyHC ifade lifleri kısmını belirlemek için kullanılan ). Feret çapları tip IIA liflerinin o zamanlar ortalama CSA, maksimum ve minimum (Tablo 3) değerlendirildi. Oranı yazın ben, türü IIX ve tip IIB lifler, aynı zamanda onların boyutları, bu protokol için seri bölümler immunostained sırasıyla6,12(Tablo 4 BA-F8, 6 H 1 ve BF-F3 antikorlar, tekrar ederek belirlendi ; Şekil 4 A-D).
<img alt="Table 4" src="/files/ftp_upload/56024/56024table4.jpg"> 
Tablo 4: MyHC içerik ve Morfoloji fare soleus ve tibialis anterior. Fiber türü besteleri soleus ve tibialis anterior temsilcisi bölüm. Miktar ortalama CSA, minimal ve maksimal Feret çapları, tip ı, IIA, yazın IIX yazın ve soleus ve tibialis anterior Tip IIb gösterilir. Verileri ortalama ±SEM verilir.
Biz de bu parametreler soleus kas (Tablo 4; elde bir alanda değerlendirildi Şekil 4 A-D). 3,052 ve 2,876 bireysel lifler tibialis anterior ve soleus kaslar, için sırasıyla sayıldı. Birlikte ele alındığında, bu veriler bizim yöntem fiber türü ve xarakteristikaları analizi fizibilite göstermek.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56024/56024fig4.jpg"> 
Şekil 4 : Xarakteristikaları analiz veri özeti. Tibialis anterior ve soleus kaslar(a)temsilcisi bölümlerini fiber türü kompozisyonlar. Miktar ortalama CSA, minimimal ve maksimal Feret çapları, tip ı, IIA, yazın IIX yazın ve tip IIB fivers tibialis anteriort ve soleus (B-D) gösterilir. Veri anlamına ±SEM. tibialis anterior arasında önemli farklılıklar verilen ve soleus belirtilir (* p gösterir &#60; 0,05: ** p gösterir &#60; 0,01; *** p gösterir &#60; 0,005; t-Testi). 3,052 ve 2,876 bireysel lifler tibialis anterior ve soleus kaslar, için sırasıyla sayıldı. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/56024fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Supplemental File" src="/files/ftp_upload/56024/56024supfile.jpg"> 
Ek dosya: Fiber miktar makro. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/Tyagi_etal_fiber_quantification_macro" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition at JoVE.com

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

İmmunohistokimyasal myosin ağır zincir izoformlarının boyama iskelet kas lif tipi state-of--art ayrıştırıcı çıkmıştır (Yani, tip ı, IIA yazın, yazın IIX, IIB yazın). Burada, bir boyama protokol hızlı fiber türü ve lif morfolojisi değerlendirilmesi kolaylaştırır bir roman yarı otomatik algoritması ile birlikte mevcut.

Fare kas iskelet morfoloji ve Fiber türü kompozisyon yarı otomatik analizi

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

semi-automated-analysis-mouse-skeletal-muscle-morphology-fiber-type

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.3K Görüntüleme.  University of Colorado School of Medicine. İmmunohistokimyasal myosin ağır zincir izoformlarının boyama iskelet kas lif tipi state-of--art ayrıştırıcı çıkmıştır (Yani, tip ı, IIA yazın, yazın IIX, IIB yazın). Burada, bir boyama protokol hızlı fiber türü ve lif morfolojisi değerlendirilmesi kolaylaştırır bir roman yarı otomatik algoritması ile birlikte mevcut.

Video: Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

İzole İskelet Kası Myo-mekanik Analizi

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Tıp

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably adaptable to environmental factors1 such as hypertrophy by resistance exercise and atrophy by disuse. It thereby exhibits remodeling and adaptations to stressors (heat, ischemia, heavy metals, etc.)2,3. Damage can occur to muscle by a muscle exerting force while lengthening, the so-called eccentric contraction4. The contractile proteins can be damaged in such exertions and need to be repaired, degraded and/or resynthesized; these functions are not part of the contractile proteins, but of other much less abundant proteins in the cell. To determine what subset of proteins is involved in the amelioration of this type of damage, a global proteome must be established prior to exercise5 and then followed subsequent to the exercise to determine the differential protein expression and thereby highlight candidate proteins in the adaptations to damage and its repair. Furthermore, most studies of skeletal muscle have been conducted on the male of the species and hence may not be representative of female muscle. 
In this article we present a method for extracting proteins reproducibly from male and female muscles, and separating them by two-dimensional gel electrophoresis followed by high resolution digital imaging6. This provides a protocol for spots (and subsequently identified proteins) that show a statistically significant (p &lt; 0.05) two-fold increase or decrease, appear or disappear from the control state. These are then excised, digested with trypsin and separated by high-pressure liquid chromatography coupled to a mass spectrometer (LC/MS) for protein identification (LC/MS/MS)5. This methodology (Figure 1) can be used on many tissues with little to no modification (liver, brain, heart etc.).

A straight-forward set of methods to isolate and determine the identity of the most abundant proteins expressed in skeletal muscle. About 800 spots are discerned on a two-dimensional gel from 10 mg muscle; this allows for the determination of gender-specific protein expression. These methods will give equivalent results in most tissues.

İskelet Kası Cinsiyet Proteomik Dimorfizm

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

Transtorasik Ekokardiyografi ile Pulmoner Arter Konstrüksiyon Fare Modeli sağ ventrikül yapı ve fonksiyonlarının değerlendirilmesi

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

Modifiye Bergström Tekniği İnsan İskelet Kası Biyopsi Prosedürleri

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Quantitative Magnetic Resonance Imaging of Skeletal Muscle Disease

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of living systems. Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using qMRI methods. The MRI acquisition protocol begins with localizer images (used to locate the position of the body and tissue of interest within the MRI system), quality control measurements of relevant magnetic field distributions, and structural imaging for general anatomical characterization. The qMRI portion of the protocol includes measurements of the longitudinal and transverse relaxation time constants (T1 and T2, respectively). Also acquired are diffusion-tensor MRI data, in which water diffusivity is measured and used to infer pathological processes such as edema. Quantitative magnetization transfer imaging is used to characterize the relative tissue content of macromolecular and free water protons. Lastly, fat-water MRI methods are used to characterize fibro-adipose tissue replacement of muscle. In addition to describing the data acquisition and analysis procedures, this paper also discusses the potential problems associated with these methods, the analysis and interpretation of the data, MRI safety, and strategies for artifact reduction and protocol optimization.

Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using non-invasive magnetic resonance imaging methods.

İskelet Kası Hastalığının kantitatif Manyetik Rezonans Görüntüleme

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

İnsan<em&gt; Vastus lateralis</em&gt; Weil-Blakesley Conchotome kullanılması İskelet Kası Biyopsi

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Induction and Assessment of Exertional Skeletal Muscle Damage in Humans

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery in humans. Herein we discuss the design of an eccentric exercise protocol to induce damage in the quadriceps muscles, marked by changes in strength, soreness, and plasma creatine kinase levels. This method is simple, ethical, and widely applicable since it is performed in human participants and eliminates the interspecies translation of the results. Subjects perform 300 maximal eccentric contractions of the knee extensor muscles at a speed of 120&#176;/sec on an isokinetic dynamometer. The extent of the damage is measurable using relatively non-invasive isokinetic and isometric measures of strength loss, soreness, and plasma creatine kinase levels over several days following the exercise. Therefore, its application can be directed to specific populations in an attempt to identify mechanisms for muscle adaptation and regeneration.

This article describes a safe and reliable method to induce and quantify exertional skeletal muscle damage in human subjects.

İndüksiyon ve İnsanlarda Egzersizde İskelet Kası Hasar değerlendirilmesi

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery ...

Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed in mice is high. Phenotypic characterization of these mouse models also requires the examination of cardiac function and morphology. Echocardiography and magnetic resonance imaging (MRI) are commonly used approaches to characterize cardiac function and morphology in mice. Echocardiographic and MRI equipment specialized for use in small rodents is&#160;expensive and requires a dedicated space. This protocol describes cardiac measurements in mice using a clinical echocardiographic system with a 15 MHz human vascular probe. Measurements are performed on anesthetized adult mice. At least three image sequences are recorded and analyzed for each animal in M-mode in the parasternal short-axis view. Afterwards, cardiac histological examination is performed, and cardiomyocyte diameters are determined on hematoxylin-eosin- or wheat germ agglutinin (WGA)-stained paraffin sections. Vessel density is determined morphometrically after Pecam-1 immunostaining. The protocol has been applied successfully to pharmacological studies and different genetic animal models under baseline conditions, as well as after experimental myocardial infarction by the permanent ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD). In our experience, echocardiographic investigation is limited to anesthetized animals and is feasible in adult mice weighing at least 25 g.

Echocardiographic examination is frequently used in mice. Expensive high-resolution ultrasound devices have been developed for this purpose. This protocol describes an affordable echocardiographic procedure combined with histological morphometric analyses to determine cardiac morphology.

Kardiyak Morfoloji Ekokardiyografik ve histolojik muayene fare

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed ...

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

Vücut kompozisyonu ve metabolik Caging Analizi yüksek yağ Fed farelerde

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel interventions have remained elusive. This is likely due, in part, to a reliance on preclinical prevention models investigating the effects of genetic manipulations or pharmacological treatments on atherosclerosis development rather than the established disease. Also, results of these studies are often confounding because of the use of superficial lesion analyses and a lack of characterization of lesion cell populations. To help overcome these translational hurdles, we propose an increased reliance on intervention models that employ investigation of changes in cellular composition at a single cell level by immunofluorescent staining and confocal microscopy. To this end, we describe a protocol for testing a putative therapeutic agent in a murine intervention model including a systematic approach for animal dissection, embedding, sectioning, staining, and quantification of brachiocephalic artery lesions. In addition, due to the phenotypic diversity of cells within late-stage atherosclerotic lesions, we describe the importance of using cell-specific, inducible lineage tracing mouse systems and how this can be leveraged for unbiased characterization of atherosclerotic lesion cell populations. Together, these strategies may assist vascular biologists to more accurately model therapeutic interventions and analyze atherosclerotic disease and will hopefully translate into a higher rate of success in clinical trials.

We propose a standardized protocol to characterize the cellular composition of late-stage murine atherosclerotic lesions including systematic methods of animal dissection, tissue embedding, sectioning, staining, and analysis of brachiocephalic arteries from atheroprone smooth muscle cell lineage tracing mice.

Kantitatif analiz düz kas hücre soy izleme farelerin gelişmiş aterosklerotik lezyonları içinde hücresel kompozisyon

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...